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Colonización citopatogenicidad y persistencia de Legionella spp. en agua sanitaria hospitalariaGarcía-Núñez, Marian 19 March 2009 (has links)
La prevalencia ambiental de Legionella spp. en centros hospitalarios y la incidencia real de legionelosis nosocomial son datos por lo general mal conocidos o muy variables de unas áreas a otras. El primer paso para la identificación de la infección nosocomial por Legionella es demostrar la colonización del sistema de distribución hospitalaria para poder establecer un nexo epidemiológico. La comprensión de la ecología y las características de Legionella, a nivel de colonización, tipado, persistencia y virulencia, son esenciales para entender esta problemática y establecer las medidas de prevención.En el primer objetivo, se estudió la prevalencia y variabilidad genotípica de Legionella en los sistemas de distribución de agua sanitaria y refrigeración de 20 hospitales de Cataluña. L. pneumophila se aisló en 17 de los 20 hospitales estudiados en un 37% (73/196) de las muestras analizadas. El nivel de contaminación osciló entre 200 y 74.250 ufc/L en puntos de consumo, y de 200 a 55.500 ufc/L en puntos centrales. El 39,7 % de las muestras positivas estaban colonizadas por L. pneumophila sg. 1 y el resto por L. pneumophila sg. 2-14. El tipado molecular mediante electroforesis en campo pulsante (PFGE) permitió distinguir 25 patrones PFGE diferentes que no estaban compartidos entre los diferentes hospitales. En 10 hospitales se identificó un único patrón, en 6 hospitales se coexistían 2 patrones PFGE y en un hospital coexistían 3 patrones PFGE. Los resultados de este estudio fueron fundamentales para establecer la necesidad de cultivos ambientales en los hospitales en los decretos sobre prevención de legionelosis posteriores en España y Cataluña (RD 865/2003 i D352/2004). También destacó por la necesidad de implementar técnicas de diagnóstico específicas de legionelosis en caso de neumonía de adquisición intrahospitalaria para conocer la incidencia real que tiene cada centro sanitario.En el segundo objetivo, se intenta responder a la pregunta de si la virulencia de las cepas de L. pneumophila presentes en los circuitos de agua sanitaria de un centro sanitario influye en la aparición de casos clínicos en el centro. En este estudio se presentan datos de citopatogenicidad (CEPD50%) de 22 aislados de Legionella con diferente patrón PFGE y se determina su relación con el serogrupo 1, el número de patrones PFGE coexistentes en le mimo sistema de agua sanitaria y con la declaración de casos de legionelosis nosocomial. Todos los aislados eran capaces de infectar y crecer intracelularmente en cultivos de macrófagos produciendo un efecto citopático significativo. Se establecieron 5 grupos citopatogénicos según sus valores CEPD50%. Los aislados de L. pneumophila sg. 1 tenían una citopatogenicidad media más elevada (p=0.003) que los aislados L. pneumophila no-sg. 1. Además, se observaron tendencias de los aislados pertenecientes a los grupos más citopatogénicos (1 a 3) a pertenecer a aquellos hospitales con más de un patrón en los sistemas de distribución de agua (60 % vs. 17 %) y los hospitales que declaraban casos de legionelosis nosocomial (36,3 % vs. 16.6%).En el tercer objetivo se investigó la epidemiología molecular de aislados clínicos y ambientales de Legionella procedentes de 7 hospitales durante los años 1989 a 2006. El número de patrones PFGE de los aislados ambientales oscilaba de 1 a 9 según el hospital. La persistencia genotípica se observó en el 71% de los hospitales, e incluso durante 17 años en algunos hospitales, y se pudo establecer una relación entre los patrones PFGE de origen clínico y los de origen ambiental. Los aislados asociados con legionelosis nosocomial se correspondían a los aislados ambientales que persistían durante más tiempo en los sistemas de distribución de agua sanitaria. / The environmental prevalence of Legionella spp. in hospitals and the incidence of the nosocomial legionelosis are unkonwn data, variable between different areas. Demonstration of water-system contamination is the first step in identifying nosocomial Legionella infection in a hospital. Understanding the ecology and characteristics of Legionella at level of colonization, typing, virulence and persistence are essential to understand this problem and to stablish prevention measures.The first objective was to study the prevalence and genotypic variability of Legionella in the water distribution systems and cooling towers from 20 hospitals in Catalonia. L. pneumophila was isolated in 73 out of 196 water samples analysed, representing 17 of the 20 hospitals included in the study. The degree of colonización ranged from 200 to 74.250 cfu/L in peripheral points and, from 200 to 55.500 cfu/L in central points. L. pneumophila sg. 1 was recovered in the 39.7 % of the positive samples. Twenty-five PFGE patterns were detected by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Each hospital had its own Legionella PFGE patterns, which was not shared with any other hospitals. A single PFGE pattern was identified in 10 hospitals, 2 PFGE patterns were observed in 6 hospitals, and 1 hospital exhibited 3 different PFGE patterns. The results of this study were important in establishing the need for environmental cultures in hospitals in the legislation on the prevention of legionellosis in Spain and Catalonia post (RD 865/2003 and RD352/2004). It was highlighted the need to implement specific techniques for diagnosis of legionellosis in case of nosocomial pneumonia to determine the actual incidence of each hospital.In the second objective, we attempt to answer the question of whether the virulence of L. pneumophila isolates in the water distribution systems in hospitals influences the number of PFGE patterns coexisting in the same hospital and occurrence of clinical cases in the centre. The cytopathogenicity of 22 L. pneumophila isolates with different PFGE pattern from 17 hospitals was determined by assessing the dose of bacteria necessary to produce 50% cytopathic effect (CPED50) in U937 human-derived macrophages. All isolates were able to infect and grow in macrophage-like cells (range log10 CPED50: 2.67-6.73 cfu/ml). Five groups were established and related to the serogroup, the number of PFGE patterns coexisting in the same hospital water distribution system, and the possible reporting of hospital-acquired Legionnaires' disease cases. L. pneumophila serogroup 1 isolates had the highest cytopathogenicity (p=0.003). Moreover, a trend to more cytopathogenic groups (groups 1-3) in hospitals with more than one PFGE pattern of L. pneumophila in the water distribution system (60% vs. 17%) and in hospitals reporting cases of hospital-acquired Legionnaires' disease (36.3% vs. 16 . 6%) was observed. We conclude that the cytopathogenicty of environmental L. pneumophila should be taken into account in evaluating the risk of a contaminated water reservoir in a hospital and hospital acquisition of Legionnaires' disease.In the third objective, the molecular epidemiology of clinical and environmental Legionella species isolates was studied in seven hospitals from 1989 to 2006. The number of environmental pulsed field gel electrophoresis (PFGE) patterns ranged from one to nine according to the hospital. Genomic PFGE pattern persistence was observed in 71% of the hospitals, even after 17 years in some hospitals, and the relationship between environmental and clinical isolates was established. The isolates associated with hospital-acquired Legionnaires' disease corresponded to the persistent environmental PFGE patterns of Legionella pneumophila in potable water supplies.
