The entire epidermis of patients with vitiligo exhibits accumulation of up to 10-3M concentrations of hydrogen peroxide (H₂O₂) (Schallreuter, Moore et al. 1999). Over the last decade our group and others have focused on the effect of H₂O₂-mediated oxidative stress on the function of many proteins and peptides due to oxidation of target amino acid residues in their structure including L-methionine, L-tryptophan, L-cysteine and seleno cysteine (Rokos, Beazley et al. 2002; Gillbro, Marles et al. 2004; Hasse, Kothari et al. 2005; Schallreuter, Chavan et al. 2005; Spencer, Chavan et al. 2005; Chavan, Gillbro et al. 2006; Elwary, Chavan et al. 2006; Gibbons, Wood et al. 2006; Schallreuter, Bahadoran et al. 2008; Shalbaf, Gibbons et al. 2008; Wood, Decker et al. 2009). Moreover, it was shown that patients with vitiligo possess up regulated wild type functioning p53 protein in their skin (Schallreuter, Behrens- Williams et al. 2003). The reason behind this up regulation has remained unclear (Schallreuter, Behrens-Williams et al. 2003). Therefore the aim of this thesis was to get a better understanding of these puzzling data. Along this project different techniques have been used including Western blot, dot blot, immuno precipitation, immuno fluorescence, EMSA and computer modelling. In this thesis we confirmed the previous result on up regulation of p53 in vitiligo and we showed that p90MDM2, the master regulator for p53 protein is not different in patients and healthy controls. Therefore we decided to test for expression of p76MDM2 which mediates the inhibition of p90MDM2-p53 binding. Our results show for the first time the presence and over expression of p76MDM2 protein in vitiligo compared to 3 healthy individuals. This result could provide an explanation, why up regulated p53 is not degraded in this disease. Since epidermal H₂O₂ accumulation has been extensively documented in vitiligo, we wanted to know whether other ROS could also contribute to the overall oxidative stress in this scenario. Therefore we turned our interest to nitric oxide (NO) and its possible effects on p53 protein. In order to elucidate this role in more detail, the expression levels of epidermal nitric oxide synthesase (iNOS) and the oxidation product of NO and O2 - i.e peroxynitrite (ONOO-) were investigated. Our data revealed over expression of iNOS and nitrated tyrosine residues, the foot print for ONOO-. Moreover, we show for the first time the presence of abundant nitration of p53 protein in vitiligo. In addition using purified p53 from E. coli strain (BL21/DE3) and mutant p53 protein from HT-29 cells (colon cancer cells), we show that nitration takes place in a dose and time dependent manner. On this basis we investigated the effect of both H₂O₂ and ONOO- on p53-DNA binding capacity employing EMSA, since this is the most acceptable technique to follow the binding between proteins and DNA. Our results revealed that ONOO- abrogated p53-DNA binding capacity at concentrations >300 μM, meanwhile oxidation of p53 protein with H₂O₂ at the same concentrations does not affect binding capacity. Importantly, a much higher p53- DNA binding capacity was observed after exposure to both ONOO- and H₂O₂. Taken together, p53 is regulated by both ROS (H₂O₂) and RNS (ONOO-). Next we identified the presence of phosphorylated and acetylated p53 in vitiligo. Phosphorylation of ser 9 and ser 15 residues of the protein are associated with over expressed ATM protein kinase, while acetylation of lys 373, 382 residues correlates with increased PCAF expression. We show that up regulated p53 is associated with over expressed p21 (cyclin dependent kinase inhibitor 1) and induced PCNA 4 expression. Hence, we can conclude that p53 in patients with vitiligo is up regulated, activated and functional. Finally we show up regulated BCL-2 supporting the long voiced absence of increased apoptosis in vitiligo. Given that patients with vitiligo have no increased risk for solar induced skin cancer and increased photo damage (Calanchini-Postizzi and Frenk 1987; Westerhof and Schallreuter 1997; Schallreuter, Tobin et al. 2002), despite the presence of increased DNA damage as evidenced by increased 8-oxoG levels in the skin and in the plasma, our findings suggest that both p53 and PCNA provide a powerful machinery to mediate DNA repair via hOgg1, APE1 and DNA polymerase ß (Shalbaf 2009). On this basis it is tempting to conclude that DNArepair is the overriding mechanism to combat oxidative stress in this disease.

