Η πρωτεϊνική σύνθεση είναι ένας σημαντικός στόχος για τα αντιβιοτικά. Η χλωραμφαινικόλη (CAM) δεσμεύεται επί της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας των βακτηρίων και παρεμποδίζει θεμελιώδεις λειτουργίες, όπως είναι η σύνθεση του πεπτιδικού δεσμού, η πρόσδεση των tRNA-υποστρωμάτων στην Α-θέση και ο τερματισμός της πεπτιδικής αλυσίδας. Η παρουσία ενεργών διαμεμβρανικών μεταφορέων για πολυαμίνες στα κύτταρα και κρυσταλλογραφικά δεδομένα που παρουσιάζουν δύο θέσεις πρόσδεσης της CAM στο ριβόσωμα μας έδωσαν το έναυσμα για τη δημιουργία δύο κατηγοριών παραγώγων των πολυαμινικών και των διμερών, αντίστοιχα. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η επανεξέταση της πολύπλοκης συμπεριφοράς της χλωραμφαινικόλης, χρησιμοποιώντας την τεχνική της χρονο-διαβαθμισμένης αποτύπωσης, καθώς και τη σύνθεση και εκτίμηση της αντιβακτηριακής και αντικαρκινικής δράσης μιας σειράς πολυαμινικών και διμερών παραγώγων της χλωραμφαινικόλης, με αναμενόμενη ισχυρότερη συγγένεια προς το ριβόσωμα και βελτιωμένη ικανότητα εισόδου στα κύτταρα, συγκριτικά με τη μητρική ένωση. Τα πειράματα κινητικής ανάλυσης, έγιναν σε ένα σύστημα ελεύθερο-κυττάρων του εντεροβακτηρίου E. coli, όπου η σύνθεση ακετυλο-φαινυλαλανυλο-πουρομυκίνης πραγματοποιείται μέσω μιας αντίδρασης ψευδοπρώτης τάξεως μεταξύ του συμπλέγματος C, δηλαδή ακετυλο-φαινυλαλανυλο-tRNA•poly(U)•ριβοσωμάτων (δρα ως ανάλογο του εναρκτήριου μεταφραστικού συμλπόκου) και περίσσειας πουρομυκίνης (δρα ως υπόστρωμα της Α-θέσης). Τα πολυαμινικά όσο και τα διμερή παράγωγα μελετήθηκαν ως αναστολείς της αντίδρασης πουρομυκίνης και η κινητική τους συμπεριφορά συγκρίθηκε με εκείνη της μητρικής ένωσης. Αρχικά, παρατηρήσαμε ότι απουσία αναστολέα, οι αντιδράσεις ακολουθούσαν κλασσική κινητική πρώτης τάξης (μονοφασικές ημι-λογαριθμικές χρονοκαμπύλες). Ωστόσο, η παρουσία των παραγώγων είχε ως αποτέλεσμα τα δεδομένα να υποστηρίζουν κινητική χρονοεξαρτώμενης αναστολής (διφασικές ημι-λογαριθμικές χρονοκαμπύλες). Ακολούθησε ενδελεχής κινητική ανάλυση, η οποία αποκάλυψε ότι τα παράγωγα συμπεριφέρονται ως αναστολείς βραδείας δέσμευσης. Με βάση την ολική σταθερά αναστολής, Κi*, κατατάξαμε τα πολυαμινικά παράγωγα ως εξής: το ΚΑ240 (Κi*= 0,28 μΜ) και το F5 (Κi*= 0,75 μΜ) που φέρουν μία σπερμιδίνη προσκολλημένη στο μόριο της CAM, και το CLB3 (Κi*= 0,6 μΜ) που φέρει μια σπερμίνη, προσδένονται πιο ισχυρά από τη μητρική ένωση (Κi*= 0,88 μΜ) στο ριβόσωμα. Από τα διμερή ισχυρότερα είναι το mag240 (Κi*= 0,3 μΜ) που φέρει συνδέτη με περιορισμένη διαμορφωτική ελευθερία και έξι άτομα άνθρακα και τα mag261 (Κi*= 0,6 μΜ) και mag266 (Κi*= 0,75 μΜ) τα οποία φέρουν βραχύτερο συνδέτη. Μελέτες ανάλυσης αποτυπώματος επιβεβαίωσαν ότι τα παράγωγα της CAM ακολουθούν μηχανισμό πρόσδεσης δύο σταδίων, αφού το αποτύπωμα του αρχικού και τελικού συμπλόκου διέφερε, παρέχοντας έτσι τη δυνατότητα παρακολούθησης της πορείας πρόσδεσης. Η χημική προστασία που παρέχει η πρόσδεση στα νουκλεοτίδια Α2451 και U2506, που βρίσκονται στο καταλυτικό κέντρο, δικαιολογεί το συναγωνιστικό χαρακτήρα αναστολής των πολυαμινικών και διμερών παραγώγων της CAM στην αντίδραση πουρομυκίνης. Το πολυαμινικό παράγωγο ΚΑ240 και η μητρική ένωση φαίνεται να προστατεύουν τα Α2059 και Α2062 μέσω αλλοστερικού φαινομένου αφού το μήκος των μορίων τους δεν τους επιτρέπει να φτάσουν στο κανάλι εξόδου. Από την άλλη πλευρά, τα διμερή παράγωγα (mag240 και mag234) προστατεύουν τα νουκλεοτίδια του καναλιού εξόδου Α2058, Α2059, Α2062, με το mag240 να δείχνει ισχυρότερη προστασία, πιθανότατα λόγω μικρότερης δυνατότητας περιστροφής του μορίου γύρω από το βραχίονα που συνδέει τις δύο πολυαμινικές ομάδες. Εκτός από τα in vitro πειράματα πραγματοποιήσαμε και μια σειρά πειραμάτων σε βακτήρια και σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Η μελέτη της επίδρασης των παραγώγων σε καλλιέργειες