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Estudio de los factores de patogenicidad de Cryptococcus gattiiAlvarado Ramírez, Eidi V. 09 November 2008 (has links)
La patología producida por C.gattii, se asemeja en muchos casos a la producida por patógenos primarios, por el hecho de ser capaz de afectar a personas y/o animales inmunocompetentes. La criptococosis por esta especie, hasta ahora ha sido considerada una micosis de mayor prevalencia en países tropicales o sub-tropicales. Al ser considerado Cryptococcus gattii como una nueva especie separada filogenéticamente de C. neoformans y al actuar patológicamente como un patógeno primario infectando sujetos inmunocompetentes; sería posible demostrar diferenciasen sus factores de patogenicidad y en los patrones de sensibilidad con respecto al C. neoformans.ObjetivoEstudiar en Cryptococcus gattii y C. neoformans serotipos; las características fenotípicas y genotípicas de dos de los factores de patogenicidad considerados mas importantes y analizar los patrones de sensibilidad a los antifúngicos, utilizados para el tratamiento de la criptococosis y a los antifúngicos de última generación.Materiales y Métodos: Todas las cepas de Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii utilizadas en éste trabajo pertenecen o se encuentran almacenadas en la colección de URMIM, del Institut Municipal de Investigació Mèdica; ubicada en el edificio del Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona. Actualmente, las cepas también se encuentran en el laboratorio de Micología, Facultad de Medicina de la Universidad Miguel Hernández en Sant Joan d'Alacant, Alicante.Resultados y Conclusiones:Para poder estudiar las diferencias en la actividad ureasa de ambas especies, C. neoformans y C. gattii, se diseñó un método original y reproducible que permitió realizar la cuantificación de esa actividad enzimática. Utilizando ese método in vitro, se comprobó que los aislados de Cryptococcus neoformans presentaban estadísticamente mayor actividad ureasa que las de C. gattii, independientemente del origen de las cepas. Realizando una adaptación de la técnica utilizada par medir la actividad fenoloxidasa de Mycobacterium leprae, fue posible analizar cuantitativamente la producción de esta enzima a partir de cultivos puros de C. gattii aislados de cabras, comparándolos con cepas de referencia de la misma especie y de C. neoformans. Los resultados obtenidos demostraron que, en conjunto, C. gattii presentaba in vitro mayor actividad lacasa (fenoloxidasa) que C. neoformans. Las tres cepas con mayor producción de lacasa fueron los agentes de otros tantos brotes epidémicos de criptococosis en cabras, sugiriendo que esta enzima tiene un papel destacado en la virulencia de C. gattii. El estudio molecular de cepas seleccionadas de C. gattii demostró que el gen CNLAC1 de esta especies, presenta una región exclusiva en sus dos serotipos B y C. Se pudo demostrar in vitro que la región identificada en el gen CNLAC 1, es utilizada en la trascripción de la expresión de la enzima lacasa, específicamente en C. gattii serotipos B y C. Utilizando un método de microdilución estandarizado de referencia, las 80 cepas de C. neoformans y de C. gattii, evaluadas resultaron sensibles a los tres antifúngicos estudiados, fluconazol, voriconazol y posaconazol. Las CMI de los dos últimos triazoles fueron muy similares, no superando los 0,5 μg/mL. Se analizó la concentración mínima fungicida de estas cepas a los trestriazoles, comprobándose que resultados equivalentes a los de las CMI. A pesar de que el posaconazol presentó mayor actividad que los otros azoles, no se hallaron diferencias estadísticamente significativas en los resultados obtenidos entre las dos especies de Cryptococcus, ni entre sus serotipos. Se evaluó la utilidad del método Etest como alternativa al micrométodo, para determinar las CMI del posaconazol en C. gattii y C. neoformans, encontrándose un buen nivel de concordancia entre ambos métodos. La elevada sensibilidad de ambas especies de Cryptococcus al posaconazol, sugieren que este nuevo antifúngico puede ser una alternativa terapéutica en el tratamiento de la criptococosis. / Criptococcus gattii produced an infectious disease in immunosuprised mammals. In the last years this mycosis has been show a high prevalence in tropical and subtropical countries. This new specie, C. gattii, it is already philogenetic separated from C. neoformans and it is considered a real pathogen from human and animals. In this work, we have been study differences among virulence factors and in vitro susceptibility in both, C. neoformans and C. gattii.Objective: Demonstrate differences phenotypic and genotypic of laccase and urease enzymes between C. neoformans and C. gattii. Analyze in vitro susceptibility of fluconazole (FNZ), voriconazole (VNZ) and posaconazole (PNZ) of both species of Cryptococcus.Materials and methods: All strains used in this work were from a private collection of Laboratory of Infectious disease and Mycology (URMIM) in Barcelona. Results and Conclusions: The original method for determinate the urease activity in C. neoformans and C. gattii, showed high activity of urease in 76% of C. neoformans and 15.6% of C. gattii, by the other hand, the methodology for determinate laccase activity showed more laccase in C. gattii than C. neoformans. The molecular study of 55 strains of Cryptococcus showed a specific fragment of CNLAC1 gene, exclusive in C. gattii B and C serotypes, totally absent in C. neoformans. In this work, have been demonstrated the in vitro transcription of the fragment of 500bp in the laccase synthesis.Using a CLSI M27-A2 microdilution method for susceptibility of FNZ, VNZ and PNZ, 80 strains of Cryptococcus were study. The minimal inhibitory concentration (MIC) of VNZ and PNZ were < 0,5 μg/mL. The minimal fungicidal concentration (MFC) was determined. MFC and MIC were homogeneous in all three antifungics. Non statistical significance results were show between the two species or among the four serotypes.
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Development of the production process for a recombinant hormone and evaluation of its biological activityFont Ingles, Albert 20 July 2012 (has links)
Durant el curs d’aquest treball, es va dur a terme l’expressió de l’hormona Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG), també coneguda com equine Chorionic Gonadotropin (eCG) en el llevat metilotròfic Pichia pastoris. La PMSG consta de dues subunitats que varen ser expressades sota control del promotor AOX1. També es va desenvolupar l’upstream i el downstream del procés de producció per la PMSG recombinant (rPMSG).
En primer lloc es va desenvolupar un assaig in vitro amb cèl·lules de Leydig (MLTC-1) per tal de validar que la conformació de l’hormona recombinant fos la correcta.
En segon lloc, es van construir dos vectors d’expressió amb la Human Serum Albumin (HSA) fusionada a l’extrem C-terminal i N-terminal de la subunitat beta de la PMSG. A més, aquests vectors també contenien una còpia del gen de la subunitat alfa sota el control d’un promotor AOX1 independent. Els 12 punts d’O-glicosilació presents en la regió del C-terminal peptide (CTP) de la subunitat beta van ser eliminats amb l’objectiu de reduir la capacitat immunogènica que tenen els glicans de les proteïnes expressades en llevat. Eliminant tots els punts d’O-glicosilació la proteïna hagués vist reduït dràsticament el seu temps de vida mitja en sang, per aquesta raó es va decidir fusionar-la a la HSA amb l’objectiu de restablir aquesta mancança. Els primers cultius a petita escala van deixar entreveure que la fusió gènica de la HSA a l’extrem N-terminal de la subunitat beta presentava clars indicis de degradació per part de proteasas i per tant, aquest constructe va ser descartat. Per una altra banda, el constructe amb la HSA fusionada geneticament al C-terminal de la subunitat beta també presentava proteòlisi, però en aquest cas la degradació era parcial i una part de la proteïna es mantenia intacte.
Amb la finalitat de trobar les condicions de procés més adequades per tal reduir aquesta degradació parcial de la proteïna es varen realitzar una sèrie de cultius en batch comparant temperatures i pH diferents, determinant a la fi que a pH 6,5 i 22ºC la degradació intracel·lular de la proteïna recombinant es veia clarament reduïda. Ambdós paràmetres es van implementar en un cultiu en fed-batch millorant significativament la quantitat de proteïna no degradada tal com mostren els assajos in vitro. Malauradament, experiments de viabilitat cel·lular duts a terme amb citometria de flux i els anàlisi de les fraccions citosòliques de les cèl·lules deixaven entreveure que la degradació de la proteïna es donava durant la seva via de secreció i que per tant l’eliminació de la proteòlisi mitjançant la implementació d’alternatives en les condicions de procés no era possible.
