Salmonella no tifoidea, uno de los patógenos zoonóticos de mayor impacto, causa brotes en humanos debido al consumo de alimentos contaminados, siendo las aves de corral su principal reservorio. A raíz de la prohibición del uso de antibióticos como promotores del crecimiento en producción animal, se han aplicado diferentes medidas, como el uso de vacunas, probióticos, prebióticos y simbióticos, para el control de Salmonella en aves con una eficacia todavía limitada. Por ello, se ha planteado el uso de la terapia fágica como un medio alternativo de control de Salmonella. Nuestro grupo demostró previamente que la terapia fágica oral, basada en un cóctel compuesto por los fagos UAB_Phi20, UAB_Phi78 y UAB_Phi87, reduce eficientemente la colonización de Salmonella en un modelo de pollo de engorde libre de patógenos específicos. Para completar la caracterización de estos fagos, en el presente trabajo se ha determinado que el inicio de la replicación del DNA del fago UAB_Phi78 se produce a los 10 min de la infección de Salmonella, siendo este tiempo de 20 min para los otros dos fagos. Se detectó DNA en células de Salmonella infectadas con los fagos UAB_Phi20 y UAB_Phi78 durante 40 min. Este tiempo fue de más de 120 min para el fago UAB_Phi87. Los extremos del cromosoma del bacteriófago UAB_Phi20 son permutaciones cíclicas y su mecanismo de empaquetamiento es el de llenado de cabeza de los fagos del género tipo P22. En cambio, los fagos UAB_Phi78 y UAB_Phi87 presentaron repeticiones terminales directas cortas en los extremos de sus cromosomas similares a las de los fagos de los géneros tipo SP6 (UAB_Phi78) y tipo FelixO1 (UAB_Phi87), respectivamente. Ninguno de los fagos fue capaz de promover transducción en las condiciones de ensayo utilizadas. Los retos inherentes a la terapia fágica oral están relacionados con la falta de estabilidad del fago en el estómago y su reducido período de residencia en el tracto gastrointestinal. En este trabajo se han desarrollado dos métodos de encapsulación de bacteriófagos (liposomas y alginato-CaCO3) y se ha estudiado si la terapia fágica con fagos encapsulados supera los inconvenientes indicados. Para este estudio, se ha desarrollado un modelo animal de experimentación (pollos de engorde/Salmonella) que mimetiza las condiciones de las granjas de producción. La encapsulación en lípidos catiónicos permitió obtener fagos encapsulados con un diámetro de 308,6 a 325,8 nm, una carga positiva entre 31,6 y 35,1 mV (pH 6,1) y una eficiencia de encapsulación cercana al 50%. El diámetro medio de los fagos encapsulados en alginato-CaCO3 varió entre 123,7 y 149,3 µm, con eficiencias de encapsulación superiores al 90%. Además, ambas formulaciones son estables a 4oC como mínimo 6 meses. En fluido gástrico simulado (pH2,8), el título de los fagos sin encapsular disminuyó entre 5,7 y 8 log10 tras 60 min, mientras que el de los fagos encapsulados en liposomas y alginato-CaCO3 sólo disminuyó entre 3,7 y 5,4 log10 y ≤3,5 log10, respectivamente. Los fagos encapsulados en liposomas o alginato-CaCO3 se detectaron, respectivamente, en el 38,1% y el 71,4% de los animales a las 72 h y sólo en un 9,5% de los animales tratados con fagos no encapsulados. Además, el contenido cecal y el fluido intestinal simulado promueven la liberación de los fagos de las cápsulas lipídicas y de alginato-CaCO3, respectivamente. Finalmente, en experimentos de terapia fágica, la disminución de la concentración de Salmonella se prolongó como mínimo 7 días más en los animales tratados con fagos encapsulados que en los tratados con fagos no encapsulados tras la interrupción del tratamiento. La metodología utilizada permite la encapsulación de bacteriófagos de diferentes morfologías en liposomas y alginato-CaCO3 y muestra que la encapsulación mejora significativamente la terapia fágica oral. / Non-typhoidal Salmonella, one of the most common zoonotic pathogens, causes foodborne disease outbreaks in humans. Poultry is the major reservoir of this bacterium. Following the ban on the use of antibiotics as growth promoters in animal production, Salmonella infection in poultry has been mainly controlled through biosafety measures implemented in animal production facilities and through the use of vaccines, probiotics, prebiotics, and synbiotics. Although reduction in the prevalence of several Salmonella serovars was achieved between 2007 and 2012 in the European Union, these methods are insufficient such that phage therapy has gained increasing attention for Salmonella control. In previous work, we demonstrated that oral phage therapy using a cocktail containing three bacteriophages (UAB_Phi20, UAB_Phi78, and UAB_Phi87) very efficiently reduces Salmonella colonization in specific pathogen free chickens. To better understand the efficacy and safety of these phages, we characterized their replication kinetics, genome ends, and transduction capability. The results showed that DNA replication was initiated 10 min after bacterial infection by UAB_Phi78 and 20 min after infection by UAB_Phi20 and UAB_Phi87. UAB_Phi20 and UAB_Phi78 DNA was detected inside the cells for 40 min and that of UAB_Phi87 for >120 min. The genome ends of the three phages differed and were included in specific DNA packaging strategies: P22likevirus headful (UAB_Phi20), SP6likevirus direct terminal repeats (UAB_Phi78), and Felixounalikevirus direct terminal repeats (UAB_Phi87). None was able to promote transduction under the conditions of the assay used. The inherent challenges to the oral administration of bacteriophages as therapeutic agents against intestinal pathogens are related to the lack of phage stability in the stomach and the short residence time in the intestinal tract, which together lower the efficiency of phage therapy. In this work, two methods for phage encapsulation have been developed. The advantages of phage therapy with the encapsulated phages has been studied in an animal model (broiler/Salmonella) developed in this work that mimics the conditions of the farms. Encapsulation in cationic lipids yielded liposome-encapsulated phages with a mean diameter of 308.6 - 325.8 nm, a positive charge between +31.6 and +35.1 mV (pH 6.1), and an encapsulation efficiency yield of ~50%. In comparison, the mean diameter of the alginate-encapsulated phages ranged from 123.7 to 149.3 μm and the encapsulation efficiencies were >90%. The two phage formulations are stable for ≥6 months when stored at 4°C. The titre of non-encapsulated phages in simulated gastric fluid (pH 2.8) decreased by 5.7–8.0 log10 after 60 min, whereas liposome- and alginate-encapsulated phages were significantly more stable, with losses of 3.7–5.4 log10 units and ≤3.5 log10, respectively. Liposome and alginate-CaCO3 encapsulations also significantly improved bacteriophage retention in the chicken intestinal tract compared to the non-encapsulated preparations. In broilers administered cocktails of encapsulated and non-encapsulated phages, the former were detected in 38.1% (liposome) and 71.4% (alginate-CaCO3) of the animals after 72 h whereas the non-encapsulated phages were present in only 9.5%. In in vitro experiments, phage release from the liposomes and alginate-CaCO3 capsules was triggered by the caecal contents of broilers and simulated intestinal fluid, respectively. In commercial broilers experimentally infected with Salmonella, daily administration of the three cocktails for 7 days post-infection conferred similar levels of protection against Salmonella colonization. Although protection by the non-encapsulated phages disappeared once treatment was stopped, the decrease of the Salmonella concentration provided by both encapsulated forms persisted for at least another week, thus showing the enhanced efficacy of encapsulated phages in phage therapy. The work describes the methodology used to obtain liposome and alginate-CaCO3 phage encapsulation, which can be used with bacteriophages of different morphologies, and the advantages of both forms in overcoming the inherent drawbacks of orally administered phage therapy.