στελεχών Ε. coli και S. aureus κατέδειξε ότι τα παράγωγα της CAM εισέρχονται πιο εύκολα στα θετικά κατά Gram σε σχέση με τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια. Όμως, κανένα από τα παράγωγα δεν επέδειξε ισχυρότερη αντιβακτηριακή δράση από τη μητρική ένωση. Με βάση την υπόθεση ότι η χλωραμφαινικόλη δρα στα μιτοχόνδρια και συγκεκριμένα αναστέλλει την πρωτεϊνική σύνθεσή τους, διερευνήθηκε αν η μητρική ένωση και το δραστικότερο in vitro παράγωγο της κάθε σειράς είναι τοξικό σε ανθρώπινες λευχαιμικές κυτταρικές σειρές (Jurkat, HS-Sultan, U937) και σε κυτταρικές σειρές πνεύμονα. Αρχικές μετρήσεις με τον αναλυτή αίματος έδειξαν ότι: κανένα εκ των τριών αντιβιοτικών δεν είναι τοξικό σε ώριμα κύτταρα του αίματος σε συγκέντρωση 6 μΜ και για έκθεση 120 h. Επίσης, έδειξαν ότι η CAM αναστέλλει την ανάπτυξη κυττάρων Jurkat (Τ-λευχαιμική σειρά) κατά 13%, το ΚΑ240 κατά 26% και το mag240 κατά 31%. Σε καλλιέργεια κυττάρων HS-Sultan (Β-λευχαιμική σειρά), η συμπεριφορά των αντιβιοτικών ήταν διαφορετική: η CAM ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων κατά 30%, το ΚΑ240 κατά 15% και το mag240 κατά 10%. Σε καλλιέργεια κυττάρων U937 (μονοκυτταρική σειρά) τα αντιβιοτικά μας δεν έδειξαν κάποια τοξική δράση. Περαιτέρω μελέτη των κυτταρικών σειρών με ιωδιούχο προπίδιο (υπολογισμός νέκρωσης) και CFSE (υπολογισμός πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων) έδειξε ότι η μείωση των κυττάρων δεν οφείλεται σε νέκρωση, αλλά σε ανάσχεση των κυτταρικών διαιρέσεων. Τέλος, η CAM και το mag240 δεν έδειξαν τοξική δράση στις κυτταρικές σειρές Μet5Α (επιθηλιακά μετασχηματισμένα κύτταρα) και Zl34 (κύτταρα από καρκίνο μεσοθηλιώματος), σε αντίθεση με το ΚΑ240, το οποίο ήταν δραστικό έναντι της καρκινικής σειράς. Συμπερασματικά, στην παρούσα μελέτη διερευνήσαμε το μηχανισμό δράσης και προσδιορίσαμε την αντιβακτηριακή ισχύ μιας σειράς παραγώγων της CAM σε καλλιέργειες θετικών και αρνητικών κατά Gram βακτηρίων. Αν και κανένα από τα παράγωγα δεν έδειξε ισχυρότερη in vivo δράση από εκείνη της μητρικής ένωσης, η διερεύνηση του μηχανισμού δράσης τους in vitro οδήγησε σε σπουδαία συμπεράσματα για τις ιδιότητες του καταλυτικού κέντρου του ριβοσώματος. Τα σπουδαιότερα εξ’ αυτών αφορούν στην ικανότητα του καταλυτικού κέντρου να διαμορφώνει τη στερεοδομή του, ώστε να υποδέχεται επιτυχώς ένα προσδέτη (induced fitting) και να μεταφέρει αλλοστερικά μηνύματα σε απομακρυσμένες χωροταξικά περιοχές. Επίσης, σημαντικό συμπέρασμα ήταν η ταυτοποίηση μιας δεύτερης θέσης πρόσδεσης της CAM στην είσοδο του καναλιού εξόδου, μικρής συγγένειας, η οποία μπορεί να αποκαλυφθεί μόνο με τη χρήση προσδετών με περιορισμένη στερεοδιαμόρφωση. Τέλος, από τη μελέτη της τοξικότητας των εν λόγω ουσιών σε ευκαρυωτικά κύτταρα διαπιστώθηκε ότι μερικά εξ αυτών, παρότι ανενεργά έναντι φυσιολογικών ανθρωπίνων κυττάρων, προκαλούν ανάσχεση στην πολλαπλασιαστική ικανότητα καρκινικών κυττάρων. Αυτό το γεγονός δίνει το έναυσμα για περαιτέρω μελέτη αξιοποίησης των εν λόγω ουσιών ως αντικαρκινικών. / Protein synthesis is a major target for antibiotics. Chloramphenicol (CAM) binds on the large ribosomal subunit and inhibits bacterial fundamental functions, such as the peptide bond formation, the binding of the tRNA-substrates in the A-site and the termination of the peptide chain synthesis. The presence of active trans-membrane transporters for polyamines in cells and crystallographic data that show two binding sites for CAM on the ribosome gave us the impetus to create two series of CAM derivatives: polyamine and dimer derivatives, respectively. The aim of this study was to re-examine the complex behavior of chloramphenicol binding to ribosomes, using time-resolved footprinting analysis, and to synthesize a series of dimers and polyamine derivatives of chloramphenicol along with evaluating their