Diferents assajos d’eficàcia de la hormona recombinant es varen dur a terme amb rates immadures demostrant la manca d’activitat LH i FSH de l’hormona recombinant. Sabent que una de les possibles causes per aquesta manca d’activitat podria ser la curta vida mitja de la proteïna en sang, es va dur a terme un estudi farmacocinètic en conills que donava suport a aquest extrem. / During the course of this work, the expression of the heterodimeric hormone (alpha and beta subunits) Pregnant Mare Serum (PMSG), also called equine Chorionic Gonadotropin (eCG), with each subunit under control of AOX1 promoter in the methylotrophic yeast Pichia pastoris, as well as the development of an upstream and downstream process was carried out.
First, the development of a cell-based bioassay as well as the cell culture techniques associated with the cell lines was reported. Sertoli cells (TM4) and granulose cells were rejected as a proper cell lines for the bioassay probably because of their poor stereidogenic activity. By contrast, Leydig cells (MLTC-1) resulted in a proper cell line to develop a feasible and reproducible in vitro bioassay to evaluate the hormone bioactivity.
Second, two expression vectors with Human Serum Albumin (HSA) fused to C-terminal and N-terminal of PMSG beta subunit, were constructed and subsequently transformed in P. pastoris. Furthermore, both contained a single copy of the PMSG alpha subunit expressed autonomosly. In both constructs, twelve O-glycosylation points located in the C-terminal peptide (CTP) of beta subunit were eliminated in order to reduce the immunogenic effect caused by the mannose-type glycosylation. With the aim to restore a probably reduction of the half-life caused by the CTP deletion, the HSA was genetically fused to beta subunit. Subsequent studies in shake flask revealed a specific cleavage around the linker zone in the construct with the HSA fused to the N-terminal of beta subunit, rejecting this construct as a candidate. On the other hand, construct with HSA fused in the C-terminal revealed also degradation of product, but still intact recombinant PMSG (rPMSG) was recovered and its in vitro activity demonstrated.
Thrid, High-cell density cultivation in fed-batch was properly implemented at pH 5.5 and 30ºC. Besides, an adequate two-step purification process was carried out, but a low yield of the entire secreted rPMSG was recovered. Despite this inconvenience, the rPMSG was purified and positively assayed in vitro with MLTC-1 cells. In order to reduce the proteolysis several process approaches were implemented; best working pH to reduce the extracellular degradation of the rPMSG was found at pH 6.5, after 72 hours incubation of purified rPMSG at pH 6,5 almost 66% of the protein remained integral The pH 5.5 and pH 6,5 were compared in batch cultivations at 30ºC, and concluding that intracellularly at pH 6,5 the state of rPMSG improved significantly. Similarly, batch cultivations at 30ºC and 22ºC were performed and clarified that reduced temperature decreased substantially the protease effect intracellularly. Both parameters were applied in fed-batch cultivations with better yields of non-degraded rPMSG as showed in vitro analysis. Unfortunately, cell viability experiments by flow cytometry and cytosolic fraction analysis by western blot pointed out that degradation mainly occurred during the secretion pathway, thus disqualifying any process approach applied to reduce the degradation.
Fourth, in vivo assays with immature rats revealed that the purified rPSMG had not FSH and LH activity. Hence, an study of the recombinant hormone half-life was carried out in rabbits and determined that the extremely rapid clearance of protein from the blood-stream could be responsible for deficiencies in the activity.
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Estudio del ecosistema bacteriano del tracto digestivo del cerdo mediante técnicas molecularesRoca Canudas, Mercè 17 September 2008 (has links)
En los últimos años, para mejorar el estatus sanitario de las granjas, se han realizado muchos avances en la producción porcina. Sin embargo, actualmente todavía se observan problemas digestivos sobretodo durante la fase del destete de los lechones y en la entrada en la fase del engorde. Además, la prohibición del uso de los antibióticos como promotores de crecimiento ha hecho que incrementara el interés por encontrar alternativas que puedan ayudarnos a controlar esta problemática digestiva. Este trabajo tiene como objetivo principal estudiar, mediante diferentes técnicas de biología molecular, la composición de la microbiota del tracto digestivo de los cerdos y los cambios que en ella se producen en diferentes condiciones. En el primer capítulo, se estudiaron las poblaciones bacterianas del tracto gastrointestinal en cerdos recién destetados y alimentados con piensos suplementados con diferentes aditivos (un acidificante, un extracto de plantas y un antibiótico), mediante la utilización de la técnica del polimorfismo de la longitud de los diferentes fragmentos de restricción (PCR-RFLP). Mediante la utilización de esta técnica, se detectaron cambios en la complejidad de las poblaciones bacterianas a lo largo del tracto digestivo, incrementando de forma significativa de los tramos proximales a los tramos más distales. A partir de estos resultados, se sugirió que para estudios de diversidad microbiana del tracto digestivo de los cerdos, el análisis del yeyuno/íleon y del ciego/colon serían muestras suficientes para un estudio representativo. Además se observó que mediante la incorporación del butirato de sodio, se incrementaba la diversidad bacteriana de los tramos distales del tracto digestivo, mientras que la incorporación del extracto de plantas la disminuía.En el segundo capítulo, se estudió el efecto de diferentes tipos de fibra sobre la microbiota intestinal, en este caso utilizando diferentes técnicas moleculares (PCR-RFLP, PCR cuantitativa y FISH). Además, también se estudió la adaptación de la misma a lo largo del tiempo. En este estudió, se observó que el tipo de fibra modificaba la composición de la microbiota intestinal y que el tiempo de adaptación de la microbiota del tracto digestivo era variable en función del tipo de sustrato utilizado. Así, mientras que la introducción del maíz molturado grosero indujo un incremento súbito y transitorio de la diversidad microbiana en los tramos del tracto digestivo más proximales, la introducción de salvado de trigo provocó una disminución tardía de la diversidad bacteriana en tramos digestivos más distales.Finalmente, en el tercer capítulo se analizó la dinámica de infección de los cerdos con dos cepas diferentes de Salmonella Typhimurium, estudiando también el efecto de la infección sobre la diversidad microbiana del tracto digestivo. A pesar de que la sintomatología fue muy leve, globalmente se demostró que los animales infectados con una cepa resistente a múltiples antibióticos presentaban una mayor alteración de los parámetros productivos y de los síntomas clínicos que los animales infectados con una cepa sensible a diferentes antibióticos. La infección no modificó el grado de diversidad microbiana de las heces ni del contenido del ciego de ninguno de los animales. / In the last years, many new strategies have been implemented in the porcine production to improve the sanitary status of farms. However, digestive problems are still observed mainly during the weaning period and at the starting of the growing phase. In addition, the prohibition of the use of antibiotics as growth promoters has increased the interest to find alternatives that can help us to control enteric diseases. The present work aims to study, by different molecular techniques, the composition of the microbiota of the porcine digestive tract and the changes that take place in it under different conditions. In the first trial, the bacterial population of the gastrointestinal tract was studied in recently weaned pigs, fed with supplemented diets with different additives (an organic acid, a plant extract mixture and an antibiotic), by using the polymerase chain reaction and the restriction fragment length polymorphism technique (PCR-RFLP). By using this technique, changes in the complexity of the bacterial population along the digestive tract were detected, increasing in a significant way from the proximal to the distal gastrointestinal segments. With these results, it was suggested that, for futures studies of microbial diversity of the porcine digestive tract, the analysis of the jejunum or ileum samples and the caecum or colon samples would be enough for a representative study. Moreover, it was also observed that after sodium butyrate incorporation into the diet, the bacterial diversity of the distal intestinal segments was increased, while the incorporation of a plant extract mixture reduced the intestinal bacterial diversity. In the second trial, the effect of different types of fibre on the gastrointestinal microbiota was studied using different molecular techniques (PCR-RFLP, quantitative PCR and FISH). The adaptation of the intestinal microbiota along the time was also studied. In this study, it was observed that the type of the fibre modified the composition of the gastrointestinal microbiota and the time of adaptation was variable depending on the substrate used. In this way, while the introduction of coarse grounded corn induced a sudden and transitory increment of the microbial diversity in the proximal gastrointestinal segments, the introduction of wheat bran caused a late decrease of the bacterial diversity in more distal gastrointestinal segments. Finally, in the third trial, the dynamics of the Salmonella Typhimurium infection in pigs was analyzed by an experimental inoculation with two different Salmonella strains. Moreover, the effect of the infection on the microbial diversity of the digestive tract was also assessed. Although the clinical signs were mild, it was demonstrated that the animals infected with the strain resistant to multiple antibiotics presented a stronger alteration of the productive parameters and more relevant clinical symptoms that the animals infected with the strain sensitive to different antibiotics. Infection with both strains did not modify the grade of microbial diversity of faecal and caecum digestive contents of none of the animals.
