EN CASTELLANO:Se presenta un estudio basado en la caracterización morfológica, fisiológica, quimiotaxonómica y análisis filogenético de 16 aislamientos obtenidos a partir de muestras procedentes de la Isla del Rey Jorge y la Isla de Livingston. Ambas son las islas de mayor superficie de las Shetland del Sur en la Antártida. Las muestras fueron proporcionadas por científicos españoles en el transcurso de las campañas científicas llevadas a cabo durante los veranos australes de los años 1987-88, 1988-1989 y 1990-91.El contenido de este trabajo se inicia con un recorrido histórico de la taxonomía bacteriana desde sus orígenes, los grandes hitos que han marcado su avance así como las perspectivas actuales de esta disciplina. Se señalan las aportaciones de Müller, Ehrenberg, Cohn, Migula, Orla-Jensen, Lehmann y Neumann, Buchanan, Bergey, Prévot, Krassilnikov, Murria, Kimura, Woese y Stackebrandt, entre otros.Como resultado de este estudio polifásico se ha logrado establecer la posición taxonómica de estos 16 aislamientos. Tres de las cepas aisladas (NF12, NF22 y NF24) corresponden a bacilos Gram negativos, psicrotrofos, móviles mediante flagelación polar monotrica y anaerobios facultativos. La composición de bases del DNA presenta un valor entre 41-42 mol % (G+C). En cuanto al perfil de ácidos grasos es similar al perfil que presentan otras especies del género Shewanella. Todas las cepas contienen ubiquinonas, menaquinonas y pequeñas cantidades de metilmenaquinonas al igual que otras shewanellas. Los estudios filogenéticos basados en la secuenciación del rRNA 16S y los experimentos de hibridación DNA-DNA confirman que estos aislamientos pertenecen al género Shewanella. Dos de ellos (NF12 y NF24) se ubican a nivel de la especie Shewanella firigidimarina mientras que NF22T ocupa una posición separada de las especies conocidas en el género Shewanella, corresponde por tanto a una nueva especie a la que se ha designado como Shewanella livingstonensis.El segundo grupo caracterizado comprende 11 biotipos que corresponden a cocobacilos Gram negativos, halotolerantes, inmóviles y con un metabolismo estrictamente oxidativo. El contenido en G+C presenta un rango entre 44-47 mol %. El perfil de ácidos grasos predominantes que se ha detectado concuerda con el presentado por el género Psychrobacter. Los estudios filogenéticos basados en la composición del rRNA 16S confirman que estas cepas pertenecen al género Psychrobacter. En cuanto a los experimentos basados en las hibridaciones DNA-DNA entre estos 11 biotipos y las especies de Psychrobacter filogenéticamente más próximas, nos han permitido establecer grupos de homología y concluir que 5 de los aislamientos (NF18, NF19, NF20, EN1 y EN2) se sitúan a nivel de Psychrobacter immobilis, 3 aislamientos (NF1, NF7 y NF8) corresponden a representantes de Psychrobacter glacincola y los otros 3 aislamientos corresponden a nuevas especies del género Psychrobactera las que se ha denominado Psychrobacter luti (NF11T) y Psychrobacter fozii(NF23T y EN4). El último grupo estudiado está constituido por los biotipos 20CM y 20CO, aislados a partir de sedimentos e identificados como miembros del género Paenibacillus. Estos microorganismos psicrotolerantes, aerobios o facultativos, presentan un Gram variable y forman endosporas ovales, terminales o subterminales, deformantes del esporangio. El perfil de ácidos grasos coincide con el descrito para el género Paenibacillus, siendo el ácido graso saturado C15:0 el mayoritario. La composición de bases del DNA es de 40.7 mol % (G+C). Los estudios basados en la secuencia del rRNA 16S sitúan la cepa 20CMT en el género Paenibacillus, con un índice de similitud del 99.5 % respecto a la especie Paenibacillus macquariensis DSM 2T. Sin embargo, los estudios de hibridación DNA-DNA entre ambas cepas dan unos niveles de reasociación muy bajos (47 %), lo que nos permite confirmar que el biotipo 20CMT corresponde a una nueva especie del género Paenibacillus para la que hemos propuesto el nombre de Paenibacillus antarcticus. / This Doctoral Memory presents a study based on evaluation of morphological, physiological, chemotaxonomic and phylogenetic analyses of 16 isolates from samples collected in the South Shetland Islands (Antarctica) by a Spanish scientific expeditions during the Antarctic summers of 1987-88, 1988-89 y 1990-91. The content of this work begins with an historical overview and taxonomic bacteriology perspectives also. Pointing out the contribution of Müller, Ehrenberg, Cohn, Migula, Orla-Jensen, Lehmann and Neumann, Buchanan, Bergey, Prévot, Krassilnikov, Murray, Kimura, Woese, Stackebrandt and others.As a result from this study we establish the taxonomic position of these bacteria. Three strains (NF12, NF22 and NF24) of psychrophilic bacteria isolated from Antarctic coastal marine environments were Gram-negative rods, facultatively anaerobic and motile by means of a single polar flagellum. The DNA base content of these bacteria was 41-42 mol % (G+C). The fatty acid profiles of the bacterial isolates were similar to the profiles of other "Shewanella" species. All the strains contained both ubiquinones and menaquinones, like "Shewanella" species. 16S rRNA gene analysis and DNA-DNA hibridization experiments confirmed that isolated strains belonged to the genus "Shewanella" and two of them specifically to "Shewanella frigidimarina" (NF12 and NF24), the other strain (NF22T) occupies a separate position in the genus "Shewanella" and is proposed as a new species, designated "Shewanella livingstonensis sp. nov".Another group of eleven psychrophilic bacteria isolated correspond to Gram-negative coccobacilli, halotolerant, non-motile with a strictly oxidative metabolism. The DNA (G+C) content ranged from 44 to 47 mol %. The predominant cellular fatty acids detected were typical of the genus Psychrobacter. 16S rRNA gene sequence analysis confirmed that the strains isolated belonged to the genus "Psychrobacter". DNA-DNA hybridization experiments showed six homology groups. The results of the study assigned five isolates (NF18, NF19, NF20, EN1 and EN2) to "Psychrobacter immobilis" LMG 7203T, three isolates (NF1, NF7 and NF8) to "Psychrobacter glacincola" LMG 21282T and three isolates to novel "Psychrobacter" species designated as a Psychrobacter luti sp. nov. (NF11T) and "Psychrobacter fozii sp. nov." (NF23T and EN4).The last group, constituted by 20CO and 20CM strains, was isolated from sediment and identified as a members of the genus "Paenibacillus". These organisms stained Gram-variable, produced ellipsoidal spores and were facultatively anaerobic. These isolates were psychrotolerant and the fatty acid profile was in accordance with that given in the description of the genus "Paenibacillus", anteiso-branched saturated C15:0 is the predominant fatty acid found. The DNA (G+C) content was 40.7 mol %. Studies based on 16S rRNA gene sequence analysis placed strain 20CMT within the Panibacillus cluster, with a similarity value of 99.5 % to "Paenibacillus macquariensis" DSM 2T. The low DNA-DNA reassociation value of 47 % between these two strains confirmed the distinct position of strain 20CMT within the genus "Paenibacillus". The name "Paenibacillus antarcticus sp. nov". is proposed to the type strain 20CMT.