En les últimes dècades Staphylococcus aureus s’ha consolidat com un dels microorganismes amb més capacitat de causar infeccions, donant lloc des de malalties lleus i localitzades, de curs benigne, fins a infeccions greus, disseminades, amb elevada mortalitat. En aquesta tesi, s’han abordat tant aspectes clínics i epidemiològics dels pacients amb infeccions documentades per S.aureus, en especial bacterièmia i infeccions de pell i parts toves, com aspectes relacionats amb el patogen. En aquest últim apartat, s’ha estudiat l’epidemiologia molecular de les soques, factors de virulència i alguns tests fenotípics que ens ajudaran a mesurar la seva expressió. Es van incloure un total de 293 bacterièmies per S.aureus. La fagotipia va permetre tipar el 37.5% de les soques SARM i el 43.3% dels SASM. La detecció del gen mecA va resultar positiva en 28 soques, en concordança amb les dades obtingudes de la sensibilitat antibiòtica per CMI. En l’anàlisi del tipus SCCmec de les soques SARM, 27 d’elles corresponien al SCCmecIVc i només una presentava el tipus SCCmec IVa i ACME negatiu. Mitjançant spa typing es va demostrar el predomini d’un grup clonal, CC002 (31%) englobant dos spa tipus predominants: t002, t067 en soques SASM i el predomini de CC067 (37.14%) incloent els spa tipus t0067 i t002 en SARM. Comparant els patrons d’electroforesi en camp polsant es van agrupar les soques SARM en les clones E7 i E8, també les més prevalents en el nostre medi. En l’estudi mitjançant microarrays de 102 d’aquestes soques es va observar un predomini del CC5 (38.2%), seguit del CC30 (21.6%). La distribució dels perfils al·lèlics del sistema regulador agr mostrava un predomini del agr II (46.1%). La mortalitat de la sèpsia per S.aureus es relaciona amb la susceptibilitat de l’hoste, característiques de la soca, característiques epidemiològiques i amb el temps transcorregut fins a l’inici d’un tractament antibiòtic adequat. Així, l’estudi de mètodes ràpids per la identificació i la detecció de sensibilitat a cloxacil·lina ( BinaxNow S.aureus / PBP 2a Test, GenomEra MRSA/SA Blood Culture, MicroPhage MRSA/MSSA Blood Culture Test) ens ha permès adequar el tractament antibiòtic en un 79.25% dels casos. L’origen de la bacterièmia en el 58’4% dels casos era nosocomial i el 45.7% d’origen en el catèter. El 80% dels malalts presentaven comorbiditats associades: 35.5% neoplàsia, 30.4% DM, 14% IRC i 13.7% tractament previ amb immunosupressor. Una quarta part van presentar bacterièmia complicada, i un 8.5% bacterièmia persistent. . D’altra banda, les infeccions de pell i parts toves per S.aureus resistents a meticil·lina d’origen comunitari (CA-SARM) representen al voltant del 20% en el nostre medi. La tipificació molecular d’aquestes soques va permetre demostrar que la majoria pertanyien a la soca USA300-ST8-SCCmec IVc i ACME negativa, variant de la clona USA300 (USA300-ST8-SCCmec IVa). No es va trobar cap associació entre la soca productora i la nacionalitat dels pacients. Les manifestacions clíniques dels pacients eren lleus i sense presència de complicacions, tant en els SASM com SARM. L’elevada prevalença de la Leucocidina de Panton Valentine (PVL) en soques SASM o SARM i la bona evolució, tot i el tractament antibiòtic inadequat, es correlaciona amb la hipòtesi que independentment de la sensibilitat antibiòtica, el drenatge de la lesió és necessari per la resolució de la infecció i posa de manifest la difícil valoració del paper de factors de virulència com la PVL en la patogènia d’aquestes infeccions. / In recent decades, Staphylococcus aureus has become an important human pathogen causing a wide variety of diseases, ranging from uncomplicated infections to life-threatening septicaemia, thus leading to significant morbidity and mortality. This thesis recorded clinical and epidemiological characteristics from patients with S.aureus infections, especially bacteremia and skin-soft tissue infections as well as microorganism related factors. The second aim was to investigate the molecular typing and to characterize the virulence factors of S. aureus isolates and some phenotypic assays for its measurement. A total of 293 patients with bacteremia were included. Phage typing allowed to type the 37.5 % of MRSA strains and 43.3 % of MSSA. Regarding molecular characterization, mecA was detected in 28 strains, in accordance with the data of antibiotic susceptibility testing by microdilution method. SCCmec typing of SARM isolates showed that 27 of these were carrying SCCmecIVc and only in one case was found SCCmec IVa and ACME negative. Spa typing revealed the prevalent clonal complex CC002 (31%), enclosing two predominant spa types: t002, t067 in MSSA while the clonal complex CC067 (37.14%) including spa types t0067 and t002 was the predominant in MRSA strains. Genotyping by pulsed-field gel electrophoresis of these SARM strains grouped into two genotypes, E7 and E8. These profiles are the predominant clones in Spain. The application of microarrays for genotyping reflected that the most frequent CC was CC5 (38.2%) followed by CC30 (21.6%). Concerning the agr types, most isolates presented agr II (46.1%). Increased frequency of bacteraemia and maintenance of mortality rates are related to the susceptibility of the host, strain-specific features, epidemiological characteristics and the time from microbiological diagnosis to the starting of appropriate antibiotic treatment. The study of three diagnostic methods: BinaxNow S.aureus /MRSA PBP2, MicroPhage MRSA/ MSSA Blood Culture Test and GenomEra MRSA /SA Blood Culture for the direct identification and susceptibility S. aureus testing directly from positive blood cultures, allowed the early administration of appropriate antibiotic treatment in 79.25% of the cases. The origin of the bacteraemia was nosocomial in 58’4% of the cases and 45.7% were catheter related. Comorbidities were present in 80% of patients, being the most frequent neoplasia (35.5%), followed by diabetes mellitus (30.4%), end stage renal disease (14%) and immunosuppressive treatment (13.7%). Development of complications was present around 25% of the cases, and 8.5% of patients developed persistent bacteraemia. On the other hand, Community-Acquired methicillin resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA) causes approximately 20% of skin-soft tissue infections. A specific clone of CA-SARM, USA300-ST8-SCCmec IVc and characteristically lacking the ACME was the most prevalent in our environment, similar to USA300 (USA300-ST8-SCCmec Iva). We did not find any association between strain characteristics and nationality of the patients. All our patients presented an uncomplicated infection, both when MSSA and MRSA. In our study we reported a high prevalence of Panton Valentine leukocidin (PVL) producers among MSSA and MRSA and all patients presented a favourable outcome even though inappropriate antibiotic treatment was prescribed empirically. It is considered that the treatment of choice for these infections, irrespective of antibiotic susceptibility, is incision and drainage. The real pathogenic role of PVL it is still a subject of controversy, arising from results obtained from clinical studies.