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Caracterización molecular de los genes blaAmpC cromosómicos y adquiridos en aislados clínicos de Escherichia coli en el área de BarcelonaAlonso Louro, Noemí 21 November 2014 (has links)
Escherichia coli presenta un gen blaAmpC cromosómico que se expresa de forma constitutiva a bajo nivel debido a la presencia de un promotor débil y un atenuador. En estas condiciones no confiere resistencia a betalactámicos. Sin embargo, E. coli puede incrementar la expresión de este gen debido a mutaciones en su región promotora/atenuadora (AmpCc) o adquirir genes blaAmpC incluyendo CMY, DHA, ACC, FOX, MOX, ACT, MIR, LAT y CFE (AmpCa), mecanismos que confieren resistencia a penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas y aztreonam. A diferencia de lo que sucede con las betalactamasas de espectro extendido (BLEE), la detección fenotípica de betalactamasas AmpC es difícil debido a la escasez de métodos estandarizados. Los estudios sobre la epidemiología y las características clínicas asociadas con infecciones producidas por E. coli productora de AmpC son limitados. Además, en las cepas productoras de AmpC es frecuente la corresistencia a otras familias de antimicrobianos, lo que convierte el tratamiento de estas infecciones en un reto para el clínico. Se realizó un estudio multicéntrico con el Consorci Sanitari de Terrassa, el Hospital Universitario Mútua de Terrassa y el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona, en el que se analizaron los aislados de E.coli con patrón fenotípico compatible con la producción de AmpC entre junio de 2010 y noviembre de 2011. El objetivo de este estudio fue conocer la prevalencia de aislados productores de AmpC, identificar los genes blaAmpC adquiridos, así como las mutaciones involucradas en la hiperproducción del gen blaAmpC cromosómico, además de conocer la estructura de la población y sus resistencias asociadas. De un total de 240 cepas analizadas, el 75% eran portadoras de AmpCa, siendo CMY-2 el enzima mayoritario, seguido de DHA-1. El 25% restante resultaron ser hiperproductoras de su AmpCc, cuyo principal mecanismo fue la presencia de mutaciones que daban lugar a un promotor alternativo desplazado. Ello provocaba un incremento medio de la expresión del gen ampC de 72,5. También se encontraron otros dos patrones de mutaciones que originaban modificaciones en la región espaciadora del promotor o alteraciones en el atenuador, con incrementos medios de la expresión de 19,9 y 5,8, respectivamente. El análisis de los grupos filogenéticos permitió conocer la estructura de la población estudiada. Se observó que un 60% de los aislados con AmpCa pertenecían a los grupos filogenéticos B2, D, E o F. Un 82% de los aislados hiperproductores con un promotor desplazado pertenecían a los grupos A, B1 o C. Todos los aislados con la región atenuadora modificada y un 67% de los aislados con la región espaciadora modificada pertenecían a los grupos B2, D, E o F. De la misma manera que ocurre con las cepas portadoras de BLEE, los plásmidos que vehiculan los genes blaAmpC suelen contener otros genes que confieren resistencia a otras familias de antibióticos. El estudio de la sensibilidad mostró tasas de resistencia a ácido nalidíxico, estreptomicina, ciprofloxacino y cotrimoxazol de 79%, 62%, 57,5% y 44%, respectivamente. Se observó que el 30% y 11% de los aislados con AmpCa y AmpCc, respectivamente, eran portadores de determinantes PMQR (plasmid-mediated quinolone resistance). Entre los PMQR detectados en aislados con AmpCa el mayoritario fue qnrB4, siempre en cepas portadoras de blaDHA-1, seguido de aac(6’)-Ib-cr. En aislados hiperproductores de AmpCc el PMQR mayoritario fue aac(6’)-Ib-cr. El continuo aumento de la prevalencia de estos enzimas se debe principalmente a la diseminación de los genes blaAmpC por transferencia horizontal. En los plásmidos analizados IncI1 e IncF fueron los replicones mayoritarios asociados a blaCMY-2 y blaDHA-1, respectivamente. El análisis de la estructura poblacional de los plásmidos mediante pMLST determinó que existía una gran variabilidad genética entre ellos. IncI1/ST12 fue la secuencia tipo mayoritaria. También se encontraron IncI1/ST26, IncI1/ST55, IncI1/ST94 e IncI1/ST134, siendo este último descrito por primera vez en este estudio. De los plásmidos incluidos en el grupo IncF, cada uno correspondía a una secuencia tipo diferente. / Escherichia coli has a chromosomal blaAmpC gene that is expressed constitutively at low level due to the presence of a weak promoter and an attenuator. Under these conditions, this gene does not confer resistance to beta-lactams. However, this chromosomal gene may be overproduced due to mutations in the promoter/attenuator region (cAmpC). Additionally, E. coli may also acquire blaAmpC genes (aAmpC), namely CMY, DHA, ACC, FOX, MOX, ACT, MIR, LAT and CFE. Both mechanisms (cAmpC and aAmpC) confer resistance to penicillins, cephalosporins, cephamycins and aztreonam. In contrast to the range of phenotypic methods available for extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs), no standardized methods are available to detect AmpC beta-lactamases. There is a paucity of reports on the epidemiology and clinical features associated with infections caused by AmpC-producing E. coli. Furthermore, these isolates frequently present co-resistance to other families of antibiotics, converting treatment of these infections into a clinical challenge. A multicentric study was performed to analyse E. coli isolates with a resistance pattern compatible with the production of AmpC. Isolates were obtained from Consorci Sanitari de Terrassa, Hospital Universitario Mútua de Terrassa and Hospital de la Santa Creu i Sant Pau (Barcelona, Spain) between June 2010 and November 2011. The aims of this study were: 1) to determine the prevalence of AmpC-producing E. coli isolates; 2), to identify acquired blaAmpC genes and the mutations involved in the overproduction of the chromosomal blaAmpC gene; and 3) to describe the population structure and patterns of resistance. A total of 240 strains were analysed. Of these, 75% were aAmpC-carriers and the remaining were cAmpC-overproducers. CMY-2 was the predominant enzyme, followed by DHA-1. Most cAmpC-overproducers had mutations that yielded an alternate displaced promoter and caused an increase of blaAmpC expression (average increase of expression 72.5). Two other different mutational patterns were found: a modified spacer region in the promoter and a modified attenuator (the average increase of expression was 19.9 and 5.8, respectively).
Analysis of the phylogenetic groups allowed to gain knowledge of the population structure. Of all aAmpC isolates, 60% belonged to the phylogenetic groups B2, D, E and F. Among cAmpC overproducers, 82% of the isolates bearing a displaced promoter belonged to groups A, B1 and C. All the isolates with modified attenuator regions and 67% of the isolates with modified spacer regions belonged to groups B2, D, E and F.