Se ha estudiado la variabilidad genética de poblaciones de V. cholerae procedentes de distintas fuentes y orígenes geográficos, que agrupan diferentes serogrupos y biotipos de esta especie. Se ha analizado la variabilidad genética a dos niveles: a un nivel proteico, aplicando la técnica de electroforesis de aloenzimas multilocus (MLEE), y a un nivel génico, realizando el análisis de secuencias multilocus (MLST). Con ello, se ha intentado determinar la relación genética existente entre las distintas cepas estudiadas, considerando los datos obtenidos globalmente y por subgrupos de poblaciones, para establecer la estructura poblacional y la diversidad génica que presenta V. cholerae.Un total de 107 cepas de V. cholerae, incluyendo 29 cepas pertenecientes al serogrupo O139, fueron estudiadas aplicando la técnica de electroforesis de aloenzimas multilocus (MLEE) para determinar la variación alélica de 15 enzimas "housekeeping". Todos los loci fueron polimórficos y se identificaron 99 ETs para el total de la muestra. No se detectó una asociación significativa de las cepas en función de su serogrupo u origen geográfico. Se obtuvo el valor de diversidad génica media (H=0,50) más alto descrito para esta especie. El análisis del desequilibrio de ligamiento mostró una estructura clonal para el conjunto de la población, pero cuando se estudiaron subgrupos de esta población hubo excepciones, que hacen pensar en la existencia de un cierto grado de recombinación. Estos resultados sugieren que la población estudiada presenta una estructura poblacional epidémica.Para una colección de 29 cepas del serogrupo O139 se ha realizado el análisis comparativo de fragmentos internos de 6 genes "housekeeping", aplicando la metodología de análisis de secuencias multilocus (MLST). Los resultados obtenidos muestran la existencia de al menos 3 clones distintos entre las cepas analizadas, contradiciendo la actual hipótesis monoclonal de este serogrupo. También se detectaron dos grupos muy distintos de cepas del serogrupo O139, ST1 y ST4, que exhibieron diferencias en el perfil alélico para los 6 loci analizados.

En aquest estudi es van aïllar un total de 199 soques mesòfiles del gènere Aeromonas a partir de mostres de mol·luscs bivalves i d'aigües dolces. El medi agar dextrina ampicil·lina (ADA) fou el medi de cultiu més eficient en l'aïllament d'Aeromonas. La selecció de 16 proves fenotípiques clau va permetre la identificació a nivell d'espècie del 91 % de les soques estudiades. Es va realitzar un estudi de taxonomia numèrica amb 64 proves fenotípiques i 220 soques que, al 89 % de S[sub SM], va definir huit phena (I-VIII). Totes les soques d'una mateixa espècie o de diverses espècies d'un mateix complex fenotípic o fenoespècie es van agrupar en un únic phenon, excepte les soques tipus d'A. salmonicida i d'A. media que no s'agruparen en cap dels phena definits. Els phena V, VI i VII agruparen soques aïllades de mol·luscs bivalves no identificades a nivell d'espècie, la qual cosa suggereix l'existència de noves espècies del gènere Aeromonas. Per una altra banda, mentre la majoria de les espècies mostraren activitat beta-hemolítica, únicamente les espècies A. hydrophila, A. bestiarum i A. salmonicida van presentar activitat elastolítica. La presència d'espècies d'Aeromonas patògenes oportunistes i d'altres espècies amb factors de virulència fa recomanable la monitorització d'Aeromonas en aigües (potables, recreatives i de piscifactories) i en aliments que, com les ostres, es consumeixen crus o poc cuits.Es va aplicar la tècnica d'electroforesi d'enzims multilocus (MLEE) a 122 soques de les espècies A. hydrophila, A. bestiarum, A. salmonicida, A. popoffii i A. trota. Mitjançant l'anàlisi de 15 enzims, s'obtingueren 79 perfils al·lèlics o tipus electroforètics (ETs). La diversitat genètica mitjana (H) de la mostra completa fou 0,64. Les subpoblacions A. hydrophila i A. salmonicida van presentar major diversitat genètica que les subpoblacions A. popoffii i A. bestiarum. Per una altra banda, l'anàlisi del desequilibri de lligament suggereix que l'estructura poblacional d'Aeromonas és clonal, ja què l'índex d'associació (I-subA) fou significativament diferent de 0 (I-subA=2,38, P menor que 0,0001). A una distància genètica menor que o igual a 0,7 el dendrograma de la relació genètica entre ETs va separar clarament les espècies A. salmonicida (grup II), A. trota (grup III) i A. hydrophila (grup IV), en canvi, les espècies A. bestiarum (subgrup Ib) i A. popoffii (subgrup Ic) es van separar a una distància genètica memor que o igual a 0,6. Les soques mesòfiles i psicròfiles de l'espècie A. salmonicida s'agruparen conjuntament. El dendrograma de la relació genètica entre ETs també va mostrar una bona correlació amb l'origen de les soques. Finalment, la comparació entre la identificació fenotípica de les soques i les freqüències al·lèliques obtingudes en la técnica MLEE va mostrar que cinc loci, EST1 (esterasa 1), HEX (hexoquinasa), IDH (isocitrat deshidrogenasa), LDH1 (lactat deshidrogenasa 1) i MDH (malat deshidrogenasa), identifiquen correctament el 94 % de les soques estudiades.