Pendent Resums

La sepsis es la respuesta inflamatoria del organismo frente a la invasión del torrente circulatorio de un patógeno, que desemboca en una disfunción orgánica. En las dos últimas décadas, se ha observado un incremento en la incidencia, probablemente atribuido al envejecimiento de la población, así como, a la aplicación de maniobras diagnósticas y terapéuticas cada vez más complejas y agresivas. Sigue presentando una elevada mortalidad, a pesar de las continuas mejoras que se han producido en la asistencia sanitaria, superando otras enfermedades de gran impacto social, como las neoplasias o el infarto agudo de miocardio. El diagnóstico clínico de la sepsis es de vital importancia para el correcto manejo y evolución del paciente. Pero también es imprescindible disponer de métodos de laboratorio que nos permitan detectar y aislar, lo más rápidamente posible, el microorganismo responsable del proceso infeccioso y estudiar su sensibilidad a los antibióticos, ya que la administración y adecuación precoz de la cobertura antibiótica empírica reduce la mortalidad en un 10%, en pacientes con sepsis grave o shock séptico. Actualmente, la técnica de referencia para el diagnóstico microbiológico de la sepsis es el hemocultivo, seguido de los métodos convencionales de identificación y antibiograma. Todo este proceso puede tardar hasta 48-65 horas, lo que implica un retraso en el inicio de una terapia antibiótica precoz y efectiva. Esto conlleva la necesidad de mejorar los preocedimientos de tal manera que se acorten significativamente los tiempos requeridos para la emisión de los informes sobre el agente causal de la sepsis. En esta tesis se han evaluado dos nuevos protocolos que permiten la inoculación directa de los paneles del sistema Vitek-2 compact para identificación y antibiograma de bacilos gramnegativos y cocos grampositivos, a partir de inóculos bacterianos obtenidos directamente de frascos de hemocultivo positivo, que contienen carbón activado. Con estos métodos, la concordancia global en el estudio de la sensibilidad antibiótica ha sido superior al 95% con respecto al método convencional. Además, proporciona resultados precisos de identificación y antibiograma en un tiempo medio de unas 6 horas para bacilos gramnegativos y 9 horas para cocos grampositivos. Con esta información podemos dar resultados definitivos en sólo 24 horas desde la extracción del hemocultivo. El mismo protocolo se ha evaluado aplicado a los hemocultivos pediátricos, obteniendo una concordancia, respecto al método de referencia, superior al 99% sin obtenerse ningún error muy grave. Otro objectivo ha sido es estudiar el impacto clínico que supone la información rápida y personalizada de los resultados obtenidos por el sistema Vitek-2 directamente de hemocultivo positivo, tanto en la población adulta como pediátrica. Este hecho, comportó un cambio en las decisiones terapéuticas por parte del clínico, en más del 50% de los episodios de bacteriemia en adultos, y en el 65’6% de los pacientes pediátricos, ya fuese por el inicio de un tratamiento antibiótico o por el cambio a un tratamiento adecuado. Probablemente, debido al aumento progresivo de la resistencia microbiana a los antibióticos, durante el período de estudio se ha observado un descenso en el porcentaje de episodios de sepsis en que el tratamiento empírico podía considerarse el de elección, y paralelamente se ha producido un incremento en el porcentaje en que la información rápida y personalizada ha permitido cambiar un tratamiento que no cubría al microorganismo implicado, por uno efectivo. Por lo que el sistema Vitek-2 compact ha permitido adelantar la toma de decisiones y modificar conductas terapéuticas o las relacionadas con la aplicación de medidas de control de infección. Por lo tanto, la transmisión inmediata y personalizada al médico responsable del paciente, de la información obtenida del hemocultivo positivo, tanto de la tinción de Gram como de los resultados de identificación y antibiograma, permite orientar de forma rápida y adecuada el tratamiento antibiótico, evitando las consecuencias de una terapia incorrecta y/o tardía. / Septicaemia is an inflammatory response mounted against invasion of the vascular space by pathogenic organisms, which frequently leads to organ failure. Incidence of Septicaemia has increased over the last two decades, probably due to an ageing population and the increased use of complex and invasive techniques for both diagnosis and treatment of disease. Mortality in septicaemia continues to be high despite improvements in healthcare, surpassing that of other diseases with high social impacts such as neoplasias or acute myocardial infarction. Accurate diagnosis of septicaemia is essential if it is to be treated correctly and patient survival improved. Key components of this diagnostic arsenal are laboratory tools and methods that allow rapid detection and isolation of causative pathogens and the characterisation of their antibiotic resistance profiles because rapid administration of empirical antimicrobial therapy and its timely adjustment to susceptibility testing can reduce mortality by up to 10% in patients with severe sepsis or septic shock. The current gold standard in the diagnosis of septicaemia is blood culture, using conventional methods of isolation, identification and susceptibility testing. This process may take up to 48-65 hours, delaying the rapid initiation of effective and appropriate antibiotic therapy. There is, therefore, considerable scope for shortening the time it takes to issue a full report on the organism causing the septicaemia. This thesis has evaluated two new protocols to carry out identification and susceptibility testing of Gram positive and Gram negative organisms. Inoculates are obtained from positive blood culture bottles that contain activated charcoal and these are used to directly inoculate panels of the Vitek-2 compact system. Using these techniques in the study of antimicrobial susceptibility, global concordance with conventional methods exceeded 95%. In addition, the mean time take to obtain precise identification and susceptibility results was six hours for Gram-positive and nine hours for Gram-negative organisms. Total time taken, therefore, to provide definitive results was under 24 hours from the time blood cultures were taken. This same protocol has been evaluated for paediatric blood cultures, obtaining concordance with conventional methods in excess of 99% and with no serious errors. An additional objective was to study the impact on adult and paediatric clinical practice of this rapid, specific information obtained using the direct inoculation of the Vitek-2 system from positive blood cultures. The availability of this information resulted in changed clinical decisions in over 50% of adult bacteraemias and 65% of paediatric bacteraemias, whether in the choice of initial therapy or change of antibiotic on the basis of susceptibility testing. During the study period, there was a decrease in the proportion of sepsis episodes in which empirical antimicrobial therapy was well-matched to susceptibilities on testing, most likely due to increased antimicrobial resistance. At the same time, we observed an increase in the proportion of episodes in which the rapid availability of microbiology reports allowed the modification of antimicrobial regimens when the causative organism was resistant to empirical therapy. We infer that the Vitek-2 system contributed to quicker clinical choices of appropriate antimicrobial therapy, regimen modification and infection control measures to be implemented. In conclusion, clinicians who have access to rapid, specific microbiology reports on blood cultures, including Gram stain, identification and susceptibility testing, are able to rapidly tailor antimicrobial therapy to the precise needs of their patients, avoiding the consequences of incorrect or delayed treatment of septicaemia.