As it happens in ESBL-carrying strains, the plasmids carrying blaAmpC genes may also carry other genes, conferring resistance to other families of antibiotics. In the present study, the percentage of resistance to nalidixic acid, streptomycin, ciprofloxacin and trimethoprim-sulfamethoxazole was 79%, 62%, 57.5% and 44%, respectively. Plasmid-mediated quinolone resistance determinants (PMQR) were detected in 30% of the aAmpC isolates and 11% of the cAmpC isolates. Among aAmpC isolates, the most predominant PMQR was qnrB4 (always in blaDHA-1 carriers), followed by aac(6’)-Ib-cr. Among cAmpC isolates, the predominant PMQR was aac(6’)-Ib-cr.
The increase in the prevalence of these enzymes is due to the spread of genes through horizontal transfer. The analysis of plasmids showed that IncI1 and IncF were the main replicons involved. IncI1 and IncF were related to blaCMY-2 and blaDHA-1, respectively. The pMLST analysis of plasmids revealed a large genetic variability. IncI1/ST12 was the predominant sequence type. Other sequence types belonging to the same incompatibility group were IncI1/ST26, IncI1/ST55, IncI1/ST94 and IncI1/ST134, the latter being first described in this study. Regarding IncF, each plasmid corresponded to a different sequence type.
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Two-dimensional engineering of molecular nanoparticles for biological applicationsTatkiewicz, Witold Ireneusz 16 January 2015 (has links)
El trabajo realizado en esta tesis se ha centrado en dos sistemas de nanopartículas moleculares que tienen un uso potencial en el campo de la nanomedicina: i) vesículas lipídicas – entidades supramoleculares que se proponen como sistemas de liberación de fármacos y ii) cuerpos de inclusión (Inclusion Bodies, IBs) – nanopartículas formadas por agregados proteicos.
La primiera parte del trabajo se ha centrado en el estudio comparativo de sistemas vesiculares preparados por i) diferentes metodologías así como ii) diferentes composiciones. Los métodos comparados son DELOS-susp, un método de una sola etapa basado en fluidos comprimidos y procesos convencionales que constan de varias etapas, como hidratación de película delgada (thin film hydration, TFH) y tratamiento con ultrasonidos seguido de extrusión (ultrasound, US). La influencia de la estructura interna se ha investigado con vesículas con diferentes composiciones mixtas: CTAB-Colesterol y DOPC-Colesterol. Para este estudio hemos utilizado métodos que monitorizan la interacción de nanomaterials con superficies como la resonancia de plasmones superficiales (surface plasmon resonance, SPR) y la microbalanza de cristal de cuarzo con disipación (quartz crystal microbalance with dissipation, QCM-D). A partir del análisis de datos hemos demostrado que todos los sistemas investigados forman monocapas de vesículas enteras tras la interacción con superficies de oro. Ha sido posible calcular la absorción de masa, espesor, densidad y propiedades mecánicas de los diferentes sistemas vesiculares estudiados. Hemos concluido, que la influencia del método de preparación es muy. Es decir, en este tipo de sistemas, la arquitectura interna, una vez lograda, es la que determina las propiedades mecánicas de las entidades supramoleculares. Por otro lado, se ha encontrado una influencia de la composición interna de las vesículas en sus propiedades mecánicas. Así, las vesículas formadas por colesterol y CTAB han demostrado ser más rígidas que las formadas por colesterol y DOPC.
Por otro lado, esta tesis se ha centrado en el uso de IBs para la funcionalización de superficies con diferentes patrones utilizando técnicas de litografía blanda. Posteriormente, se han caracterizado y evaluado las propiedades de estas superficies decoradas con IBs como soportes para el cultivo y guiaje de células.
En el marco de esta tesis se han conseguido preparar con éxito patrones geométricos de IBs de alta resolución. Un análisis estadístico de los datos obtenidos a partir de imágenes de microscopía óptica y confocal ha permitido sacar demostrar, que la orientación, la morfología, y el posicionamiento de las células dependen de la geometría de los patrones.
La siguiente etapa de la tesis estuvo centrada en la desarrollo de un dispositivo que permitiera la deposición de gradientes de IBs en superficies a partir de suspensiones coloidales. La técnica está basada en el fenómeno ampliamente conocido del “efecto de la gota de café”. Así, un dispositivo ha sido diseñado, construido, calibrado y utilizado con éxito para preparar sustratos funcionalizados con patrones, muy fáciles de modificar y con bajo coste. Con este dispositivo se ha propuesto e implementado un protocolo de la deposición de gradientes de nanopartículas. Los gradientes obtenidos se han caracterizado en cada caso confirmando la presencia de cambios lineales de concentración de IB sobre grandes áreas (ca 500 micras) tal y como se necesita para realizar estudios de motilidad celular.
En la última parte de la tesis hemos utilizado los gradientes de IBs para estudiar la motilidad celular. El método de deposición permitió preparación de sustrato complejo con más de 80 diferentes entornos para el cultivo celular. Como conclusión general de esta parte podemos confirmar que existe un control claro de la motilidad celular provocada por los patrones de gradientes de IBs ingeniados.
En general, con el trabajo realizado hemos demostrado que los IBs pueden considerarse una nueva herramienta muy interesante y útil para el guiaje celular, lo cual puede tener implicaciones muy interesantes en el campo de la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos. / This Thesis is focused on two systems of molecular nanoparticles that have a prospective use in nanomedicine. These systems are: (i) lipidic vesicles – supramolecular entities that are already used as drug delivery systems and (ii) Inclusion Bodies (IBs) - proteic nanoaggregates, that are emerging as a new tool in the light of tissue engineering
The first part of this work is focused on the comparison of a vesicular system prepared by DELOS ‐ susp, a compressed fluid‐based single-step method previously developed in our group, and conventional multi‐step processes that are usually employed for vesicle production, like thin film hydratation or sonication followed by extrusion. We have compared also two different vesicle compositions: one system is based on DOPC phospholipid and cholesterol (liposome) and the other contain a quaternary ammonia amphiphile, CTAB, and cholesterol (quatsomes). To study the structural characteristics of both systems we have used the combination of two non-labelling methods: Surface Plasmon Resonance (SPR) and Quartz Crystal Microbalance with Dissipation (QCM-D) in order to obtain complementary data. We conclude that both investigated vesicular systems form layers of vesicles when interacting with gold surfaces. We have calculated the mass uptake, thickness, density and mechanical properties of the studied vesicular systems. We conclude, that the influence of the preparation method is negligible in the case of quatsomes. That is, the internal architecture, once achieved, determines the mechanical properties of these supramolecular entities. On the other hand, vesicles formed by quaternary salts and cholesterol have demonstrated to be more rigid than the liposomes based on phospholipid and cholesterol.
The work developed in following three Chapters has been focused on the use IBs for surface engineering. In this part we have characterized and evaluated IBs decorated surfaces as supports for cell cultivation and guidance.
The second Chapter is centred on the formation of two-dimensional microscale patterns of IBs using a soft lithography technique and evaluation of cell behaviour when cultivated on them. We have successfully prepared high resolution geometrical IBs patterns and cultivated cell on them. Basing on a deep, statistical analysis of data derived from optical and confocal microscopy images we derived conclusions about the influence of the IBs pattern geometry on cell´s behaviour. The orientation, morphology and positioning of cells clearly depends on the geometry of IBs patterns proving the usefulness of IBs for cell guidance. Moreover, the synergy between biological activity and topographical stimuli of cells by IBs has been confirmed.