antibacterial and antitumor activity, with the expectation to find new drugs with stronger affinity against the ribosome, better ability to enter to cells and less toxicity to normal cells, compared with the parent compound. Kinetic analysis experiments were performed in a cell-free system derived from E. coli, in which acetylphenylalanyl-puromycin is produced via a pseudo-first-order reaction between complex C, i.e. acetylphenylalanyl-tRNA•poly(U)•ribosome (acting as an analog of the initiator translation complex) and puromycin in excess (acting as a pseudo-substrate of the A-site). The polyamine derivatives and dimers of CAM were studied as inhibitors of this reaction and their kinetic behavior was compared with those of the parent compound. We observed that in the absence of inhibitor, the puromycin reaction follows classical first-order kinetics (monophasic semi-logarithmic time-plots). However, in the presence of CAM derivatives, the reaction followed kinetics of time-dependent inhibition (biphasic semi-logarithmic time-plots). Data processing revealed that the CAM derivatives behave as slow binding inhibitors. Based on the overall inhibition constant, Κi*, the polyamine derivatives were classified as follows: KA240 (Κi* = 0.28 μΜ) and F5 (Κi* = 0.75 μΜ), both bearing a spermidine molecule attached to the CAM scaffold, and CLB3 (Κi* = 0.6 μΜ) that instead bears a spermine molecule were able to bind to the ribosome more tightly than the parent compound (Κi* = 0.88 μΜ) to the ribosome. Among the dimers, mag240 that possesses a six-carbons linker with limited conformational freedom, and mag261 that possesses a three-carbons linker were found to be the strongest inhibitors. Footprinting analysis studies confirmed that the derivatives of CAM follow two-step binding mechanism, since the footprint of the initial and final complex differed, thus allowing to investigate the entire course of the binding process. The chemical protection of nucleotides A2451 and U2506, which are located in the catalytic center, justifies the competitive mode of inhibition exhibited by the polyamine derivatives and dimers of CAM in the puromycin reaction. The polyamine derivative KA240 and the parent compound were found to additionally protect A2059 and A2062 through allosteric phenomena, given that the length of these molecules does not allow a direct contact with the exit tunnel. On the other hand, dimers (mag240 and mag234) protect the nucleotides of the exit tunnel A2058, A2059 and A2062, with mag240 showing stronger protection, probably due to the lower possibility of rotation of the molecule around the arm linking the two CAM scaffolds. Apart from the in vitro experiments, we performed a series of experiments in bacteria and in human cell lines. The study of the effect of the derivatives in cultures of E. coli and S. aureus cells demonstrated that CAM derivatives access easier Gram-positive than Gram-negative bacteria. However, none of the derivatives show a stronger antibacterial activity than the parent compound. Taking into account that chloramphenicol may impact the eukaryotic mitochondria and specifically may inhibit mitochondrial protein synthesis, we investigated whether the parent compound and the most active members in vitro of each series of derivatives are toxic to human hematopoietic cell lines (Jurkat, HS-Sultan, U937) and lung cell lines. Preliminary measurements using the blood analyzer showed that none of the three antibiotics is toxic to mature blood cells, after 120h- exposure at 6 μM of each drug. They also showed that CAM inhibits Jurkat (T leukemia line) cell growth by 13%, KA240 by 26% and mag240 by 31%. In cell culture HS-Sultan (B-leukemia line), the toxic effects of the drugs were different: CAM inhibited cell growth by 30%, KA240 by 15% and mag240 