L’α-galactosidasa A humana (GLA) pertany a la família d’hidrolases lisosomals involucrades en malalties d’emmagatzemat enzimàtic (MEEs). Les teràpies de reemplaçament enzimàtic (TREs), basades en l’administració de l’enzim disfuncional, són una mesura eficient per alentir l’avanç d’algunes MEEs. Tanmateix, el cost de les TREs disponibles actualment es extremadament elevat. Per tant, es proposa com a solució l’ús de sistemes de producció alternatius. P. pastoris és un sistema prometedor per la producció de productes terapèutic biològics, tot i que el seu patró de glicosilació ha de ser adaptat per a aquest ús. GLA, involucrat en la malaltia de Fabry, és l’enzim seleccionat per Bioingenium per avaluar la viabilitat del llevat per produir hidrolases lisosomals, i en tal cas, per al seu ús com a proteïna model per a la modificació del patró de glicosilació P. pastoris. En primer lloc, es va avaluar l’expressió GLA recombinant (rhGLA) en diferents soques de P. pastoris. Un cop seleccionada la més adient, els nivells d’expressió és van millorar mitjançant la sobreexpressió de HAC1p, un activador transcripcional. A continuació, es va optimitzar la productivitat específica de rhGLA mitjançant el clonatge de múltiples còpies del gen codificant. En conjunt, es va aconseguir millorar 7 vegades la productivitat comparat amb els valors inicials. Addicionalment, es van expressar amb èxit variants de l’enzim amb tag, amb un domini d’internalització cel·lular, o mancat d’una seqüència C-terminal. En darrer lloc, es va obtenir un clon lliure de marcadors de resistència per al seu ús com a soca base per la modificació del patró de glicosilació. Es va establir un procés escalable de producció en bioreactor basat en condicions d’O2 limitant, permetent la producció d’elevades quantitats d’enzim. A més, es van desenvolupar mètodes cromatogràfics per a l’aïllament de rhGLA. En concret, s’ha descrit un procés basat en 3 passos cromatogràfics per la purificació de quantitats significants d’enzim lliure de tag, així com procediments de cromatografia d’afinitat per la purificació de petites quantitats de variants de rhGLA destinades a ser caracteritzades. Finalment, s’ha implementat un conjunt de tècniques per la caracterització de l’enzim, incloent anàlisis de glicans i assajos in vitro. Mitjançant l’ús de fibroblasts provinents d’un pacient de Fabry, s’ha pogut valorar amb simplicitat la eficiència d’internalització de l’enzim recombinant. Tal i com s’esperava, la rhGLA amb estructures de glicosilació pròpies de llevat va mostrar nivells d’internalització pobres. En general, s’ha demostrat que P. pastoris és un sistema d’expressió adequat per a la producció de rhGLA. Els mètodes desenvolupats en aquest treball són de gran valor per futures investigacions relacionades amb la humanització dels patrons de glicosilació de P. pastoris. A més, els resultats són d’utilitat per l’escalat dels processos de producció, que habilitaran el llevat per la producció de diferents enzims lisosomals destinats a l’ús en TREs. / Human α-galactosidase A (GLA) belongs to the family of lysosomal hydrolases involved in lysosomal storage diseases (LSDs). Enzyme replacement therapies (ERTs), based on the administration of the recombinant missing enzyme, are an efficient measure to slow the advance of some LSDs. However, the cost of currently available ERTs is extraordinarily high. Therefore, the use of alternative production systems is proposed as a solution. P. pastoris is a promising system for the production of biopharmaceuticals, even though its glycosylation pattern needs to be engineered for such purpose. GLA, involved in Fabry disease, is the enzyme selected by Bioingenium to evaluate the feasibility of the yeast to produce human lysosomal hydrolases and, if so, to use it as the model protein in strain glycoengineering. First, the expression of recombinant human GLA (rhGLA) in P. pastoris was evaluated in different strains. Once selected the most suitable one, the expression levels were significantly improved by overexpression of HAC1p, a transcriptional activator. Then, the specific productivity of rhGLA was optimized by cloning multiple copies of the coding gene. Overall, the productivity was improved about 7-fold compared to the initial. Additionally, variants of the enzyme containing a tag, a cell internalization motif or lacking a C-terminal sequence were successfully expressed. Lastly, a markerless clone expressing rhGLA was generated for its use as a base strain for glycan modification. A scalable bioreactor process based on O2-limiting conditions has been established for the production of high quantities of the enzyme. Moreover, purification methods have been developed for the isolation rhGLA. Specifically, a 3-step chromatography process is described for the purification of significant amounts of untagged enzyme, while affinity-chromatography procedures were defined for the fast isolation of small amounts of rhGLA variants aimed for product characterization. Finally, a set of analytical methods have been implemented for the characterization of rhGLA, including glycan analysis and in vitro assays. By using fibroblasts from a Fabry patient, the uptake efficiency of the recombinant enzyme could be easily assessed. As expected, the rhGLA having yeast-like glycans showed poor internalization levels. Overall, P. pastoris has been shown as a suitable production system for rhGLA. The methods developed in this work are of great value for future strain glycoengineering and production scale-up, which will ultimately qualify the yeast for the production of different lysosomal enzymes for ERTs.

La carbapenemasa OXA-48 esta àmpliament estesa arreu del món i principalment en Enterobacteriaceae. A Catalunya, Klebsiella pneumoniae productora de la carbapenemasa OXA-48 es va detectar per primer cop al 2009, i des d’aleshores semblava observar-se un cert increment. L’observació d’aquest increment per part de diferents hospitals fou la raó per a iniciar aquest estudi multicèntric que inclou 11 hospitals comarcals i l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau i que té com a principal objectiu la caracterització, tant a nivell epidemiològic com molecular, de les soques de K. pneumoniae productores d’OXA-48 aïllades al llarg del 2012. En l’estudi es van incloure totes aquelles soques de K. pneumoniae que presentaven un fenotip de resistència als antibiòtics betalactàmics diferent al patró natural esperat. A les soques seleccionades se’ls hi va realitzar el test de Hodge modificat (THM) per poder evidenciar la presència de qualsevol enzim amb activitat enfront els carbapenèmics. D’un total de 3.901 soques de K. pneumoniae aïllades, 171 (4,4%) van ser positives per al THM. Per PCR es van confirmar com a portadores de l’OXA-48 85 soques (49,7%). El vuitanta nou percent de les 85 soques productores de l’OXA-48 coexpressaven la BLEA CTX-M-15, acompanyada o no d’OXA-1 i/o TEM-1. Es va estudiar la clonalitat d’aquestes 85 soques per macrorestricció genòmica (PFGE) i MultiLocus Sequencing Type (MLST). Per PFGE es varen observar cinc clones: A, B, C, D i E; que es van correlacionar perfectament amb les cinc seqüència tipus trobades: ST101, ST17, ST1233, ST14 i ST405. La ST1233 va ser descrita per primer cop en aquest estudi. El gen blaOXA-48 es trobat situat en un plasmidi conjugatiu del grup d’incompatibilitat IncL, (62 Kb aprox) i localitzat majoritàriament en Tn1999.2 (91,7%). Es va descartar que la resta de betalactamases trobades estiguessin en aquest plasmidi. De les 85 soques productores d’OXA-48, 75 (88,23%) tenien el gen qnrB. També es varen estudiar els gens implicats en la resistència enzimàtica als aminoglicòsids. De les 85 soques estudiades, 82 es mostraren resistents a algun dels aminoglicòsid estudiats, El fenotip majoritari, va ser la resistència a kanamicina, tobramicina i gentamicina (KTG) i s’explica per la presència dels gens aac(3’)-IIa (KTGN) i aac(6)-Ib (KTAN). Es van observat que soques genèticament relacionades (igual PFGE, ST i presencia dels mateixos gens de resistència) presentaven nivells de resistència diferents. Aquestes diferencies no es varen poder associar a l’activació de bombes d’expulsió AcrAB ni alteracions de les porines estudiades. Els resultats