In the third Chapter, in order to study cell motility induced by IBs, we have focused on the design and engineering of a device allowing deposition of surface-bound IBs gradients from colloidal suspensions. The developed technique is based on the widely known coffee drop effect. A deposition device was constructed, calibrated and successfully used to prepare substrates with the desired patterns, which can be obtained in a fast (up to 1 mm per 1 min) and cost-effective manner. Also, a robust protocol for gradient deposition was proposed and implemented. The obtained gradients were characterized, confirming the presence of linear changes of IBs concentration over broad areas (c.a. 500 μm) as needed to perform cell motility studies.
The last Chapter describes the use of the IBs gradients to study cell motility. A complex substrate with 80 different zones for high-throughput cell culture study was successfully produced. Individual cell movement assay were carried out using confocal microscopy time-lapse acquisition. Cell movement descriptors such as average travelled distance, directionality, etc. were quantified, enabling us to investigate in detail how factors such as the gradient slope or the concentration of IBs influence cell motility. As an overall conclusion of this part we can confirm the control over cell motility by the IBs gradient patterns.
In general we have proved that IBs as well as the different two-dimensional engineering methods used are interesting and useful approaches with a prospective use in the control of cell guidance as well as a promising tools in regenerative medicine and tissue engineering.
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Funcionalitat dels micobacteris ambientals de creixement ràpid com a agents antitumoralsSecanella Fandos, Silvia P. 19 October 2012 (has links)
El càncer de bufeta és la patologia maligna més comuna del tracte urinari
Aproximadament, el 75-85% dels pacients amb càncer de bufeta presenten malaltia
confinada a la mucosa quan es diagnostiquen. A més, després de la resecció
transuretral del tumor, existeix un 30-80% de casos de recurrència local i un 1-45% de
casos en que el tumor progressa a estadis més agressius. Els pacients, aleshores,
requereixen d’un tractament amb Mycobacterium bovis BCG per prevenir les
recurrències i la progressió del tumor, a més d’un seguiment continu al llarg de la seva
vida. Aquesta teràpia intravesical amb BCG viu, s’utilitza des de fa 36 anys.
Per una banda, actualment es comercialitzen i s’administren diferents soques
de BCG tant com a vacuna front la tuberculosi com per al tractament del càncer de
bufeta superficial. Les diferents soques varien en el seu contingut antigènic. En el
context de la tuberculosi, s’han realitzat diversos estudis que relacionen les diferències
antigèniques existents entre les soques de BCG amb la inducció de respostes
immunitàries diferents. En el cas del tractament del càncer de bufeta es desconeix si
les diferents soques de BCG tenen diferent capacitat antitumoral. Per a aquest motiu,
en aquest treball s’ha comparat l’activitat antitumoral directa de diferents soques de
BCG en cèl·lules tumorals de bufeta. Els resultats obtinguts indiquen que d’entre totes
les soques de BCG analitzades, Connaught i Russian són més eficaces que la resta.
No s’ha pogut relacionar aquesta activitat antitumoral amb la presència d’un patró
antigènic concret.
Per una altra banda, tot i els beneficis de la immunoteràpia amb BCG pel
tractament del càncer de bufeta superficial, té limitacions i ocasiona problemes que
comprometen el seu ús. Aquests problemes poden arribar a ser greus presentant-se,
inclús, casos de sèpsia per BCG. Degut a aquests inconvenients és necessari trobar
nous agents més eficaços i segurs que BCG viu. En aquest treball s’ha trobat un
micobacteri ambiental no patogen i de creixement ràpid, Mycobacterium spp., capaç
de presentar una capacitat antitumoral directa similar a BCG, i inclús superior en
cèl·lules tumorals de grau 1 de diferenciació. M. spp. s’ha mostrat a més capaç
d’activar una resposta immune induint la producció de citocines proimflamatòries i
induint l’expressió de marcadors d’activació. S’ha demostrat que les cèl·lules activades
per M. spp tenen activitat citotòxica front les cèl·lules tumorals de bufeta. A més, s’ha
estudiat el mecanisme mitjançant el qual exerceix aquesta activitat citostàtica directa, i
s’ha mostrat la implicació dels TLR en la inducció de l’activitat citotòxica indirecta front les cèl·lules tumorals. Aquesta activitat antitumoral directa i indirecta es manté quan M.
spp. és mort.
Donat els resultats obtinguts en aquest treball, M. spp. es presenta com una
possible alternativa a BCG en el tractament del càncer de bufeta superficial. / Bladder cancer is the most common malignant disease of the urinary tract.
Approximately, between 75 and 85% of patients with bladder cancer have disease
confined to the mucosa when diagnosed. In addition, after transurethral resection of the
tumor, there is a 30-80% of local recurrence cases and a 1-45% of cases in which the
tumor progresses to more aggressive stages. Then, patients require treatment with
Mycobacterium bovis BCG in order to prevent recurrences and tumor progression.
Moreover, they need a continuous supervision throughout their lives. Intravesical
therapy with live BCG has been used for 36 years.
On one hand, different BCG substrains, both for tuberculosis vaccination and
for the treatment of superficial bladder cancer, are currently in the marked being used
around the world. These substrains vary in their antigenic content. In the tuberculosis
context, there are several studies that relate the antigenic differences among BCG
substrains and the immune responses induced. For the treatment of bladder cancer is
not known whether these different BCG substrains have different antitumor capacity.
For this reason, this work has compared the direct antitumor activity of different BCG
substrains in bladder cancer cells. Our results indicate that, among all the BCG
substrains evaluated, Connaught and Russian are the most efficacious in inhibiting
tumoral growth and to induce cytokine’s production. This antitumor ability does not
match with a specific antigenic pattern.
On the other hand, despite of the benefits of BCG immunotherapy in the
treatment of superficial bladder cancer, it has some limitations and causes some
problems in patients that compromise its use. These problems may be serious
originating even cases of BCG sepsis. Because of these drawbacks it is necessary to
find new more efficacious and safer agents than live BCG. In this study we have found
an environmental non-pathogenic and rapidly growing mycobacterium, Mycobacterium
spp., with a direct antitumor capacity similar to BCG, and even higher than BCG in
grade 1 bladder cancer cells. Furthermore, M. spp. showed to be able to activate an
immune response by inducing pro-inflammatory cytokine production and inducing the
expression of activation markers. We showed that M. spp.-activated immune cells have
cytotoxic activity against bladder tumor cells. In addition, the mechanism by which it
exerts this direct cytotoxic activity and the role of TLR on M. spp.-induced cytotoxic
activity against bladder cancer cells has been studied. Finally, it has been
demonstrated that the direct and indirect antitumor activity remains using dead M. spp.
From the results obtained in this work, M. spp. is suggested as an alternative to
BCG in the treatment of superficial bladder cancer.
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Insights on the interaction between Haemophilus parasuis and alveolar macrophagesCosta Hurtado, Mar 26 March 2012 (has links)
Haemophilus parasuis és un bacteri de la família Pasteurellaceae. És un
colonitzador del tracte respiratori superior en animals sans i l’agent etiològic de la
malaltia de Glässer. Les soques de H. parasuis presenten diferències en virulència,
que han estat observades tant en infeccions in vivo com en proves de fagocitosi in
vitro amb macròfags alveolars porcins (PAMs).
La patogenicitat de les soques ha estat correlacionada amb la resistència a la
fagocitosi, però els factors de virulència implicats son desconeguts. Per la
identificació dels factors implicats en la resistència a la fagocitosi, es va generar
una llibreria genòmica de la soca virulenta de referència Nagasaki. De la incubació
d’aquesta llibreria amb PAMs, es varen seleccionar dos clons amb gens codificant
dos autotransportadors trimètrics associats a virulència (VtaA), vtaA8 i vtaA9.