Over the past four years, a previously unrecognised family of innate effector cells has been identified. Their comprehensive functional capabilities range from lymphoid organogenesis, tissue remodelling, wound healing, immune protection and homeostasis to contribution to inflammation and allergic responses. Here we investigate the presence and function of type 2 innate lymphoid cells (ILC2) in the skin. We show that human ILC2 are resident in human skin and express RORA and GATA3, and skin homing receptors. ILC2 further infiltrate the skin after allergen challenge, where they produce the type 2 cytokines IL-5 and IL-13. Skin-derived ILC2 express the IL-33 receptor ST2, which is up-regulated during activation. Signalling via IL-33 induces type 2 cytokine and amphiregulin expression, and increases ILC2 migration. Atopic dermatitis (AD) is a chronic inflammatory skin disorder. Current evidence suggests that both skin barrier dysfunction and immune system abnormalities, particularly those of a type 2 phenotype, contribute to disease pathogenesis. We demonstrated that ILC2 are enriched in lesional skin biopsies from atopic patients and show higher expression of cytokine receptors, reflecting an activated phenotype. Down-regulation of E-cadherin is characteristic of filaggrin insufficiency, a cardinal feature of AD. Interestingly, E-cadherin binding to KLRG1 on human ILC2 dramatically inhibits IL-5 and IL-13 production. ILC2 may contribute to increases in type 2 cytokine production in the absence of the inhibitory E-cadherin ligation through this novel mechanism of barrier sensing. CRTH2, a receptor for prostaglandin D₂ (PGD₂), is expressed by human ILC2. However, the function of CRTH2 in these cells is unclear. We sought to determine the role of PGD₂ and CRTH2 in human ILC2 and compare it with that of the established ILC2 activators IL-25 and IL-33. PGD₂ binding to CRTH2 induced ILC2 migration and production of type 2 cytokines IL-4, IL-5, IL-13 and release of other pro-inflammatory cytokines IL-3, IL-8, IL-9, IL-21, GM-CSF, and CSF-1 in a dose-dependent manner. ILC2 activation through CRTH2 also upregulated the expression of IL-33 and IL-25 receptor subunits (ST2 and IL-17RA) suggesting a synergistic role. The effects of PGD₂ on ILC2 could be mimicked by the supernatant from activated human mast cells and inhibited by a CRTH2 antagonist. Therefore, PGD₂ can be considered as an important and potent activator of ILC2 through CRTH2 mediating strong inflammatory responses. Cell surface interaction mechanisms that activate ILC2 function are unknown. We observed the expression of NKp30 on ILC2 ex vivo and after culture. Using quantitative PCR we confirmed that ILCs express NKp30c splice variant, an immune-modulatory isoform. Incubation of ILC2 with the NKp30 ligand B7H6 and tumour cell lines expressing this protein induced production of type 2 cytokines. This interaction can be inhibited by NKp30 blocking antibodies. We further established that activation of NKp30 induces the canonical pathway of NFƙB signalling. Overall the work in thesis shows for the first time that ILC2 are resident in human skin and infiltrate rapidly after allergen challenge and in AD lesional skin. We have defined cytokine and lipid mediators that contribute to migration and activation of ILC2 and shown that KLRG1 and NKp30 act as inhibitory and activatory receptors respectively. The work defines novel pathways for barrier sensing and cutaneous inflammation, and identifies potential new targets for therapeutic intervention.