obtinguts per les tècniques clàssiques (PCR, Seqüenciació, PFGE i MLST) van ser comparats en 37 soques amb la nova tècnica de la seqüenciació massiva del genoma microbià (Whole Genome Sequencing: WGS) i el cgMLST (core genome MultiLocus Sequence Typing). Es resultats mostraren una bona correlació entre PFGE-MLST i cgMLST. A l’introduir les seqüències obtingudes pel WGS als webs PlasmidFinder i al ResFinder, vàrem poder identificar plasmidis recentment tipificats i la presència d’altres gens de resistència, com: strA/strB, oqxA/oqxB ,drfA, sul2, fosA, catB3, tet(A) i tet(D). Amb les seqüències obtingudes per WGS també es va obtenir les seqüències de les dianes d’acció de les quinolones, els QRDR. Nomes es varen detectar alteracions en les tres soques del ST101. En conclusió, l’increment de la prevalença de K. pneumoniae portadora d’OXA-48 a Catalunya es deu a la presència en tots els hospitals on s’han aïllat aquestes soques de l’expansió de les clones ST405 i ST101. No havent-hi trobat diferencies en l’entorn genètic del gen que es el mateix que s’ha anat a descrivint arreu. Per altra banda, podem afirmar que la WGS és una bona eina per a la descripció epidemiològica i molecular de brots produïts per a soques multiresistents. / The OXA-48 carbapenemase is widely spread around the world and found mainly in Enterobacteriaceae. In Catalonia, OXA-48-producing Klebsiella pneumoniae was first detected in 2009, since then, a growing prevalence has been observed in different hospitals, which prompted the aim of this multicenter study, which includes 11 regional hospitals and the Hospital de Santa Creu i Sant Pau, is the characterization, both epidemiological and molecular, of OXA-48–producing K. pneumoniae strains isolated throughout 2012. The study included all K. pneumoniae strains with an unusual pattern of resistance to beta-lactam antibiotics. Selected strains underwent a modified Hodge test (MHT) to detect any enzyme activity against carbapenemics. A total of 3,901 K. pneumoniae strains, 171 MHT-positive strains (4.4%) were selected. PCR confirmed that 85 strains carried OXA-48 (49.7%). Eighty nine percent of the 85 OXA-48–producing strains coexpressed the ESBL CTX-M-15, with or without beta-lactamases OXA-1 and TEM-1. The clonality of these 85 OXA-48–producing strains was studied by macrorestriction analysis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST). Five clones were observed by PFGE: A, B, C, D and E. These five clones were perfectly correlated with the five sequence types found, ST101, ST17I, ST1233, ST14 and ST405. ST1233 is described for the first time in this study. The blaOXA-48 gene was found in a conjugative plasmid of incompatibility group IncL (aprox. 62 Kb) and located in Tn1999.2 (91.7%). The other beta-lactamase genes of these strains were not found in this plasmid. Of the 85 OXA-48–producing strains, 75 (88.23%) harboured the qnrB gene. Genes involved in enzyme-mediated resistance against aminoglycosides were also studied. Of the 85 OXA-48–producing strains, 82 showed resistance to some of the aminoglycosides studied. The major phenotype showed resistance to kanamycin, gentamicin and tobramycin (KTG), and it was explained by the presence of aac(3')-IIa (KTGN) and aac(6’)-Ib (KTAN) genes. We observed that genetically related strains (that is, closely related PFGE, identical ST and the presence of the same resistance genes) showed different levels of resistance. These differences couldn’t be due to alterations in the expression of the efflux pump AcrAB or in porins. Results obtained by classical techniques (PCR, sequencing, PFGE and MLST) in 37 strains selected were compared with those of the new techniques of massive sequencing of microbial genomes (Whole Genome Sequencing: WGS) and cgMLST (core genome MultiLocus Sequence Typing). A good correlation was found between PFGE-MLST and cgMLST, and four strains were identical by cgMLST but not by PFGE. After uploading the sequences obtained by WGS to the PlasmidFinder and ResFinder online search tools, we were able to identify recently classified plasmids and determine the presence of other resistance genes, such as: strA / strB, oqxA / oqxB, drfA, sul2, fosA, catB3, tet(A) and tet(D). The use of WGS allowed us to obtain sequences of the targets of the quinolones, the QRDR. Surprisingly, only alterations described as responsible for this resistance were detected in all three ST101 strains. In conclusion, the increase in the prevalence of OXA-48-carrying K. pneumoniae in Catalonia is due to the expansion of the ST405 and ST101 clones in all hospitals where strains were isolated. No differences in the genetic background of the blaOXA-48 gene were found, as reported elsewhere. Moreover, WGS was found to be a useful tool for the molecular and epidemiological analysis of outbreaks caused by multidrug-resistant strains.

En el treball que es presenta, es va realitzar un estudi retrospectiu analitzat les candidèmies diagnosticades al llarg de 15 anys en el servei de Microbiologia de l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona. S’avaluà la implicació de C. parapsilosis complex com agent causal de candidèmia, la seva distribució percentual segons les altres especies de Candida i en funció de l’edat del pacient, així com la seva evolució al llarg dels anys i la prevalença de les tres especies del complexa: C. parapsilosis sensu stricto, C. orthopsilosis i C. metapsilosis. Es va estudiar la seva sensibilitat enfront els nou antifúngics d’ús sistèmic actualment aprovats i es van analitzar els possibles mecanismes de resistència intrínseca i adquirida a les equinocandines. C. parapsilosis complex va resultar ser la segona espècie més freqüent causant de fungèmia (20%), davant de C. tropicalis (14,4%) i C. glabrata (11,7%) i només darrera de C. albicans (43,1%). Amb una incidència molt més elevada en els pacients pediàtrics (≤ 1 any: 66.7%; 2-14 anys: 50%). Durant aquest període, la seva incidència augmentà lleugerament (0,33%/any). Els estudis de sensibilitat van mostrar una excel·lent activitat dels 9 antifúngics avaluats enfront a la gran majoria dels aïllats, i només en el cas del itraconazol es detectà un percentatge considerable de soques no sensibles (23%). El percentatge de soques no sensibles a equinocandines fou baix (1,5%) i la caspofungina fou l‘equinocandina més eficaç enfront a C. parapsilosis. Per estudiar els mecanismes de resistència a les equinocandines, es van analitzar els gens FKS1 i FKS2, que codifiquen per la β-(1,3)-D-glucá sintetasa i es va analitzar la possible activació de respostes adaptatives enfront a l’acció de les equinocandines. Detectant-se una freqüència relativament baixa de mutacions adquirides en el gen FKS1 (11/78 aïllats) totes elles localitzades fora de la regió HS i cap en el gen FKS2. Només es va detectar una mutació (F1386S) en un dels 6 aïllats no sensibles a equinocandines, situada fora de les regions HS, que podria estar associada amb el fenotip de resistència a les equinocandines. El contingut basal de quitina de la paret cel·lular era molt similar en les soques sensibles (7,79%) i no sensibles (8,14%) a equinocandines, igual que en les tres espècies del complexa, però notablement superior al de la soca control de C. albicans (4,61%). La gran majoria d’aïllats van incrementar el contingut basal de quitina entre 1-3% després del tractament amb caspofungina, a excepció dels dos aïllats de C. parapsilosis amb major resistència a les equinocandines, que el van incrementar en un 7 i un 11%. Val a dir que aquests dos aïllats van ser els que mostraren els nivells basals de quitina més baixos i un d’ells va presentar la mutació F1386S. Tot això podria suggerir una resposta compensatòria d’increment en la producció de quitina, com a conseqüència de la inhibició de la síntesi del β-(1,3)-D-glucá causada per les equinocandines, que podria estar implicada en els mecanismes de resistència adquirida a aquests antifúngics. / En el trabajo que se presenta, se realizó un estudio retrospectivo analizando las candidemias diagnosticadas a lo largo de 15 años en el servicio de Microbiología del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona. Se evaluó la implicación del complejo C. parapsilosis como agente causal de candidemia, su