ANTECEDENTES: El cambio global conduce a la emergencia o reemergencia de las enfermedades transmitidas por vectores en algunas partes del mundo, incluyendo la leishmaniosis, una de las más olvidadas. La leishmaniosis es una enfermedad parasitaria transmitida principalmente a través de la picada de un flebotomo vector. En nuestro entorno, la leishmaniosis está causada por Leishmania infantum y los vectores probados de la misma son Phlebotomus ariasi y P. perniciosus. Los perros domésticos constituyen el principal reservorio del parásito, representando un riesgo para los humanos. En la Península Ibérica, la distribución de la leishmaniosis humana y canina es heterogénea e incompleta. En Andorra y Lleida existen algunos estudios sobre la presencia de flebotomos y hay algunos casos de leishmaniosis humana recogidos de forma oficial en la provincia de Lleida pero, por otra parte, no existen datos oficiales sobre la presencia de casos de leishmaniosis canina. La posibilidad de que la enfermedad esté extendiéndose y estableciéndose en los Pirineos debe ser tomada en consideración, conociendo la presencia de la misma en las áreas fronterizas de Francia y España. OBJETIVOS: El principal objetivo del presente estudio es la obtención de datos epidemiológicos sobre la leishmaniosis que puedan ser utilizados como base para el monitoreo de la evolución de la enfermedad en estudios posteriores, a través del estudio de los vectores y de la leishmaniosis canina así como de los factores que influyen en su densidad y seroprevalencia. MÉTODOS: Se han realizado tres tipos de estudios: un estudio entomológico en Andorra y Lleida mediante la captura de flebotomos con trampas adhesivas colocadas en los lugares de reposo de los adultos, un estudio basado en un cuestionario sobre la percepción de la leishmaniosis canina enviado a todos los veterinarios dedicados a pequeños animales de la provincia de Lleida y un estudio serológico transversal realizado en perros de la comarca del Pallars Sobirà. Se realizaron análisis bivariantes y multivariantes para estudiar la correlación estadística entre las distintas variables recogidas y las variables respuesta obtenidas (densidad de los vectores y seroprevalencia de leishmaniosis canina). RESULTADOS: En el estudio entomológico, las dos especies vectoras fueron capturadas en Andorra donde P. ariasi mostraba una distribución más amplia, encontrándose ejemplares entre los 800 y los 2200 m s.n.m., mientras que P. perniciosus, identificado por primera vez en la zona, estaba presente por debajo de los 1000 m s.n.m. En la provincia de Lleida también se capturaron los dos vectores entre los 94 y los 1630 m s.n.m. El análisis bivariante reveló que factores como la altitud, el piso bioclimático, la temperatura, la precipitación, el lugar de captura, la presencia de vegetación en el muro, el hecho de estar en un parque natural, el ambiente general, la vegetación adyacente y la cobertura del suelo se asociaban de forma significativa a la densidad de las especies, a menudo con resultados opuestos, en función de la especie. El modelo multivariante para P. perniciosus reveló que su densidad se encontraba afectada principalmente por la situación de la trampa de captura (caminos asfaltados IRR: 0,41) y la cobertura del suelo (cultivo IRR: 4,59). En el caso de P. ariasi, se observó una correlación significativa con la altitud, incrementando su densidad por encima de los 800 m s.n.m. (IRR: 3,40), y con el piso bioclimático, disminuyendo su densidad en el piso Mesomediterráneo con respecto a los pisos presentes en las zonas pirenaicas (IRR: 0,08). El estudio serológico mostró una seropositividad del 33,1%. Los resultados del modelo de regresión logística mostraron que el riesgo de seropositividad aumentaba con la edad (OR=1,35 p-valor=0,002), en aquellos perros que vivían en la zona sur del Pallars Sobirà (OR=6,20 p-valor=0,025), en aquellos cuyos dueños consideraban que sus animales estaban en riesgo de padecer la enfermedad a lo largo de su vida (OR=1,26 p-valor=0,024) y en aquellos que no estaban informados de la utilización de medidas preventivas (OR=11,6 p-valor=0,009). El riesgo decrecía cuando los perros vivían en hábitats urbanos o periurbanos (OR=0,17 p-valor=0,002). DISCUSIÓN: Se considera a Andorra como un área en riesgo para la emergencia de la leishmaniosis humana y canina debido a la presencia de los vectores durante el periodo de transmisión de la enfermedad en regiones templadas. Dada la influencia de factores bióticos y abióticos en la distribución y densidad de las especies vectoras, queda claro que el cambio global puede afectar a la distribución y expansión de la leishmaniosis en la provincia de Lleida. La utilidad de los cuestionarios veterinarios para definir la percepción de la leishmaniosis canina en una región virgen, queda puesta de manifiesto. La elevada seroprevalencia de la leishmaniosis canina detectada y el elevado porcentaje de perros asintomáticos seropositivos sugieren que el foco autóctono detectado por primera vez en la provincia de Lleida no es reciente. La transmisión de Leishmania infantum puede verse favorecida por la presencia de una elevada densidad de perros viviendo en condiciones idóneas para que tenga lugar la transmisión de la enfermedad, incluso en presencia de una baja densidad de especies vectoras capturadas con trampas adhesivas. CONCLUSIONES: Un monitoreo constante del área estudiada es necesario para el control de la expansión así como del posible establecimiento de la enfermedad. / Changes in global climate, human activities and migration have resulted in the emergence or re-emergence of vector-borne diseases in some parts of the world, including leishmaniasis, one of the most neglected diseases. Leishmaniasis is a parasitic disease transmitted mainly by the bite of permissive sand flies. In the Iberian Peninsula, leishmaniasis is caused by Leishmania infantum and the two proven vectors are Phlebotomus ariasi and P. perniciosus. The domestic dogs constitute the main reservoir hosts of the parasite, representing a risk for humans. The distribution of canine and human leishmaniasis in the Iberian Peninsula is heterogeneous and incomplete. In Andorra and Lleida there are few studies on the presence of sand flies but non official data on canine leishmaniasis is recorded. In spite of that, there are some official records on human leishmaniasis cases noticed in Lleida province. The possibility of the disease becoming wide-spread and established in the Pyrenees has to be under consideration, knowing the presence of the disease in the bordering areas of France and Spain. The general aim of the present work is to obtain epidemiological data on leishmaniasis that could be used as a base to monitor the evolution of the disease in later studies through the study of sand fly vectors and canine leishmaniasis and also identify the factors influencing them in Andorra and Lleida province. Three kinds of studies were carried out in the studied area. An entomological survey in Andorra and Lleida province through sand fly captures using sticky traps set in adults resting places, a questionnaire-based survey on canine leishmaniasis send to all the clinical veterinarians of small animals in Lleida province and a serological cross-sectional study in the dogs of Pallars Sobirà county. Bivariate and multivariate statistical analyses were applied to study the correlation between all the variables recorded and the outcomes obtained. The density of the vectors was used as a first outcome and the seroprevalence of canine leishmaniasis were used as a secondary outcome. Andorra is an area at risk of human and canine leishmaniasis emergence, given the presence of vectors during the disease transmission period in temperate countries. Given the influence of biotic and abiotic factors in the distribution and density of vector species, it is clear that global change would affect the distribution and expansion of leishmaniasis in Lleida province. The usefulness of veterinary questionnaires in defining awareness of canine leishmaniasis in a naïve region has been confirmed. The high seroprevalence of canine leishmaniasis detected and the high percentage of asymptomatic seropositive animals suggest that the focus detected for the first time in Lleida province has not emerged recently. Leishmania infantum transmission could be favoured by the presence of a high density of dogs living under conditions suitable for the transmission of the disease, even in the presence of a low density of sand flies vectors captured with sticky traps. A constant monitoring of the area studied is necessary to control the possible establishment and also the wide-spread of the disease.