by 10 %. U937 (monocytic cell line) cultured cells were not sensitive to any of the investigated drugs. Further experimentation using propidium iodide (calculation of necrosis) and CFSE (calculation of proliferating cells) showed that the observed reduction of cell growth was not due to cell death, but to inhibition of cell divisions. Finally, CAM and mag240 showed no toxic effect on Met5A (transformed epithelial cells) and Zl34 (mesothelioma cancer cells), contrary to KA240 that was active against Zl34 cells. In conclusion, in the present study we investigated the mechanism of action and we determined the antibacterial effect of a series of CAM derivatives in cultures of Gram-positive and Gram-negative bacteria. Although none of the derivatives showed stronger in vivo activity than those of the parent compound, the investigation of their activity in cell free systems led to important conclusions about the properties of the catalytic center of the ribosome. The most important of them concern the ability of the catalytic center to form its structure, to receive successfully a ligand (induced fitting) and to transfer allosteric messages to remote spatial regions. An important finding was the identification of a second binding site of the CAM at the entrance of the exit tunnel, which has low affinity and can only be detected using ligands with restricted conformation. Finally, measurements of the toxicity of these substances in various eukaryotic cells revealed that some of them, although inactive against normal human cells, exhibit anti-proliferative effects on tumor cells. This finding paves the way for further investigation of these substances as promising anticancer compounds.

Η αυξανόμενη τάση εμφάνισης ανθεκτικών στελεχών μικροβίων στα αντιβιοτικά δημιουργεί την ανάγκη για την εύρεση νέων αντιβιοτικών περισσότερο αποτελεσματικών των υπαρχόντων. Η ανάγκη αυτή έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη νέων αντιβιοτικών, προϊόντων οργανικής σύνθεσης, μεταξύ των οποίων σημαντική θέση κατέχει η λινεζολίδη. Η λινεζολίδη είναι ένα αντιβιοτικό που ανήκει στην οικογένεια των οξαζολιδινονών. Χρησιμοποιείται κλινικά από το 2000 και μετά, για τη θεραπεία ενός φάσματος λοιμώξεων που προκαλούνται κυρίως από θετικούς κατά Gram παθογόνους μικροοργανισμούς. Το μόριο της αποτελείται από τρεις αρωματικούς δακτυλίους με μία ακεταμιδομεθυλο ουρά προσδεδεμένη στον οξαζολιδινικό φαρμακοκινητικό δακτύλιο. Η κρυσταλλογραφική ανάλυση του προσδεδεμένου αντιβιοτικού στη μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα στα αρχαία και τα βακτήρια αποκαλύπτει ότι η λινεζολίδη προσδένεται στην Α- θέση του ριβοσώματος, στο κέντρο δηλαδή της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, σε μία θέση που επικαλύπτει τις θέσεις πρόσδεσης της ανισομυκίνης, της χλωραμφαινικόλης καθώς επίσης και του αμινοακυλικού άκρου ενός αμινοάκυλο tRNA. Αν και αποτελεί αντιβιοτικό νέας γενιάς και η χρήση του είναι ακόμα περιορισμένη, εν τούτοις έχουν ήδη αναφερθεί ανθεκτικά βακτηριακά στελέχη. Η ανθεκτικότητα έχει συσχετισθεί με συγκεκριμένες μεταλλάξεις κυρίως στο 23S rRNA και δευτερευόντως με συγκεκριμένες μεταλλάξεις στις ριβοσωματικές πρωτεΐνες. Πρόσφατα δημοσιεύτηκε ότι το στέλεχος του Staphylococcus epidermidis Α2864 το οποίο φέρει παρόμοιες μεταλλάξεις ανθεκτικότητας στο 23 S rRNA και στην ριβοσωματική πρωτεΐνη L3, όχι μόνο δεν αναστέλλεται από τη λινεζολίδη, αλλά παρουσία του αντιβιοτικού αναπτύσσεται ταχύτερα από το στέλεχος αγρίου τύπου. Επειδή το ριβόσωμα είναι ο κύριος στόχος δράσης του αντιβιοτικού, προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε πιθανές μεταβολές που προκαλεί η παρουσία της λινεζολίδης στη λειτουργία των ριβοσωμάτων του συγκεκριμένου στελέχους. Απομονώσαμε λειτουργικά ριβοσώματα από το στέλεχος αγρίου τύπου, αλλά και το μεταλλαγμένο, που αναπτύσσεται είτε απουσία είτε παρουσία λινεζολίδης. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, υπάρχουν σημαντικές διαφορές στη δομή και στη λειτουργία των ριβοσωμάτων που έχουν απομονωθεί από κύτταρα που αναπτύχθηκαν παρουσία του αντιβιοτικού. Η καταλυτική ενεργότητα της πεπτιδύλοτρανσφεράσης, δηλαδή της ενζυμικής ενεργότητας η οποία είναι υπεύθυνη για το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού και εκφράζεται με το λόγο kcat/KM, είναι σημαντικά υψηλότερη στα ριβοσώματα που έχουν απομονωθεί από το μεταλλαγμένο στέλεχος που καλλιεργήθηκε παρουσία λινεζολίδης. Τη διαφορά όμως αυτή την εκφράζουν μόνο παρουσία του αντιβιοτικού. Μία άλλη σημαντική διαφορά αυτών των ριβοσωμάτων είναι η αδυναμία τους να διαχωριστούν αποτελεσματικά στις υπομονάδες τους απουσία του αντιβιοτικού, ενώ παρουσία της λινεζολίδης διαχωρίζονται σχεδόν ικανοποιητικά στις υπομονάδες τους. Όλες αυτές οι παρατηρήσεις οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η παρουσία του αντιβιοτικού έχει τροποποιήσει τη δομή και λειτουργία του ριβοσώματος είτε επηρεάζοντας την καθορισμένη ιεραρχία της συναρμολόγησης των ριβοσωμάτων, είτε σχηματίζοντας ένα καινούριο ριβοσωματικό υβρίδιο, λειτουργικό μόνο παρουσία του αντιβιοτικού. / The rising tide of bacterial resistance has created an urgent need for new effective antibiotics. This need has resulted in the development of new synthetic antibiotics, with linezolid being one of them. Linezolid belongs to the family of oxazolidinones. It has been introduced into clinical practice since 2000, for the treatment of a variety of infections caused by Gram-positive pathogen microorganisms. This molecule comprises three aromatic rings with an acetamidomethyl tail attached to the pharmacokinetic oxazolidinone ring. Crystal structures of linezolid bound the bacterial and archaeal large subunits reveal that linezolid binds to the A- site of the ribosome, in the PTC, in a position overlapping the binding sites of anisomycin, chloramphenicol as well as the aminoacyl moiety of an A- site bound tRNA. Although it belongs to the new generation of antibiotics and its use is still limited, antibiotic resistance has already been manifested and is associated with specific mutations mainly located on 23S rRNA and specific ribosomal proteins. Recently, it has been published that Staphylococcus epidermidis strain A2864, is not only resistant to linezolid but additionally it grows remarkably faster in the presence of the antibiotic, as well as the wild type strain. Since ribosome is the main target of the antibiotic, we tried to investigate possible changes in ribosome’s function that are induced by the presence of the antibiotic. We isolated functionally active ribosomes from wild type strain and mutant strain growing in the absence and presence of linezolid. According to our data, there are serious differences in the structure and function of mutant ribosomes assembled in the presence of the antibiotic. The catalytic activity of peptidyltransferase, the enzymatic activity which is responsible for peptide bond formation and is expressed with the ratio kcat/KM is significantly higher in the mutant strain in the presence of linezolid, but only for ribosomes assembled in the presence of the antibiotic. Another important difference of the same ribosomes is their inability to be efficiently dissociated into subunits in the absence of the antibiotic, while in the presence of the antibiotic the separation of subunits was successfully restored. These observations imply that, the presence of the antibiotic has modified the structure and the function of the ribosome either by modifying the defined hierarchy of ribosomes assembly or by leading to the formation of a new functional specie, active only in the presence of the antibiotic.