distribución porcentual según las otras especies de Candida y en función de la edad del paciente, así como su evolución a lo largo de los años y la prevalencia de las tres especies del complejo: C. parapsilosis sensu stricto, C. orthopsilosis y C. metapsilosis. Se estudió su sensibilidad frente a los nueve antifúngicos de uso sistémico actualmente aprobados y se analizaron los posibles mecanismos de resistencia intrínseca y adquirida a las equinocandinas. C. parapsilosis complex resultó ser la segunda especie más frecuente causante de fungemia (20%), delante de C. tropicalis (14,4%) y C. glabrata (11,7%) y solo detrás de C. albicans (43,1%). Con una incidencia mucho más elevada en los pacientes pediátricos (≤ 1 año: 66.7%; 2-14 años: 50%). Durante este periodo, su incidencia aumentó ligeramente (0,33%/año). Los estudios de sensibilidad mostraron una excelente actividad de los 9 antifúngicos evaluados frente a la gran mayoría de los aislados, y solo en el caso del itraconazol se detectó un porcentaje considerable de cepas no sensibles (23%). El porcentaje de cepas no sensibles a equinocandinas fue bajo (1,5%) y la caspofungina fue la equinocandina más eficaz frente a C. parapsilosis. Para estudiar los mecanismos de resistencia a las equinocandinas, se analizaron los genes FKS1 y FKS2, que codifican para la β-(1,3)-D-glucano sintetasa y se analizó la posible activación de respuestas adaptativas frente a la acción de las equinocandinas. Detectándose una frecuencia relativamente baja de mutaciones adquiridas en el gen FKS1 (11/78 aislados) todas ellas localizadas fuera de la región HS y ninguna en el gen FKS2. Solo se detectó una mutación (F1386S) en uno de los 6 aislados no sensibles a las equinocandinas, fuera de las regiones HS, que podría estar asociada con el fenotipo de resistencia a las equinocandinas. El contenido basal de quitina de la pared celular era muy similar en las cepas sensibles (7,79%) y no sensibles (8,14%) a equinocandinas, al igual que en las tres especies del complejo, pero notablemente superior al de la cepa control de C. albicans (4,61%). La gran mayoría de aislados incrementaron el contenido basal de quitina entre 1-3% después del tratamiento con caspofungina, a excepción de los dos aislados de C. parapsilosis con mayor resistencia a las equinocandinas, que lo incrementaron en un 7 y un 11%. Cabe decir que estos dos aislados fueron los que mostraron los niveles basales de quitina más bajos y uno de ellos presentó la mutación F1386S. Todo esto, podría sugerir una respuesta compensatoria de incremento en la producción de quitina, como consecuencia de la inhibición de la síntesis del β-(1,3)-D-glucano causada por las equinocandinas, que podría estar implicada en los mecanismos de resistencia adquirida a estos antifúngicos. / In the study presented, a retrospective study was carried out in which the diagnosed candidemias were analysed over a 15-year period in the Microbiology Service of the Hospital de la Santa Creu i Sant Pau in Barcelona. The implication of C. parapsilosis complex as a causal agent of candidemia was evaluated, and also their percentage distribution according to other Candida species and their prevalence according to patient's age, as well as their evolution over the years and the prevalence of the three species comprising the complex: C. parapsilosis sensu stricto, C. orthopsilosis and C. metapsilosis. The susceptibility of C. parapsilosis to the nine antifungal approved systemic agents and their possible resistance mechanism, both intrinsic and acquired, to echinocandins was also studied. C. parapsilosis complex was the second most common species causing fungemia (20%), ahead of C. tropicalis (14.4%) and C. glabrata (11.7%) and only behind C. albicans (43.1%). A much higher incidence is shown in paediatric patients (≤ 1 year: 66.7%; 2-14 year: 50%). During this period its incidence increased slightly over the years (0.33% per year). The susceptibility studies showed an excellent activity of the 9 antifungal agents tested against almost all the isolates, and only in the case of itraconazole, a considerably percentage of non-susceptible strains (23%) was detected. The percentage of echinocandin non-susceptible strains was low (1.5%) and caspofungin was the most active echinocandin against C. parapsilosis. To study the resistance mechanism against echinocandins, the FKS1 and FKS2 genes were analysed, which codify for the β-(1,3)-D-glucan synthase and the possible activation of adaptive responses against the action of echinocandins was also analysed. A relative low frequency of acquired mutations in the FKS1 (11/78 isolates) was detected, being all mutations detected outside HS regions and no mutations were identified in the FKS2 gene. Only a single mutation (F1386S) in 1 out 6 non-susceptible isolates was identified, outside the HS regions, which may be associated with the phenotype resistant to echinocandins. The basal chitin content of the cell wall was very similar among the echinocandin susceptible (7.79%) and non-susceptible (8.14%) C. parapsilosis isolates, as well as among the 3 species of the complex: C. parapsilosis (7.96%), C. orthopsilosis (9.42%) and C. metapsilosis (9.53%). However all these values were significantly higher that those determined in the C. albicans control strains (4.61%). The vast majority of the strains increased their basal chitin content between 1% to 3%, after a treatment with caspofungin, with the exception of the two echinocandin resistant C. parapsilosis isolates that increased their chitin content by 7% and 11%. Of note is that these two isolates were the ones that showed the lowest basal chitin content and moreover, one of them showed the F1386S mutation. These results may suggest that a compensatory increase in the chitin production, as a consequence of the inhibition in the synthesis of β-(1,3)-D-glucan caused by echinocandins, could be implied in the acquired resistance to these antifungal agents.

El terme infeccions de transmissió sexual (ITS) inclou una sèrie de síndromes causats per agents patògens que poden ser adquirits mitjançant l'activitat sexual am un augment de la seva als últims anys. Sota el concepte d'ITS s'agrupen tant les malalties venèries clàssiques (uretritis, sífilis, chancroide i limfogranuloma veneri) i aquelles en què la via sexual no és l'únic (hepatitis B i C, l'amebiasis intestinal en HSH, la infecció per virus de la immunodeficiència humana (VIH) i algunes parasitosis). Els patògens més importants engloben Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Trichomonas vaginalis, VIH i altres microorganismes emergents com el Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum i Ureaplasma parvum. El correcte diagnòstic de les ITS té importància tant com a problema de salut pública com per les complicacions que poden produir en aquells pacients no diagnosticats. A la pràctica clínica moltes vegades les ITS són diagnosticades sindrómicament bé per no disposar de proves sensibles, bé per la manca en alguns laboratoris d'aquestes eines. La Tesi té 3 objectius principals que s'han abordat en tres articles diferents. El primer objectiu és l'avaluació d'una tècnica de avidesa per a la identificació d'infecció recent pel VIH 1 utilitzant un immunoassaig automatitzat de quimioluminiscència (QLIA). RITA de l'anglès Recent Infection Testing Algorithm és un nom genèric per a una sèrie de tècniques de laboratori que distingeixen la infecció recent pel VIH. L'estudi indica que l'assaig d'avidesa avaluat és un mètode fiable per identificar infeccions recents per VIH-1 i podria ser utilitzat dins un algoritme RITA per estimar la incidència d'infecció per VIH-1 en la població. El segon objectiu de la Tesi va ser descriure la utilitat d'una tècnica automatitzada Vitros Syphilis TPA (assaig treponèmic per QLIA) per fer el diagnòstic de la sífilis comparant-lo amb tècniques de enzimoimmunoanàlisi, així com a primer pas de el nou algoritme revers de la sífilis en relació a les proves clàssiques, Rapid Plasma Reagin (RPR) i Treponema Pallidum hemagglutination assay (TPHA). Aquesta tècnica permet actuar com a tècnica de cribratge en laboratoris amb alta càrrega de treball gràcies al seu alt valor predictiu negatiu. Per completar l'estudi de les ITS, el