Mitjançant citometria de flux, es va aprofundir en el paper d’aquestes molècules en
ambdós clons, els quals van mostrar una menor interacció amb els PAMs. La
producció d’anticossos monoclonals (mAb) contra les proteïnes recombinants
VtaA8 i VtaA9 van permetre determinar‐ne la localització a la superfície dels clons.
Els mateixos mAb detectaren aquestes proteïnes a la superfície de la soca resistent
a la fagocitosi PC4‐6P, però no a la soca avirulenta F9. Addicionalment, estudis amb
microscòpia de fluorescència varen determinar l’efecte de VtaA8 i VtaA9 en el
transport a la ruta endocítica, tot detectant un retard en la co‐localització dels
clons vtaA8 i vtaA9 amb compartiments àcids. Aquests resultats són compatibles
amb una inhibició parcial del transport del bacteri a través de la degradació per
fagosoma. Finalment, els anticossos contra un epítop comú a VtaA8 i VtaA9 van ser
opsonitzadors i varen promoure la internalització de la soca resistent a la
fagocitosi PC4‐6 pels PAMs. Globalment, aquests resultats indiquen que VtaA8 i
VtaA9 són proteïnes de superfície i juguen un paper en la resistència a la fagocitosi.
La infecció de garrins privats de calostre nascuts de part natural amb soques de H.
parasuis va mostrar diferències en el grau de virulència. Es varen emprar quatre
soques de H. parasuis: les soques de referència virulenta Nagasaki i avirulenta
SW114, la soca de camp IT29205 (obtinguda d’una lesió i virulenta en una infecció
anterior) i la soca F9 (aïllada de la cavitat nasal d’un garrí sa). Els animals es varen
inocular per via intranasal amb 107‐108 CFU per individu. Dos animals no infectats s’utilitzaren com a controls. A diferents temps (1, 2, 4 i 7 dies post‐infecció [dpi]),
dos animals de cada grup es varen eutanasiar, i es varen prendre mostres de sèrum
i del fluid bronquialveolar. Mitjançant citometria de flux, es varen analitzar els
macròfags alveolars avaluant l’expressió dels marcadors de superfície CD163,
CD172a, SLAI, SLAII, sialoadhesina, CD14 i SWC8. En funció de la virulència de la
soca es varen poder observar canvis en el fenotip dels macròfags. A la fase inicial
de la infecció (1 dpi), les soques no virulentes SW114 i F9 varen induir major
expressió de CD163, sialoadhesina, SLAII i CD172a que les soques virulentes
Nagasaki i IT29205. A 2 dpi, la situació canvià diametralment. Les soques
virulentes generaren una forta inducció de l’expressió de CD172a, CD163 i
sialoadhesina, seguida a continuació d’un sobtat increment d’IL‐8 i CD163 soluble
a 3‐4 dpi. L’activació primerenca dels macròfags per part de les soques virulentes
podria ser crítica per originar malaltia.
L’associació entre el retard produït per les proteïnes VtaA8 i VtaA9 i la ruta
endocítica, així com el retard en l’activació del macròfag, requereix estudis
ulteriors. / Haemophilus parasuis, a member of the family Pasteurellaceae, is a colonizer of the
upper respiratory tract of healthy pigs and the etiological agent of Glässer’s
disease. Differences in virulence among H. parasuis strains have been widely
observed by different tests, including in vivo infections and in vitro phagocytosis
assays with porcine alveolar macrophages (PAMs).
The pathogenicity of the strains has been correlated with resistance to
phagocytosis, but the bacterial factors implicated are not known. To identify
virulence factors involved in phagocytosis resistance, a genomic library of the
virulent reference strain Nagasaki was produced and exposed to PAMs. After
incubation with PAMs, two clones carrying two different virulent‐associated
trimeric autotransporters (VtaA), vtaA8 and vtaA9, were selected. The role of these
molecules was further investigated and a reduction in the interaction of the two
clones with the macrophages was detected by flow cytometry. Monoclonal
antibodies (mAb) produced against the recombinant VtaA8 and VtaA9 proteins
demonstrated the presence of these proteins on the bacterial surface of the
corresponding clone. The same mAb also detected the proteins on the surface of H.
parasuis phagocytosis‐resistant strain PC4‐6P, but not on the non‐virulent strain
F9. The effect of VtaA8 and VtaA9 in the trafficking of the bacteria through the
endocytic pathway was examined by fluorescence microscopy and a delay was
detected in the localization of the vtaA8 and vtaA9 clones in acidic compartments.
Although VtaA8 and VtaA9 delayed phagocytosis, were not sufficient to completely
inhibit the process. These results are compatible with a partial inhibition of the
routing of the bacteria via the degradative phagosome. Finally, antibodies against a
common epitope in VtaA8 and VtaA9 were opsonic and promoted phagocytosis of
the phagocytosis‐resistant strain PC4‐6P by PAMs. Taken together, these results
indicate that VtaA8 and VtaA9 are surface proteins that play a role in phagocytosis
resistance of H. parasuis.
Infection of snatch farrowed, colostrum‐deprived piglets with different strains of
H. parasuis demonstrated differences in the degree of virulence. We used four
strains of H. parasuis: reference virulent strain Nagasaki, reference non‐virulent
strain SW114, and field strains IT29205 (from systemic lesion and virulent in a previous challenge) and F9 (from nasal cavity of a healthy piglet). The infection
was performed intranasally with 107‐108 CFU per animal. Two non‐infected
animals served as controls. At different times after infection (1, 2, 4 and 7 days
post‐infection [dpi]), two animals of each group were euthanized and
bronchoalveolar lavages and sera were collected. Alveolar macrophages were
analyzed for the expression of surface markers CD163, CD172a, SLAI, SLAII,
sialoadhesin, CD14 and SWC8 by flow cytometry. The phenotype of macrophages
changed along with the infection depending on the virulence of the strain. At early
time‐points (1 dpi), non‐virulent strains SW114 and F9 induced higher expression
of CD163, sialoadhesin, SLAII and CD172a than virulent strains Nagasaki and
IT29205. At 2 dpi, the situation switched to a strong induction of expression of
CD172a, CD163 and sialoadhesin by the virulent strains, which was followed by a
steep increase in IL‐8 and soluble CD163 at 3‐4 dpi. The early delay in macrophage
activation by virulent strains may be critical for disease establishment.
The association between the delay produced by VtaA8 and VtaA9 in the endocytic
route and the delay in macrophage activation needs further study.