Η πρωτεϊνική σύνθεση είναι ένας σημαντικός στόχος για τα αντιβιοτικά. Μεγάλη ποικιλία αντιβιοτικών αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των παθογόνων βακτηρίων, προσδενόμενα στα ριβοσώματά τους. Η τελιθρομυκίνη είναι ένα ημισυνθετικό παράγωγο της ερυθρομυκίνης, που ανήκει στην οικογένεια των κετολιδίων και επιδεικνύει αντιμικροβιακή δραστικότητα σε αρκετά βακτήρια που είναι ανθεκτικά στην ερυθρομυκίνη. Είναι ένας ισχυρός αναστολέας της πρωτεϊνικής σύνθεσης, παρεμποδίζοντας τη διέλευση της νεοσυντιθέμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας από το κανάλι εξόδου. Για να αναλύσουμε την αλληλεπίδραση της τελιθρομυκίνης με το βακτηριακό ριβόσωμα, μελετήσαμε τη σύνδεση του αντιβιοτικού σε E.coli ριβοσώματα χρησιμοποιώντας κινητική συναγωνισμού πρόσδεσης. Συγκεκριμένα, η πρόσδεση της τελιθρομυκίνης μελετήθηκε σε ένα σύστημα ελεύθερο-κυττάρων του εντεροβακτηρίου E.coli, όπου το εν λόγω αντιβιοτικό συναγωνίζεται την τυλοσίνη για κοινές θέσεις δέσμευσης επί του τριμερούς συμπλόκου C (AcPhe-tRNA•poly(U)•ριβόσωμα), ενός λειτουργικού αναλόγου του εναρκτήριου συμπλόκου. Η τυλοσίνη, ένα 16-μελές μακρολίδιο, αναστέλλει το σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού, ενώ η τελιθρομυκίνη δεν επηρεάζει τη δραστικότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Τα κινητικά δεδομένα υποστηρίζουν ότι η τελιθρομυκίνη και το ριβοσωματικό σύμπλοκο C αλληλεπιδρά σε μοριακή αναλογία 1:1 για να σχηματίσει ταχέως ένα CT σύμπλοκο, το οποίο στη συνέχεια ισομεριώνεται βραδέως σε ένα σταθερότερο σύμπλοκο C*T. C+ T CT C*T Το πρώτο στάδιο της διαδικασίας δέσμευσης περιλαμβάνει μία σχετικά χαμηλής συγγένειας θέση δέσμευσης, που τοποθετείται στην είσοδο του καναλιού εξόδου της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας (KT =500 nM). Το δεύτερο στάδιο αναπαριστά μία διαμορφωτική αλλαγή με σταθερά ισομερισμού (Κισομ.) ίση με 58,9 , η οποία ωθεί το αντιβιοτικό βαθύτερα στο εσωτερικό του τούνελ σε μία θέση υψηλής συγγένειας (KT*=8,13 nM). Μεταλλαγή του νουκλεοζίτη U754 σε αδενοσίνη μειώνει στο ήμισυ την ικανότητα μετατόπισης της τελιθρομυκίνης στην τελική της θέση (Κισομ.=25,7), μέσω λεπτών αλλαγών στις σταθερές ταχύτητας σχηματισμού και διάστασης του συμπλόκου C*T. Αντίθετα, η μεταλλαγή U2609C μειώνει 5-φορές τη μετακίνηση του αντιβιοτικού προς τη θέση υψηλής συγγένειας και αποσταθεροποιεί το σύμπλοκο C*T, προσδίδοντας στην Κισομ. τιμή ίση με 2,6. Δεδομένου ότι οι δύο νουκλεοζίτες έχουν εντοπιστεί με κρυσταλλογραφία στην ίδια περιοχή του καναλιού εξόδου, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την άποψη ότι μερικά ριβοσωματικά κατάλοιπα, αν και εντοπισμένα σε γειτονικές θέσεις, μπορεί να έχουν εντελώς διαφορετική συνεισφορά στην εγκατάσταση ενός φαρμάκου επί του ριβοσώματος. Μεταλλάξεις στις ριβοσωματικές πρωτεΐνες L22 και L4 προκαλούν διαφορετικές μεταβολές στην πρόσδεση της τελιθρομυκίνης στο ριβοσωματικό σύμπλοκο C. Συγκεκριμένα, η αφαίρεση των αμινοξέων 82-84 στον εκτεταμένο βρόγχο της L22 μειώνει δραστικά τη σταθερά ισομερισμού (Κισομ.