Tesi realitzada al Servei de Microbiologia - Hospital Vall dHebron / La fibrosis quística (FQ) es la primera causa de patología pulmonar crónica en la infancia. La colonización más frecuente es por P.aeruginosa y se asocia con un mayor deterioro de la función pulmonar, menor supervivencia y peor pronóstico. Su detección precoz permite instaurar tratamiento antibiótico para erradicar la bacteria y evitar o retrasar la infección crónica. El cultivo seriado del esputo es la técnica utilizada en el seguimiento microbiológico habitual para definir el estadio de colonización pulmonar. Sin embargo, puede ser negativo en pacientes con tratamiento antimicrobiano, baja carga bacteriana o cuando no se pueden obtener muestras respiratorias de suficiente calidad, como ocurre en los niños, en los que se utiliza principalmente el exudado faríngeo. La detección de anticuerpos anti-P.aeruginosa en suero o la detección del DNA de la bacteria en muestras respiratorias podrían mejorar el diagnóstico precoz de la colonización por P.aeruginosa. El objetivo del estudio ha sido evaluar cultivo, detección del DNA y anticuerpos específicos en el diagnóstico de la colonización respiratoria por P.aeruginosa en niños con FQ. El estudio ha incluido un primer análisis con 116 pacientes, en diferentes estadios de colonización por P.aeruginosa, para establecer los mejores puntos de corte para diferenciar entre pacientes colonizados y no colonizados y entre pacientes con y sin colonización crónica, y un análisis posterior del seguimiento de 68 pacientes durante dos años. La detección cuantitativa del DNA se realizó mediante PCR en tiempo real de dos secuencias de los genes toxA y gyrB de P.aeruginosa y los resultados se expresaron como unidades formadoras de colonías por ml (UFC/ml). La determinación del título de anticuerpos IgG frente a elastasa (ELA), proteasa alcalina (PA) y exotoxina A (ETA) de P.aeruginosa se realizó con el equipo anti-Pseudomonas aeruginosa IgG EIA (Mediagnost®. Reutlingen, Alemania). Para identificar colonización por P.aeruginosa, la sensibilidad de la PCRgyrB fue mejor que la del cultivo o la PCRtoxA, con especificidad similar. Los mejores resultados se obtienen combinando la PCRgyrB≥35UFC/ml con el cultivo. La sensibilidad (86,0%) es superior con especificidad (97,3%) similar respecto al cultivo aislado (44,2% y 100%). Combinando cultivo y PCRgyrB≥35UFC con la detección de anticuerpos anti-ELA≥1/240 o con la detección de anticuerpos frente a los tres antígenos de P.aeruginosa (PA≥1/180 y/o ELA≥1/240 y/o ETA≥1/800) mejora la sensibilidad (93,0% y 88,4%) pero disminuye la especificidad (86,3% y 80,8%). El análisis del seguimiento de los 68 pacientes durante 24 meses confirma estos resultados. La sensibilidad de cultivo y PCRgyrB≥35UFC combinadas (93,9%), es superior al cultivo aislado (68,6%) aunque la especificidad (84,8%) continúa siendo menor que la del cultivo (100%). La media de tiempo desde el inicio del seguimiento hasta el primer resultado positivo para la PCRgyrB≥35UFC (4,9 meses) y para la detección de anticuerpos anti-ELA≥1/240 (6,0) fueron significativamente (p<0,001 y p<0,05) menores que para el cultivo (9,2). Para identificar colonización crónica por P.aeruginosa, los mejores resultados se obtienen con las técnicas de detección de anticuerpos, independientemente del resultado del cultivo. Combinando la detección de anticuerpos frente a los tres antígenos (PA≥1/1900 y/o ELA≥1/1500 y/o ETA≥1/1900), la sensibilidad (88.2%) es superior al cultivo (64,7%) con igual especificidad (91,9%). Utilizando los criterios de interpretación recomendados por el manual de la técnica (PA y/o ELA y/o ETA≥1/1250) los resultados son peores. Cuando el cultivo es positivo únicamente la detección de anticuerpos se asocia estadísticamente con el diagnóstico de colonización crónica. Cuando el resultado del cultivo es negativo tanto la detección de anticuerpos como un resultado de PCRgyrB≥5000UFC/ml o la combinación de ambas se asocian con colonización crónica por P.aeruginosa. / Cystic fibrosis (CF) is the leading cause of chronic lung disease in childhood. The colonization of these patients’ airways by P.aeruginosa is associated with greater decline in lung function and worse prognosis. Early detection allows the start of antibiotic treatment to prevent chronic infection. The serial culture of respiratory samples is used in the microbiological monitoring to define the stage of lung colonization. Detection of serum specific antibodies or DNA from the bacteria in respiratory samples could improve early diagnosis of colonization by P.aeruginosa. The aim of this study was to evaluate culture, detection of DNA and specific antibodies in the diagnosis of respiratory colonization by P.aeruginosa in CF patients, to differentiate colonized patients from non-colonized and patients with and without chronic colonization. Quantitative detection of the genetic sequences gyrB and toxA of P.aeruginosa, was performed by real-time PCR and expressed as colony forming units per ml (CFU/ml). Quantitative detection of IgG antibodies against elastase (ELA), alkaline protease (AP) and exotoxin A (ETA) of P.aeruginosa was performed by Pseudomonas aeruginosa anti-IgG EIA kit (Mediagnost®. Reutlingen, Germany). To identify colonization, the best results were obtained by combining PCRgyrB≥35CFU/ml and culture. Sensitivity (86.0%) was high with similar specificity (97.3%) compared to culture alone (44.2% and 100%). Adding anti-ELA≥1/240 antibodies detection or antibodies against all three antigens (PA≥1/180 and/or ELA≥1/240 and/or ETA≥1/800) enhanced the sensitivity (93.0% and 88.4%) but decreased the specificity (86.3% and 80.8%). In 68 patients followed for 24 months, the mean time from the beginning to the first positive result for PCRgyrB≥35CFU/ml (4.9 months) was significantly (p<0.001) lower than that from culture (9.2 month). To identify chronic colonization, the best results were obtained with antibody detection, regardless of culture result. Sensitivity (88.2%) of combining the antibodies detection against all three antigens (PA≥1/1900 and/or ELA≥1/1500 and/or ETA≥1/1900) was above culture (64.7%) with the same specificity (91.9%). When culture was positive, antibodies detection was the only method statistically associated with chronic colonization. When culture was negative, antibodies and PCRgyrB≥5000CFU/ml or the combination of both were associated with chronic colonization by P.aeruginosa.