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Variaciones en el "fitness" del VIH-1 durante la Terapia AntirretroviralGarcía Prado, Julia 26 September 2005 (has links)
El Virus de Inmunodeficiencia Humana Tipo-1 (VIH-1) es el agente etiológico responsable del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Esta enfermedad se caracteriza por una pérdida sostenida de linfocitos T CD4+, provocando una alteración global del sistema inmunitario, y dejando al individuo expuesto a infecciones oportunistas y al desarrollo de ciertas neoplasias.Desde la introducción de la zidovudina en el año 1986 hasta la implantación a partir del año 1996 de las Terapias Antirretrovirales de Gran Actividad o TARGA (combinaciones de al menos tres compuestos antirretrovirales) se han aprobado un total de 19 nuevos fármacos para el tratamiento de la infección por el VIH-1. En su conjunto, la quimioterapia contra la infección por el VIH-1 incrementa la esperanza de vida de los individuos infectados. Sin embargo, complicaciones surgidas por el uso de estas terapias (p.e una adherencia subóptima, alteraciones en el perfil fármaco-cinético de algunos pacientes o la falta de potencia de los tratamientos) propician la selección de mutaciones de resistencia frente a los fármacos antirretrovirales. La aparición de estas mutaciones en el genoma del VIH-1 constituye una barrera al éxito duradero de las terapias antirretrovirales.Nuestras investigaciones parten del interés por el estudio de la variación en la eficacia biológica o "fitness" del VIH-1 debido a la adquisición de mutaciones de resistencia. La relación entre el mantenimiento de cepas virales con bajo "fitness" y elevada resistencia con un posible beneficio clínico constituye uno de los ejes centrales en los estudios aplicados de "fitness" viral. A lo largo de este trabajo resumiré el conocimiento acumulado en los últimos años en el estudio del VIH-1: su estructura básica y aspectos más relacionados con esta tesis, como son los fenómenos de resistencia a antirretrovirales y sus consecuencias en la modulación del "fitness" del VIH-1. / Human Immunodeficiency Virus Tipo-1 (HIV-1) is the agent responsible of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). This illness is characterized by a long-term loss of CD4+T cells producing a global alteration of the immune system leading to the dead of the individual.From the introduction of Zidovudine in 1986 to Highly Active Antiretroviral Therapies (HAART) (combinations of at least 3 antiretroviral drugs), in 1996 it has been approved a total of 19 new drugs against HIV. These regimens have contributed to decrease mortality and morbidity among HIV-1 infected patients. However, in the course of treatment drug resistant HIV-1 variants often emerge as a result of impotent regimens, suboptimal adherence, pharmacological hurdles or ineffectively treated compartments, which has been a major factor contributing to treatment failure. Our research begins for the interest in study changes in HIV-1 replicative capacity or viral fitness associated with the acquisition of resistance mutations. The relationship between the maintenance of viral strains with low viral fitness and high resistance with a better clinical outcome is one of the mains objectives in the studies of viral fitness. In this thesis we will resume the knowledge from the last years in the studies of HIV-1: its basic structure and aspect associated this thesis, the processes of resistance and their consequences in changes of viral fitness.
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Estudio de los genes implicados en el metabolismo del arsénico en cultivos y en sistemas naturalesEscudero González, Lorena Victoria 30 March 2009 (has links)
La presencia de arsénico en aguas potables y de riego es un problema económico, social y ambiental de extrema importancia, especialmente en varios países de América Latina (principalmente en el Norte de Chile y de Argentina). Los microorganismos respiradores que reducen As(V) a arsenito As(III) son diversos y pueden estar implicados en la movilización del arsénico del sedimento a fuentes de agua potable. Para entender cómo contribuye este metabolismo a la biogeoquímica del arsénico la presente tesis explora, por un lado, tanto la diversidad de comunidades microbianas en ambientes naturales salinos con presencia (p.ej. el Salar de Ascotán) o ausencia (Laguna Tebenquiche) de arsénico, como la distribución y diversidad de los genes involucrados en este metabolismo (arsenato reductasa arrA y arsC) y, por el otro, el aislamiento y caracterización de cultivos puros y su implicación en la formación de minerales sulfurosos de arsénico en estos ambientes salinos.Con la construcción de bibliotecas genéticas se pudo caracterizar la diversidad microbiana del gen ribosómico 16S rRNA, encontrando diferencias marcadas entre las bacterias presentes en ambientes salinos con y sin arsénico. La diversidad de genes involucrados en la reducción del As(V), se estudió con cebadores específicos descritos en estudios previos pero optimizando su aplicación a muestras naturales con contenidos elevados de arsénico. Se estudió el gen arrA presente en microorganismos que respiran arsenato y lo reducen a arsenito y el gen arsC que está ligado a la detoxificación del arsénico denle el citoplasma y su expulsión mediante bombas de excreción ligadas a la membrana. La mayoría de las secuencias recuperadas formaron grupos nuevos pero relacionados con los clones obtenidos en ambientes similares pero de menor concentración de arsénico reportados en la literatura, y emparentados con el grupo Firmicutes. Observamos que, tanto por el estudio de los genes 16S rRNA como de los genes funcionales de As, los grupos más abundantes siempre fueron Firmicutes y Gammaproteobacteria en muestras de agua y de sedimento del Salar de Ascotán.En un conjunto de muestras naturales con diferentes concentraciones de arsénico encontramos una relación entre la concentración de arsénico y la presencia, mediante la técnica del número más probable, de bacterias reductoras de arsénico muy abundantes a mayores concentraciones y ausentes a bajas concentraciones. La presencia del gen arrA se detectó a lo largo de todo el gradiente. En cambio, el gen arsC sólo fue encontrado en muestras con bajas concentraciones de arsénico. Estos datos indican la presencia en estos sistemas de bacterias relacionadas con la reducción del arsénico sugiriendo un papel importante en su movilización a fuentes de aguas naturales.Finalmente, los estudios de cultivos de enriquecimientos y aislamiento de cepas procedentes del Salar de Ascotán, nos permitió disponer de una nueva cepa del genéro Shewanella capaz de reducir As y sulfato en forma anaeróbica, una peculiaridad que la diferencia de otras Shewanella spp. aisladas previamente de ambientes contaminados con arsénico. Además, estos estudios nos ayudaron a comprender mejor el ciclo biogeoquímico del arsénico a nivel geológico, ya que se demostró que la presencia y actividad de bacterias reductores de arsenato está ligada a la formación de minerales sulfurados de arsénico a gran escala, confirmando el origen biológico de estos minerales. / Presence of arsenic in drinking and irrigation waters is a serious concern of great economic, social, and environmental importance in numerous locations across South America (mainly in the Northern Chile and Argentina). As respiring microorganisms that reduce As(V) to As(III) are diverse and can be involved in the As mobilization from the sediment to drinking water sources. The present PhD thesis explores the links between the microbial metabolism and the biogeochemical cycling of As in saline systems of Northern Chile. On the one hand, the microbial diversity and the distribution and diversity of arsenic functional genes (i.e., arsenate reductases arrA and arsC) were studied in saline environments with high (e.g., Salar de Ascotán) and low (e.g., Laguna Tebenquiche) As concentrations. On the other hand, characterization of microbial enrichments and bacterial pure cultures were carried out to link bacterial activity and the origin of arsenic minerals in the environment. The 16S rRNA gene clone libraries showed consistent differences in bacterial community composition in saline environments with high and low concentrations of As. As functional genes were amplified with specific primers previously described in the literature and methodological improvements were conducted in this work to optimize the amplification in hypersaline, As-rich natural samples. The gen arrA is present in anaerobic microorganims that respire As (V) to As (III). The gen arsC, in turn, is used for detoxification trough membrane pumps. Most of the sequences found formed new clusters distantly related to previously known sequences obtained from environments with presence of As, within the Firmicutes. Both 16S rDNA and arsenic functional genes showed Firmicutes and Gammaproteobacteria as the predominant bacterial groups in water and sediment samples of Salar de Ascotán.Along a set of natural samples with increasing arsenic concentrations we found a positive relationship between arsenic concentration and abundance of arsenic reducing bacteria determined by MPN. The gen arrA was detected throughout the gradient. Conversely, the gen arsC was only found in the samples with the lowest arsenic concentrations. These data showed a widespread occurrence of bacteria related to the arsenic cycling, suggesting a key role of arsenic reducing bacteria in the arsenic mobilization to the aqueous phase.Finally, through classical microbiology studies we obtained a new strain of Shewanella from sediments of Ascotán that reduced both As and sulfate under anaerobic conditions, a specific trait not previously reported in other Shewanella spp isolated from environments contaminated with arsenic. In addition, these studies gave further clues for a better comprehension of the arsenic cycle at the geological level. We showed that the presence and activity of arsenic reducing bacteria was linked to the formation of sulfurous arsenic minerals at a large scale, giving further evidence for the biological origin of the wide arsenic mineral layers found in Salar de Ascotán.
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