= 1,53), ενώ η μετάλλαξη Lys63Glu στην πρωτεΐνη L4 ασκεί μέτρια επίδραση στην ολική συγγένεια της τελιθρομυκίνης για το ριβοσωματικό σύμπλοκο C (KT*=12 nM). Και οι δύο μεταλλάξεις προκαλούν ισχυρή ανθεκτικότητα έναντι της ερυθρομυκίνης. Τα αποτελέσματα αυτά αποτελούν σημαντική προσφορά στη χαρτογράφηση της θέσης πρόσδεσης της τελιθρομυκίνης στο προκαρυωτικό ριβόσωμα και επιβεβαιώνουν την υπεροχή της αντιμικροβιακής δράσης της τελιθρομυκίνης έναντι της ερυθρομυκίνης. / Protein synthesis is an important target for antibiotics. A wide range of antibiotics inhibit the growth of pathogenic bacteria, by binding to the ribosome. Telithromycin is a semisynthetic derivative of erythromycin, which belongs to the family of ketolides and causes increased antimicrobial activity in several bacteria that are resistant to erythromycin. It is a potent inhibitor of protein synthesis by preventing the passage of nascent polypeptide chain through the exit tunnel. To analyze the interaction of telithromycin with the bacterial ribosome, we examined the binding of the drug to E.coli ribosomes, using competitive kinetics. Namely, the binding of telithromycin was studied in a free-cell system derived from E.coli, where it competes with the antibiotic tylosin for common binding sites on the ternary complex C (AcPhe-tRNA • poly (U) • ribosome), an active analogue of the initiator complex in protein synthesis. Tylosin, a 16-member macrolide, inhibits peptide bond formation, while telithromycin fails to affect the activity of peptidyltransferase. The kinetic data suggest that telithromycin and the ribosomal complex C interact at a molecular ratio of 1:1 to form quickly a CT complex, which then slowly isomerized to a tighter complex C*T. C+ T CT C*T The first step of the binding procedure includes a relative low-affinity binding site, situated at the entrance of the exit tunnel of the large ribosomal subunit (KT = 500 nM). The second step represents a slow conformational change with an isomerization constant (Kisom.) equal to 58.9, which pushes the drug deeper into the tunnel, in a high-affinity site (KT*=8.13 nM). Mutation of nucleoside U754 to adenosine reduces moderately the ability of telithromycin to translocate to its final position (Kisom.=25.7), through minor effects on the forward and reverse rate constants of the isomerization step. In contrast, mutation U2609C reduces 5-fold the shift of the drug to the high-affinity site and also destabilizes the final complex C*T, leading to a value for Kisom. equal to 2.6. Taking into account, that both ribosomal nucleosides have been crystallographycally localized at the same region of the exit tunnel, our results emphasize the notion that some ribosomal residues, although placed at neighboring positions, may have entirely different contribution on the accommodation of a drug into the ribosome. Mutations in ribosomal proteins L4 and L22 affect diversely the binding of telithromycin to ribosomal complex C. Especially, removal of amino acids 82-84 in the extended loop of L22 significantly reduces the isomerization constant (Kisom. = 1.53), while mutation Lys63Glu in protein L4 exhibits a moderate effect on the overall affinity of telithromycin for the ribosomal complex C (KT *= 12 nM). Both mutations render E.coli resistant against erythromycin. Our results contribute significantly to the mapping of telithromycin binding site in prokaryotic ribosome and confirm the superiority of telithromycin as an antimicrobial agent, when compared with erythromycin.