tercer objectiu de la Tesi va ser estudiar i avaluar una nova tècnica de biologia molecular mitjançant PCR multiplex, a partir de diferents tipus de mostres provinents de poblacions seleccionades i estudiades prèviament per altres tècniques. Aquest mètode permetria detectar a partir d'una sola mostra, set diferents agents causals d'ITS (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Mycoplasma hominis i Mycoplasma genitalium). Les dades obtingudes de sensibilitat, especificitat i valors predictius al comparar-los amb les tècniques convencionals utilitzades en el nostre laboratori van ser molt bons, permetent per tant, l'adopció d'aquests mètodes com a tècnica per al diagnòstic de les MTS. Un altre punt fort va ser la possibilitat de detecció de Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Mycoplasma hominis i Mycoplasma genitalium. La seva controvertida detecció, sobretot dels tres primers, encara avui, presenta algunes ombres que esperem poder aclarir a mesura que anem coneixent. Les noves tècniques moleculars i immunològiques avaluades en aquesta Tesi han resultat útils per a la detecció d'agents causals d'ITS. En general, els assajos de PCR són molt sensibles i específics en comparació amb altres tècniques com els cultius. D'altra banda, la introducció d'estratègies basades en PCR múltiples permetria identificar pacients amb coinfeccions i també explicar errors en tractaments. / The term sexually transmitted infections (STIs) includes a number of syndromes caused by pathogens that can be acquired through sexual activity with a high incidence in recent years. Under the concept of STI are grouped both classical venereal diseases (urethritis, syphilis, chancroid and lymphogranuloma venereum) and others with different ways of transmission (hepatitis B and C, MSM intestinal amebiasis, infection with human immunodeficiency virus (HIV) and some parasites). Encompass the most important pathogens Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Trichomonas vaginalis, HIV and other emerging organisms like Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum. The correct diagnosis of STIs is important for public health problem and because the complications that can occur in patients undiagnosed. In clinical practice often STIs have a syndromeic diagnosis, sometiems by the lack of sensitive of the diagnostic tests employed or by the lack of these tools in some laboratories. The Thesis has three main objectives that have been addressed in three different articles. The first objective is to evaluate an avidity technique to identifying recent infection by HIV 1 using an automated chemiluminescence immunoassay (QLIA). Recent Infection Testing Algorithm (RITA) is a generic name for a variety of laboratory techniques that distinguish the recent HIV acquisition. The study indicates that the test is a reliable method to identify recent HIV-1 infection and could be used in a RITA algorithm to estimate the incidence of HIV-1 infection in the population. The second objective of the Thesis was to describe the use of an automated technical VITROS Syphilis TPA (treponemal QLIA assay) for diagnosis of syphilis compared to other enzymeimmunoassays, as well as the classic reaginic test, and its use as a first step in the new reverse algorithm comparing with the classic Rapid Plasma Reagin (RPR) with subsequent confirmation with Treponema Pallidum hemagglutination assay (TPHA). The easy use of this automatic system can be implemented as a screening test in laboratories with high workload due to its high negative predictive value. To complete the study of STIs, the third aim of the Thesis was to study and evaluate a new biology molecular technique using PCR multiplex with different types of samples from selected populations previously studied by other techniques. This method allows the detection of seven major pathogens of STI (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Mycoplasma hominis and Mycoplasma genitalium) from a single sample. The data obtained were compared with the conventional methods performed in our laboratory. The sensitivity, specificity and predictive values obtained were highly significant, allowing the adoption of this technique for the diagnosis of STIs. Another objective was the ability to detect Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Mycoplasma hominis and Mycoplasma genitalium. His controversial presence, still presents some shadows that hopefully we can clarify as we know them. New molecular and immunological techniques evaluated in this Thesis have been useful for detecting causative agents of STI. In general, PCR assays are highly sensitive and specific when compared with other techniques such culture or wet mounts examinations. Furthermore, the introduction of multiple PCR based strategies would identify patients with coinfections and also explain failures in treatments.

Antecedents: Les complicacions cardiovasculars majors (CCVM) són la principal causa de morbimortalitat en els pacients intervinguts de cirurgia no cardíaca. La complicació més freqüent és la lesió miocàrdia després de la cirurgia no cardíaca (LMCN), definida com qualsevol pic del valor de troponina T (TnT) ≥ 0,03 ng/ml atribuït a isquèmia i que ocorre durant els 30 primers dies de la cirurgia no cardíaca. Objectius: Determinar al nostre entorn la incidència actual de CCVM, comparar la freqüència de complicacions observada amb l'esperada d'acord amb l'índex de risc cardíac revisat (IRCR), determinar els factors predictors independents de LMCN i de mort als 30 dies de la cirurgia i identificar els pacients que presenten un major risc de patir una LMCN. Metodologia: Anàlisi de la informació derivada de la cohort prospectiva multicèntrica internacional VISION (Vascular Events in Noncardiac Surgery Patients Cohort Evaluation), de la qual s'han seleccionat les dades dels dos hospitals espanyols participants. Es van incloure pacients de 45 anys o majors intervinguts de cirurgia no cardíaca programada o urgent i que requerien al menys una nit d’ingrés. Es van fer determinacions de TnT entre les 6 i les 12 hores de la cirurgia i en el primer, segon i tercer dies postoperatoris. L'esdeveniment principal va ser la proporció de CCVM (LMCN , insuficiència cardíaca, ictus, fibril·lació auricular de nova aparició i mort) als 30 dies de la cirurgia. Resultats: Dels 3.629 pacients inclosos, el 7% va presentar al menys una de les CCVM. La mortalitat a 30 dies de la cirurgia en els pacients que van patir alguna CCVM va ser del 12,3%. La freqüència de CCVM va ser més de 6 vegades superior a l'esperada d'acord amb l’IRCR (6,3; IC99%, 5,3-7,5). La lesió miocàrdia va ser la CCVM més freqüent (5%). L’anàlisi de regressió va identificar vuit factors predictors independents de LMCN: la insuficiència renal, el valor d'hemoglobina preoperatori, l'índex de risc cardíac revisat, el tipus de cirurgia (ortopèdica o vascular),la història prèvia de trombosi, la fibril·lació auricular, la malaltia pulmonar obstructiva crònica, i la diabetis. El poder discriminatiu del model mesurat amb la corba ROC va ser bo (Àrea sota la corba=0,832 IC 95% 0,798-0,865). La LMCN va ser el principal factor de risc independent de mort a 30 dies de la cirurgia (OR 4,4; IC 95%, 2,1-9,2). Mitjançant un anàlisi de partició recursiva s’identificaren com a pacients amb major risc de patir una LMCN aquells amb un filtrat glomerular inferior a 44ml/min/1,73m2 i un IRCR superior a II. Conclusions: En pacients adults intervinguts de cirurgia no cardíaca les CCVM són freqüents i s'associen a una substancial mortalitat a 30 dies de la cirurgia. La LMCN és la complicació més freqüent i és un potent predictor independent de mortalitat. Entre els factors de risc de LMCN, el valor d'hemoglobina preoperatori és l'únic modificable. El filtrat glomerular juntament amb l’IRCR identifiquen als pacients amb major risc de patir una LMCN, en aquests pacients s’haurien d'extremar les mesures de vigilància i cura peroperatòries. / Antecedentes: Las complicaciones cardiovasculares mayores (CCVM) son la principal causa de morbimortalidad en los pacientes intervenidos de cirugía no cardiaca. La complicación más frecuente es la lesión miocárdica tras la cirugía no cardiaca (LMCN), definida como cualquier pico