Las micotoxinas son contaminantes químicos de origen biológico que suponen el mayor riesgo en la cadena alimentaria, debido a su amplia presencia y a los múltiples efectos perjudiciales que producen en los seres humanos y en los animales. En esta Tesis se ha puesto de manifiesto la elevada incertidumbre asociada al muestreo para la determinación del contenido de micotoxinas en pistachos, dentro del sistema de gestión de seguridad alimentaria. También se ha evaluado como posible reto emergente en la gestión, los posibles efectos derivados de un hipotético cambio climático caracterizado por incremento de la temperatura, radiación ultravioleta y sequedad en la micobiota ocratoxigénica presente en uvas y cereales. Las principales conclusiones obtenidas son: i) posible adaptación de las especies micotoxigénicas; ii) predominancia de aspergilos negros en las condiciones más extremas; iii) ineficacia de los antifúngicos en el control de ocratoxina A y posible necesidad de transición de unas materias activas a otras en función de las condiciones climáticas. / Mycotoxins are biologically derived chemical contaminants that pose the greatest risk in the food chain due to their widespread occurrence and the many detrimental effects that occur in humans and in animals. This thesis has highlighted the high uncertainty associated with the sampling for the determination of mycotoxins in pistachios, within the system of food safety management. The possible effects of a hypothetical climate characterized by increased temperature, drought and UV radiation on ocrhatoxigenic mycobiota of grapes and cereals has also been evaluated as a possible emerging management challenge. The main conclusions are: i) possible adaptation of mycotoxigenic species; ii) predominance of black aspergili under extreme conditions; iii) loss of antifungal effective in controlling ochratoxin A and possible need to transition from an active ingredient to another depending on the weather materials.

Introducción: El Análisis de Series Temporales es un grupo de técnicas de análisis matemático que permiten estudiar la relación entre las resistencias bacterianas y el uso de antibióticos. El Proyecto ViResiST (www.viresist.org) es un sistema de vigilancia de las resistencias bacterianas y de uso de antibióticos que utiliza técnicas de Análisis de Series Temporales para estudiar y predecir el comportamiento de las resistencias en 6 hospitales de la Comunidad Valenciana, uno de Madrid y varios hospitales de Escocia (Reino Unido), Holanda, Francia, Bélgica y EE.UU.Objetivos: Los objetivos de esta tesis son 1) conocer la situación en hospitales de la Comunidad Valenciana de las resistencias en infecciones pediátricas y su evolución a lo largo del tiempo, 2) caracterizar por Análisis de Series Temporales el comportamiento de las resistencias bacterianas cuando ello sea posible, 3) investigar la relación entre resistencia y uso de antimicrobianos y 4) identificar situaciones en las que sea necesario implementar medidas para el control de las resistencias.Material y Métodos: El material utilizado son las bases de datos proporcionadas por el Proyecto ViResiST, tanto para el estudio de los datos de sensibilidad, como para los de uso de antimicrobianos. Los hospitales incluidos en el estudio son 5 hospitales de la Comunidad Valenciana (H. Dr. Peset de Valencia, H de la Vega Baja de Orihuela (Alicante), H. Clínico de Valencia, H. General de Elche, H. General de Castellón) y dos europeos (el Aberdeen Royal Infirmary en Escocia y el Academic Hospital de Rotterdam en Holanda) a efectos de realizar comparaciones. Para cada combinación de especie, género o grupo de microorganismos se obtuvo el porcentaje de aislados resistentes o con sensibilidad intermedia de los tres últimos años con su intervalo de confianza al 95%. El análisis de series temporales se realizó por metodología ARIMA y el ajuste de función de transferencia por el método de Box-Jenkins.Resultados: En los hospitales de la Comunidad Valenciana los porcentajes de resistencia o sensibilidad intermedia más relevantes son los siguientes: Streptococcus pyogenes a eritromicina 12-30%, a clindamicina a < 5%; Streptococcus pneumoniae a pencilina 45-60%, a eritromicina 40-60%; Staphylococcus aureus a meticilina < 4%, a eritromicina 35%, a clindamicina < 10%; Escherichia coli a aminopenicilinas 70%, a amoxicilina-clavulánico y cefalosporinas de 1ª generación 10%, a cotrimoxazol 30-35%; Salmonella spp. a aminopenicilinas 50%. En Aberdeen y Rotterdam estos porcentajes son mucho menores. El consumo de antibióticos en los hospitales valencianos es mayor que en Aberdeen. Se modelizaron 251 series (26%) del total de secuencias de datos de resistencia y de uso de antimicrobianos estudiadas (976). Se identificaron un total de 60 funciones de transferencia en las que se encontró una relación significativa entre el porcentaje de aislados con resistencia o sensibilidad intermedia y uso de antimicrobiano. Discusión: Los datos del Proyecto ViResiST nos permiten disponer de información sobre el estado de las resistencias en Pediatría y sobre el uso de antibióticos en población general y a nivel hospitalario. Esta información es útil para orientar la terapia empírica de las infecciones por estos microorganismos. Las técnicas de Análisis de Series Temporales permiten además, identificar el efecto del uso de antimicrobianos sobre las resistencias, cuantificarlo y estimar el intervalo de tiempo que debe pasar para que los cambios en el uso de antimicrobianos tengan su repercusión en los porcentajes de resistencia. Los mayores porcentajes de resistencia en los hospitales valencianos frente a los europeos probablemente se relacionan con un mayor consumo de antibióticos en nuestro entorno. / Background: Time series analysis are a group of techniques aimed at adjusting a mathematical model to a series of observations taken over time. Time series analysis permits assessment of the relationships between antimicrobial use and resistance. ViResiST Project (www.viresist.org) is a surveillance system of antimicrobial resistance and use. ViResiST Project uses time series analysis to predict for the level of antimicrobial resistance for several hospitals in Spain, Scotland (U.K.), Belgium, Holland, France and United States of America.Aim: 1) Investigate the prevalence of antimicrobial resistance in pediatric population in Comunidad Valenciana (Spain) 2) Constructing autoregressive integrated moving average (ARIMA) models that analyze the temporal behaviour of bacterial resistance series 3) Assessment of the relationship between antimicrobial use and resistance by using transfer functions (Box-Jenkins) 4) Identify those situations of high level of antimicrobial resistance which may need measures of control of resistance. Methods: The data used were exported from ViResiST Project data bases. ViResiST Project collected data of antimicrobial resistance in children and antibiotic use in global population for 5-6 years from each hospital. We used the data from five hospitals of the Comunidad Valenciana (H. Dr. Peset de Valencia, H. de la Vega Baja de Orihuela (Alicante), H. Clínico de Valencia, H. General de Elche, H. General de Castellón) y two european hospitals (Aberdeen Royal Infirmary in Scotland (U.K.) y and the Academic Hospital of Rotterdam in Holland). Percentages of antimicrobial-resistant/intermediate microorganisms for the last 3 years were obtained. Data were analyzed as time series and ARIMA (Box-Jenkins) and transfer function models were built.Results: 976 antimicrobial-microorganism combinations were analyzed. We could demostrate a temporal relationship between antimicrobial use and resistance for 60 antimicrobial-microorganism combinations. Resistances and antibiotic use were higher in the spanish settings than in Aberdeen.Conclusions: ViResiST Project data are useful to know antimicrobial resistance in pediatric population and to guide empirical prescriptions of antimicrobials in pediatric infections. Widespread use of antibiotics, particularly &#61538;-lactams in the spanish settings accounts for selection of more antibiotic resistant microorganisms.