La diffusion des bactéries multirésistantes aux antibiotiques associée à une diminution du nombre de nouveaux antibiotiques représente un véritable enjeu de santé publique. De nos jours, un vieil antibiotique, la colistine, connait un récent regain d’intérêt, constituant parfois la seule alternative thérapeutique. La colistine est, alors, qualifiée d’antibiotique de « dernier recours ». Cependant, il a été constaté l’apparition de souches résistantes à la colistine. L’objectif principal de ce travail de thèse a été d’étudier le(s) mécanisme(s) de résistance à la colistine chez K. pneumoniae. Afin de mener à bien notre projet, nous nous sommes intéressés à deux aspects de la problématique. Dans un premier temps, nous avons cherché à mieux comprendre ce mécanisme, en associant une étude génotypique à une étude phénotypique. Et dans un second temps, nous avons cherché des alternatives thérapeutiques, en évaluant différentes associations antibiotiques / The global spread of multidrug-resistant Gram-negative bacteria associated with a decrease in the number of new antibiotic therapies is a major public health issue. Colistin is often referred to as the "last-resort" antibiotic, used as the only therapeutic alternative for MDR Gram-negative bacteria infection, which explains the current renewal of interest in this antimicrobial agent. However, the appearance of colistin-resistant bacterial strains has been already observed. The main objective of this PhD work was to study the colistin resistance mechanism (s) in K. pneumoniae by looking at two aspects of the problem. Firstly, we sought to better understand this mechanism, associating a genotypic study with a phenotypic study. Next, we looked for therapeutic alternatives, by evaluating different antibiotic combinations

L'augmentation des résistances aux antibiotiques ces dernières années et le faible nombre de nouveaux antibiotiques récemment approuvés ont suscité un intérêt considérable pour les associations médicamenteuses. Parmi celles-ci, les associations β-lactamine-inhibiteur de β-lactamases, comme l’aztréonam-avibactam (ATM-AVI), visent à surmonter la résistance due à la production de β-lactamases, l'un des principaux mécanismes de résistance chez les bactéries à Gram négatif. Cependant, les interactions PD entre molécules associées peuvent être complexes. Afin de mieux comprendre la PK/PD de l’ATM-AVI, deux problématiques ont été abordées dans cette thèse :i. La PK de l’ATM-AVI au site infectieux. Une étude de microdialyse réalisée chez le rat avec ou sans péritonite a montré que la distribution de l’ATM-AVI dans le liquide péritonéal était rapide et que les concentrations au site infectieux pourraient être prédites à partir des concentrations sanguines.ii. L’interaction PD entre ATM et AVI. Des études de checkerboard analysées avec un modèle Emax ont permis de caractériser l’effet de l’AVI sur la CMI de l’ATM en termes d’efficacité et de puissance en présence de souches multi-résistantes. Pour compléter ces résultats, un modèle PK/PD a été développé à partir de données in vitro afin d’évaluer l’évolution de l’effet combiné de l’ATM-AVI au cours du temps et d’étudier la contribution individuelle de chacun des effets de l’AVI à l’activité combinée. Selon les résultats de cette modélisation, l’activité bactéricide de l’association serait principalement expliquée par l’effet potentialisateur de l’AVI et ce malgré sa capacité à prévenir la dégradation de l’ATM de manière efficace. / The rapid increase in antibiotic resistance during the last decades and the few numbers of recently approved new antibiotics lead to a significant interest to drug combinations. Among these combinations, the β-lactam-β-lactamase inhibitor combination, such as aztreonam-avibactam (ATM-AVI), is one strategy that aims to overcome the resistance due to β-lactamases production, one of the most relevant mechanisms of resistance in Gram-negative bacteria. However, drug interactions can be complex. To better understand the PK/PD of ATM-AVI, two issues have been addressed in this thesis: i. ATM-AVI PK at the infection site. A microdialysis study performed in rats with or without peritonitis showed that ATM and AVI distribution in intraperitoneal fluid was rapid and that concentrations at the target site could be predicted from blood concentrations.ii. PD interaction between ATM and AVI. Checkerboard experiments analyzed with an Emax model have been used to characterize AVI effect on ATM MIC in terms of efficacy and potency in the presence of various multi-drug resistant strains. A PK/PD model was developed based on in vitro data to describe the time-course of ATM-AVI combined effect and to investigate the individual contribution of each of the AVI effects to the combined activity. According to the modeling results, the combined bactericidal activity was mainly explained by AVI enhancing effect, even though AVI demonstrated high efficiency to prevent ATM hydrolysis.