del valor de troponina T (TnT) ≥ 0,03ng/mL, atribuido a isquemia y que ocurre durante los 30 primeros días tras una cirugía no cardiaca. Objetivos: Determinar en nuestro entorno la incidencia actual de CCVM, comparar la frecuencia de complicaciones observada con la esperada de acuerdo con el índice de riesgo cardiaco revisado (IRCR), determinar los factores predictores independientes de LMCN y de muerte a los 30 días de la cirugía e identificar a los pacientes que presentan mayor riesgo de padecer una LMCN. Metodología: Análisis de la información derivada de la cohorte prospectiva multicéntrica internacional VISION (Vascular Events in Noncardiac Surgery Patients cohort Evaluation), de la que se han seleccionado los datos de los dos hospitales españoles participantes. Se incluyeron pacientes de 45 años o mayores intervenidos de cirugía no cardíaca programada o urgente y que requerían al menos una noche de ingreso. Se hicieron determinaciones de TnT entre las 6 y las 12 horas de la cirugía y el primer, segundo y tercer días posoperatorios. El desenlace principal fue la proporción de CCVM (LMCN, insuficiencia cardiaca, ictus, fibrilación auricular de nueva aparición y muerte) a los 30 días de la cirugía. Resultados: De los 3.629 pacientes incluidos, el 7% presentó al menos una de las CCVM. La mortalidad a los 30 días de la cirugía en los pacientes que sufrieron alguna CCVM fue del 12,3%. La frecuencia de CCVM fue más de 6 veces superior a la esperada de acuerdo con el IRCR (6,3; IC 99% 5,3-7,5). La LMCN fue la CCVM más frecuente (5%). El análisis de regresión identificó ocho factores predictores independientes de LMCN: la insuficiencia renal, el valor de hemoglobina preoperatorio, el índice de riesgo cardiaco revisado, el tipo de cirugía (ortopédica o vascular),la historia previa de trombosis, la fibrilación auricular, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y la diabetes. El poder discriminativo del modelo medido con la curva de ROC fue bueno (Área bajo la curva=0,832 IC 95% 0,798-0,865). La LMCN fue el principal factor de riesgo independiente de muerte a los 30 días de la cirugía (OR 4,4; IC 95%, 2,1-9,2). Mediante un análisis de partición recursiva se identificron como pacientes con mayor riesgo de padecer una LMCN aquellos con un filtrado glomerular inferior a 44ml/min/1,73m2 y un IRCR superior a II. Conclusiones: En pacientes adultos intervenidos de cirugía no cardiaca las CCVM son frecuentes y se asocian a una sustancial mortalidad a los 30 días de la cirugía. La LMCN es la complicación más frecuente y es un potente predictor independiente de mortalidad. De entre los factores de riesgo de LMCN, el valor de hemoglobina preoperatorio es el único modificable. El filtrado glomerular junto con el IRCR identifican a los pacientes con mayor riesgo de padecer una LMCN, en estos pacientes se deberían extremar las medidas de vigilancia y cuidado peroperatorias. / Background: Major adverse cardiovascular events (MACE) are the leading cause of serious morbidity and mortality in patients undergoing noncardiac surgery. The most common complication is myocardial injury after non cardiac surgery (MINS), defined as a peak troponin T level (TnT) of 0.03 ng/ml or greater judged due to myocardial ischemia, that occurs during or within 30 days after noncardiac surgery. Objectives: To determine in our environment the current incidence of MACE, to compare the observed event rates to the expected event rates according to the revised cardiac risk index (RCRI), to identify risk factors for MINS and death at 30 days after surgery and to identify patients at increased risk for MINS. Methodology: Analysis of the information derived from the international multicentre prospective cohort evaluation VISION (The Vascular events In noncardiac Surgery patIents cOhort evaluatioN) Data from the two participating Spanish hospitals were selected. Eligible patients were aged 45 yr. or older underwent elective or urgent/emergency noncardiac surgery. Patients were excluded who did not require an overnight hospital admission after surgery. Patients’ TnT levels were measured 6 to 12 hours after surgery and on days 1, 2, and 3 after surgery. The main outcome was the proportion of MACE (MINS, heart failure, stroke, new onset atrial fibrillation and death) from admittance to 30 days after surgery. Results: Of the 3.629 patients included, 7% had at least one MACE. The 30-day mortality in patients who suffered at least one MACE was 12.3%. Observed event rates were 6 fold higher (6,3; IC99%, 5,3-7,5) than the expected event rates according to the RCRI. Myocardial injury was the most frequent MACE (5%). The regression model identified eight independent predictors of MINS: Renal insufficiency, preoperative haemoglobin value, the revised cardiac risk index, type of surgery (orthopaedic or vascular), previous history of thrombosis, atrial fibrillation, chronic obstructive pulmonary disease, and diabetes. The discriminative power of the model measured by ROC curve was good (area under the curve = 0.832 95% CI 0.798 to 0.865). MINS was a strong independent predictor of 30-day mortality (OR 4,4; 95% CI, 2,1 to 9,2). A Recursive Partitioning Analysis (RPA) identified those patients with the highest risk for MINS as patients with a glomerular filtration rate below 44ml / min / 1.73m2 and a RCRI greater than II. Conclusion: In adult patients undergoing noncardiac surgery MACE are frequent and associated with substantial mortality at 30 days after surgery. MINS is the most common complication and it is a strong independent predictor of mortality. Among risk factors for MINS, preoperative haemoglobin level is the only modifiable. Glomerular filtration along with RCRI identify patients at increased risk for MINS. Surveillance measures and perioperative care should be tightened in these patients.

Tot i que les teràpies per les infeccions fúngiques han millorat molt en els últims 10 anys, les infeccions per fongs oportunistes segueixen sent una greu amenaça, especialment pels pacients inmunocompromesos. La baixa incidéncia d’aquestes infeccions ha dificultat l’adopció d’estratègies terapeútiques eficaces pel que, estàn associades a una elevada mortalitat. L’objectiu d’aquesta tesi ha estat contribuir al desenvolupament d’alternatives terapeútiques experimentals per les micosis oportunistes causades pels patògens emergents Saprochaete capitata, Cryptococcus albidus, Cryptococcus laurentii, Rhodotorula mucilaginosa i Saccharomyces cerevisiae. Avaluacions in vitro i in vivo es van portar a terme i han permès proposar noves alternatives terapeútiques per les infeccions causades per aquests patògens. / Aunque las terapias para las infecciones fúngicas han mejorado mucho en los últimos 10 años, las infecciones por hongos oportunistas siguen siendo una grave amenaza, especialmente para los pacientes inmunocomprometidos. La baja incidencia de estas infecciones ha dificultado la adopción de estrategias terapéuticas eficaces por lo que, están asociadas a una elevada mortalidad El objetivo de esta tesis ha sido contribuir al desarrollo de alternativas terapéuticas experimentales para las micosis oportunistas causadas por los patógenos emergentes Saprochaete capitata, Cryptococcus albidus, Cryptococcus laurentii, Rhodotorula mucilaginosa y Saccharomyces cerevisiae. Evaluaciones in vitro e in vivo se llevaron a cabo y han permitido proponer nuevas alternativas terapéuticas para las infecciones causadas por estos patógenos. / Although therapies for fungal infections have improved much during last 10 years, infections by opportunistic fungus still are a serious threat, especially for immune-compromised patients. The low influence of these infections have complicated the adoption of effective therapeutic strategies, hence they’re associated with a high mortality rate. The goal of this thesis has been to contribute the development of experimental therapies alternative for opportunistic mycoses originated by emerging pathogens Saprochaete capitata, Cryptococcus albidus, Cryptococcus laurentii, Rhodotorula mucilaginosa and Saccharomyces cerevisiae. In vitro and in vivo evaluations were carried out and they have led us to propose new therapeutic alternatives for the infections caused by these pathogens.