El conocimiento de los factores de virulencia de Mycobacterium tuberculosis es primordial para el desarrollo de nuevos fármacos y vacunas, esenciales para combatir esta enfermedad infecciosa que causa anualmente 1,7 millones de muertes. Una característica distintiva de las cepas virulentas de M. tuberculosis es la capacidad de fijar el colorante rojo neutro en su forma ácida. En trabajos anteriores se refutó la relación, ampliamente aceptada hasta el momento, entre este comportamiento y el sulfolípido (un componente de la envuelta celular); y se determinó que el gen Rv0577, cotranscrito con el posible regulador transcripcional Rv0576, confería a M. smegmatis (una micobacteria saprófita) el fenotipo rojo neutro positivo de las cepas virulentas de M. tuberculosis.En el presente trabajo, mediante fusiones transcripcionales y el análisis con microchips, se ha demostrado que el gen Rv0576 es, efectivamente, un regulador transcripcional que reprime la expresión del operón Rv0576-Rv0577. Sin embargo, el estudio de cepas mutantes y complementadas en estos genes ha mostrado que ninguno de estos dos genes es necesario para la tinción con rojo neutro de M. tuberculosis, ni para la virulencia en el modelo de infección murino.Asimismo se ha comprobado que M. tuberculosis, in vitro, forma poblaciones celulares heterogéneas para el carácter rojo neutro y para la síntesis de dimicocerosatos de ftiocerol, unos lípidos de la envuelta celular relacionados con la virulencia del bacilo. Los mutantes espontáneos rojo neutro negativos revierten, con cierta frecuencia, al fenotipo salvaje; mientras que no se ha detectado reversión en los mutantes en la síntesis de dimicocerosatos de ftiocerol, que se acumulan con las sucesivas resiembras de M. tuberculosis, hasta resultar en la población mayoritaria. Estas observaciones, y la relación de la tinción con rojo neutro y de los dimicocerosatos de ftiocerol con la virulencia de M. tuberculosis, ponen de manifiesto la necesidad de comprobar estos fenotipos antes de realizar el análisis de la virulencia de una determinada cepa o mutante de M. tuberculosis. / The identification of Mycobacterium tuberculosis virulence factors is necessary to develop new drugs and vaccines, urgently needed to fight an infectious disease that causes 1.7 million deaths annually. A unique feature of the virulent strains of M. tuberculosis is their ability to fix the neutral red stain in its acid form. Although sulfolipid (a component of the cell envelope) was first recognized as the molecule responsible for the neutral red uptake, recent studies have refuted this relationship, and have established that the Rv0577 gene, which constitutes a single operon together with the putative transcriptional regulator Rv0576, provides M. smegmatis (a saprophytic mycobacteria) with the neutral red positive phenotype characteristic of M. tuberculosis virulent strains.In the present work, by means of transcriptional fusions and microarray analysis, we have proved that the Rv0576 gene indeed behaves as a transcriptional regulator that represses the expression of the Rv0576-Rv0577 operon. However, studies of mutant and complemented strains in these genes have shown that none of them is necessary either for the neutral red reaction of M. tuberculosis or for virulence in the murine infection-model.We have also proved that, in vitro, M. tuberculosis forms heterogeneous cell populations regarding the neutral red character and the synthesis of phthiocerol dimycocerosates, a cell-wall lipid related to the virulence of the bacillus. Reversion of the spontaneous neutral red mutants to the wild-type phenotype occurs at certain frequency, whereas reversion of the mutants in the synthesis of phthiocerol dimycocerosates has not been detected and they accumulate with successive cultures of M. tuberculosis, becoming the bulk of the population. As both the neutral red character and phthiocerol dimycocerosates are related to M. tuberculosis virulence, it would be prudent to check these phenotypes before analyzing the virulence of a certain strain or mutant of M. tuberculosis.

Les Ribonucleotidil reductases (RNRs) són un grup d'enzims que catalitzen la reducció de ribonucleòtids (NTPs) a desoxiribonucleòtids (dNTPs), proporcionant a tots els organismes vius la quantitat necessària de monòmers per a la síntesis i la reparació del DNA. S'han caracteritzat tres classes diferents de RNRs en funció dels mecanismes de generació del radical, diferències estructurals, regulació al·lostèrica i dependència envers l'oxigen, però totes elles tenen en comú el mecanisme de reacció i la utilització d'un radical orgànic lliure per a iniciar la catàlisi.El genoma de Streptococcus pyogenes (Grup A Streptococcus [GAS]), un patògen humà responsable de diverses malalties, conté els gens per a sintetitzar dues RNRs completes de classe Ib (nrdHEF/nrdI2 i nrdFIE*, respectivament), mentre que la majoria d'estreptococs tan sols conté els gens nrdHEF/nrdI2. Aquest treball intenta determinar si la presencia de una segona reductasa de classe Ib en aquest microorganisme és conseqüència d'una necessitat biològica o si senzillament és el resultat del procés evolutiu. S. pyogenes és el primer organisme procariota on s'han estudiat dues riboucleotidil reductases de la mateixa classe.L'estudi per RT-PCR de lligament ha demostrat que tots dos agrupaments es transcriuen de manera simultània i que constitueixen dues unitats policistròniques independents. Les subunitats ? i ? d'aquests dos sistemes s'han purificat i caracteritzat bioquímicament. El primer sistema (nrdHEF) ha resultat ser bioquímicament actiu i presenta una senyal d'EPR que coincideix amb la d'altres radicals tirosil de classe Ib. L'activitat del sistema depèn de l'adició de magnesi i DTT i utilitza NDPs, però no NTPs, com a substrat. Tanmateix, es veu estimulada per el dATP com a efector al·lostèric però no per l'ATP, tal i com correspon a un enzim de classe Ib. No obstant, no s'ha pogut detectar activitat ni un radical tirosil en l'operó nrdFIE*. L'alineament de la subunitat ? d'aquest operó ha mostrat que tres dels sis residus d'unió a ferro no estan conservats. El contingut de ferro de les dues proteïnes NrdF mostra clarament que, a diferència del que succeeix en la proteïna NrdF, la proteïna NrdF* no és capaç de coordinar un centre difèrric in vitro en les condicions de l'assaig, impedint-se així la generació d'un radical tirosil.L'assaig de complementació heteròloga, no obstant, indica que l'operó nrdFIE* és funcional in vivo si tots tres gens estan presents. D'una manera similar, l'operó nrdHEF no presenta complementació si no s'afegeix una proteïna NrdI funcional a l'assaig. En presència de les proteïnes NrdI* i NrdI2 de S. pyogenes, l'operó nrdHEF no és funcional in vivo, però si s'assaja en combinació amb la proteïna NrdI2 de S. pneumoniae. La presencia d'un agrupament nrdFIE quasi idèntic en totes les espècies del gènera Mycoplasma ens permet suggerir que l'operó nrdFIE ha estat adquirit per S. pyogenes mitjançant transferència genètica lateral per a compensar la pèrdua de funcionalitat de la proteïna NrdI*.També hem estudiat el promotor que regula l'expressió transcripcional de la ribonucleotidil reductasa anaeròbica d'Escherichia coli (nrdDG). S'ha demostrat que aquest promotor està activat per el regulador transcripcional FNR (fumarate and nitrate reduction), i s'han identificat dues regions que presenten un nivell de similitud significatiu amb la seqüència consens d'unió a FNR. En aquest treball hem investigat la interacció de FNR a la regió promotora dels gens nrdDG així com l'efecte d'aquesta interacció en la transcripció. Els assaigs de mobilitat electroforètica amb la proteïna FNR* purificada han demostrat la interacció de FNR amb totes dues regions, i els estudis amb les caixes FNR mutagenitzades indiquen que la regió FNR-2 és essencial per a la activació anaeròbica del promotor nrdDG. La regió FNR-1, no obstant, és necessària per a la màxima expressió d'aquest promotor. Els nostres resultats suggereixen que totes dues regions actuen de forma sinèrgica per a coordinar l'expressió en resposta a concentracions canviants d'oxigen. / Ribonucleotide reductases (RNRs) are a group of enzymes that catalyze the reduction of ribonucleotides (NTPs) to deoxyribonucleotides (dNTPs), thus providing all organisms with optimal amounts of the necessary buildings blocks for DNA replication and repair. Three classes of RNRs have been characterized up to date according to their different mechanisms for radical generation, structural differences, allosteric regulation and oxygen dependence, all of them having in common the reaction mechanism and the use of an organic free radical to initiate catalysis.The genome of Streptococcus pyogenes (Group A Streptococcus [GAS]), a human pathogen responsible for many diverse infections, harbours the genes to synthesize two complete class Ib RNRs (nrdHEF/nrdI2 and nrdFIE* respectively), while most streptococci only bear the nrdHEF/nrdI2 genes. This work attempts to determine whether the presence of a second class Ib RNR in S. pyogenes accounts for a biological need or if it is simply the result of a vestigial burden. S. pyogenes is the first prokaryotic organism where two distinct and complete ribonucleotide reductases of the same class are studied.Linkage RT-PCR showed that both clusters are simultaneously transcribed and constitute two independent polycistronic units. The ? and ? subunits for these two systems were purified and biochemically characterized. The first system (nrdHEF) proved active and presented an EPR signal that matched that of other class Ib tyrosyl radicals. Activity was dependent on the addition of magnesium and DTT and required NDPs but not NTPs as a substrate. It was also stimulated by dATP as an allosteric effector but not by ATP, as expected in a class Ib enzyme. However, neither activity nor tyrosyl radical signal were ever detected from the nrdFIE* cluster. When aligned together with other class Ib enzymes, three out of the six iron binding residues within the ? subunit of the nrdFIE* cluster were found not to be conserved. The iron contents of the two NrdF proteins clearly showed that, contrary to the ? subunit from nrdHEF, the ? subunit from nrdFIE* was not capable of coordinating an iron centre in vitro under the conditions tested, which, in turn, impaired the generation of a tyrosyl radical.Heterologous complementation assays, however, showed that the nrdFIE* operon is fully functional in vivo when all three genes are present. In a similar manner, the nrdHEF system showed no complementation unless a functional NrdI protein was provided. Neither NrdI* nor NrdI2 from S. pyogenes rendered nrdHEF active, but it did addition of the NrdI2 protein form S. pneumoniae. The presence of an almost identical nrdFIE cluster in all Mycoplasma species leads us to suggest that the nrdFIE* operon was acquired by S. pyogenes through a lateral gene transfer event to compensate for the loss of a functional NrdI*.We have also studied the promoter regulating the transcriptional expression of the anaerobic ribonucleotide reductase of Escherichia coli (nrdDG). This promoter has been shown to be up-regulated by the pleiotropic transcriptional regulator FNR (fumarate and nitrate reduction), and two regions with significant similarity to the FNR consensus sequence were also found. In this work we have investigated the binding of FNR to the nrdDG promoter region and the effects of such binding on transcription. Gel retardation analysis with purified FNR* demonstrated FNR interaction at both sites, and studies with altered FNR boxes indicated that the upstream FNR-2 site is essential for the anaerobic activation of the nrdDG promoter. The FNR-1 site, however, is needed for the maximal expression of this promoter. Our results suggest that both sites act synergistically to coordinate expression in response to shifting oxygen concentrations.

Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) és un patògen intracel·lular gram negatiu que provoca gastroenteritis en humans però que en ratolins provoca una infecció sistèmica similar a la febre tifoidea humana (provocada en aquest cas per S. Typhi). Una de les característiques principals de la infecció per S. enterica és la capacitat que presenta per envair activament cèl·lules epitelials i sobreviure i proliferar a l'interior dels macròfags.S. Typhimurium presenta codificades en el seu genoma tres tipus de ribonucleotidil reductases (RNRs): classe Ia, Ib i III. Les RNRs són enzims essencials ja que són els responsables de la síntesi de novo dels desoxirribonucleòtids (dNTPs), necessaris per a la síntesi i reparació del DNA, a partir de la reducció dels ribonucleòtids (NTPs). Fins ara s'han descrit tres classes de RNRs que es diferencien pel mecanisme de generació del radical que utilitzen, l'estructura que presenten, la seva regulació al·lostèrica i la seva dependència de l'oxigen. Tot i així, totes tenen en comú el mecanisme de reacció i la utilització d'un radical lliure orgànic per a iniciar la catàlisi.En aquest treball s'ha estudiat la regulació transcripcional de les tres classes de RNRs presents en S. Typhimurium, centrant-nos en dos reguladors: NrdR i Fur. S'ha estudiat l'efecte de la deleció de NrdR sobre l'expressió gènica de les tres classes de RNRs. NrdR és un repressor de les tres classes de RNRs i presenta un major efecte sobre l'expressió de l'operó nrdHIEF. També s'han descrit les seves caixes d'unió i s'han obtingut proteïnes mutants en determinats residus que afecten la funcionalitat de NrdR in vivo, possiblement degut a la participació d'aquests residus en la unió de dATP/ATP. La mutació de Fur provoca un agument de l'expressió de l'operó nrdHIEF de fins a cinc vegades respecte la soca salvatge. A la regió promotora de l'operó nrdHIEF hi hem detectat una possible caixa d'unió de Fur, la mutació de la qual provoca un augment en l'expressió similar a l'observat en la soca amb Fur delecionat. Mitjançant assajos de retardament electroforètic hem confirmat la unió de Fur a la regió promotora de l'operó nrdHIEF.En condicions normals, S. Typhimurium utilitza la RNR de la classe Ia per a la síntesi de novo de desoxirribonucleòtids en presència d'oxígen. La classe Ia és essencial per al seu creixement i la classe Ib no és capaç de complementar-ne la seva mutació a no ser que se li introdueixi una còpia extra. La presència de dues RNRs amb activitats redundants en un mateix microorganisme, el fet que en altres espècies bacterianes la síntesi de desoxirribonucleòtids en presència d'oxigen la dugui a terme la classe Ib, i que tant en E. coli com S. Typhimurium la classe Ib s'hagi conservat al llarg de l'evolució fa pensar que aquesta classe de RNR ha d'expressar-se en algunes condicions molt concretes de creixement.En aquest treball s'ha estudiat la participació de les RNRs en la virulència de S. Typhimurium SL1344 mitjançant la construcció de mutants de cada una de les tres classes així com de dobles mutants i mutants en els seus reguladors (Fur, NrdR). Mitjançant assajos d'infecció de línies cel·lulars de macròfags i també de cèl·lules epitelials hem intentat desvetllar quina de les RNRs és la responsable del creixement de S. Typhimurium durant el procés d'infecció. Els resultats obtinguts indiquen que la RNR responsable de la invasió i de la proliferació a l'interior de macròfags és la classe Ia, mentre que les classes Ib i III no semblen ser essencials. No obstant, observant el comportament de la soca mutant en la classe Ia que presenta la classe Ib sobreexpressada, durant les primeres hores d'infecció (2-6 h) sí que és capaç de sobreviure. Creiem que en aquesta etapa inicial de la infecció, quan es produeix l'explosió respiratoria, es generen unes condicions que activen l'expressió de l'operó nrdHIEF, possiblement la concentració de peròxid d'hidrogen és capaç d'inhibir l'activitat repressora de Fur. La gran demanda de dNTPs a causa del dany al DNA que s'està produint fa necessari un subministrament extra de dNTPs que aportarà la reductasa NrdEF. / Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) is a gram negative intracellular human pathogen causing gastroenteritis in humans as well as a systemic infection in mice similar to human typhoid fever (which is caused by S. Typhi). One of the main features of S. enterica infection is its capacity to actively invade epithelial cells and proliferate inside macrophages.S. Typhimurium presents three classes of ribonucleotide reductases (RNRs) in its genome: class Ia, class Ib and class III. RNRs are essential enzymes because they carry out the de novo synthesis of deoxyribonucleotides (dNTPs), needed for DNA synthesis and repair, by reducing ribonucleotides (NTPs). Up to date, three different classes of RNRs have been described, differing in their mechanism of radical generation, their three-dimensional structure, allosteric regulation and their oxygen dependence. Nevertheless, they all have in common the mechanism of reaction and the use of an organic free radical to initiate catalysis.This work has studied the transcriptional regulation of the three RNR classes present in S. Typhimurium, giving importance to two main regulators: NrdR and Fur. We have studied the effects of NrdR deletion in each class of RNR gene expression. Our results indicate that NrdR is a repressor of all three classes, but it shows a stronger repression when regulating nrdHIEF expression. We have also described NrdR recognition sites (NrdR boxes) and we have obtained mutant proteins in some residues that affect NrdR functionality in vivo, possibly due to their participation in dATP/ATP union.Mutation of Fur causes an upregulation of nrdHIEF expression up to five fold compared to the wild type strain. We have detected a putative Fur recognition sequence within the nrdHIEF promoter region. Mutation of this recognition sequence causes an upshift in nrdHIEF expression similar to the level observed in the fur mutant. Using electrophoretic mobility shift assays (EMSA) we have confirmed that Fur interacts with the nrdHIEF promoter region.Under normal conditions, S. Typhimurium uses class Ia RNR to de novo synthesize dNTPs in the presence of oxygen. Class Ia is essential for normal growth and class Ib is not able to complement its mutation unless an extra copy of nrdHIEF is introduced. The presence of two RNRs with redundant activities in the same organism, the fact that other bacterial species use class Ib for dNTP synthesis in then presence of oxygen, and that both E. coli and S. Typhimurium have retained class Ib enzymes during evolution, suggest that this class might be expressed under specific growth conditions.We have studied the role of RNRs in the virulence of S. Typhimurium SL1344 by means of different mutants and double mutants in each RNR class as well as mutants in their transcriptional regulators (Fur, NrdR). Infection assays performed in macrophage cell lines and epithelial cell lines have allowed to elucidate which RNR is responsible for S. Typhimurium growth during infection. Our results indicate that class Ia is the RNR responsible for invasion and proliferation inside macrophages, while class Ib and class III do not seem to be essential. However, class Ia mutants overexpressing class Ib are capable of surviving the first hours of infection (2-6 h). We think that is in this first stage of the infection process (when the oxidative burst takes place), specific conditions generate and activate nrdHIEF expression. It is possible that hydrogen peroxide concentrations are responsible for the inhibition of the Fur repressor activity. The highest demand of dNTPs due to DNA lesions makes it necessary for an extra dNTP supply that will be provided by the NrdEF enzyme.