Itch lies second only to disturbance of body image as a reported symptom in dermatology. This study started by concentrating on improving the measurement of itch. Itch has a paired physical response, scratch. The pairing can be exploited: preliminary work by this unit had validated the use of wrist-worn movement-measuring machines called ‘accelerometers’ to measure itch-related movement (scratch and rub). The first part of this research developed use of these machines. Simple accelerometers (‘Actiwatch Plus’) were used to observe the pattern of variation of itch over clusters of nights and in different conditions. The accelerometer scores were able to identify controls’ scores from those with itchy disease. Considerable variation (56%) was discovered in objective score between subject and considerable variation was noted (46%) even within subject. More complex accelerometers, (‘DigiTrac’) which could potentially specifically identify itch-related movement on the basis of frequency of action derived from Fast Fourier Transform (FFT), were validated against the ‘gold standard’ measurement of itch-related movement, directly observed movement (via infra red video recording). It was necessary to characterise the ‘frequency of action’ of itch on video and, as an aside, the characteristics of human itch-related movement were compared to other mammals’ itch-related movement ‘frequency of action’. The ‘frequency of action’ and video data was used to enrich the DigiTrac readouts to improve specificity of itch-related movement detection. During the accelerometer studies, an unexpected finding came to light: objective score of itch was not related to subjective score. To try to explain the lack of relationship, a 42 day longitudinal study of atopic dermatitis patients’ subjective and objective scores was undertaken. The results demonstrated autocorrelation for subjective scores, but not for the objective scores but still did not fully explain the lack of relationship. In an effort to explain the disconnect between subjective and objective scores a second tranche of experiments and the second part of this research interrogated whether the methods with which we measure disease as a whole in dermatology are robust. One study investigated whether the way patients are asked about subjective symptoms in general was resistant to the effects of focusing and framing bias. The results were reassuring as they suggested that the commonly used and recommended symptom scoring systems were robust in the face of bias. In order to assess whether perspective or perception of disease explained the disconnect, a study was designed in collaboration with the Edinburgh College of Art. A series of computer-generated images of different psoriasis severities were created and used to assess how doctors and patients assessed disease-extent. This study showed that, whilst each group had a naturally divergent opinion of extent of disease, by scoring disease using the models it was possible to unify the perspective and perception of extent. Finally, an exploratory study to reduce recall bias to a minimum, in case this had caused the disconnect between objective and subjective, was undertaken. This employed a novel questionnaire, the Day Reconstruction Method.

Photoallergic contact dermatitis (PACD) is a clinical problem that has often been poorly understood and neglected by dermatologists over recent years. This can be partly attributed to its investigation by photopatch testing (PPT) falling between the expertise of photobiologists and contact dermatitis clinicians. One result of this situation was that no European Baseline PPT series had been agreed on. To redress this, the European multi centre photopatch test study (EMCPPTS) was conceived to provide up to date information on which photoallergens are of greatest clinical relevance. Its conduct and results form the core research project of this thesis. To enable the EMCPPTS to proceed and its results to be viewed in a wider context, the other Chapters of this thesis explore important related aspects of PACD and PPT in Europe. The introduction examines the nature of PACD and PPT and reviews current photoallergens. Then, the investigation of the two photoallergens carprofen and chlorproethazine by PPT is recounted. These studies highlight deficiencies within the current European regulatory system for preventing photoallergens from reaching the marketplace, as well as providing templates for the investigation of new photoallergens in the human environment. This is followed by a pilot PPT study which provides new information on the optimum non-irritating concentration of the 19 ultraviolet sunscreen absorbers to be used in the EMCPPTS. The issue of attempting to determine the photoallergenic potential of the EMCPPTS agents with respect to exposure patterns is addressed by conducting a sunscreen survey in the UK. The EMCPPTS itself is then detailed, as well as the difficulties that can be encountered when conducting a large clinical study of this nature. The results from the EMCPPTS and other presented studies were shown to be of importance in deciding upon a new European Baseline PPT series. The process involved in deciding this series, as well as its content are described before overall conclusions and possible future studies in the domain of PACD and PPT are discussed.

La dermatoscopia es una técnica diagnóstica y no invasiva que permite observar estructuras de la epidermis y de la dermis que son invisibles a simple vista. La dermatoscopia ha demostrado incrementar la precisión diagnóstica del melanoma. En la práctica dermatológica, existen numerosos tumores no melanocíticos que deben ser tenidos en cuenta en el diagnóstico diferencial del melanoma y que deben ser caracterizados dermatoscópicamente. En la presente tesis, se describen los hallazgos dermatoscópicos de las siguientes lesiones no melanocíticas: queratosis liquenoides, dermatofibromas, angioqueratomas y granulomas piogénicos. El primer trabajo es el estudio publicado donde se han evaluado, dermatoscópicamente, un mayor número de casos de queratosis seborreicas en regresión a queratosis liquenoides. En dicho trabajo, se ha demostrado que la dermatoscopia es una técnica que permite aumentar la precisión diagnóstica de estas lesiones (100% con el uso de la técnica y sólo el 25%, sin ella) y que el patrón granular grueso azul-grisáceo o marrón-grisáceo es muy característico de este tipo de lesiones. En el segundo trabajo se ha estudiado la evolución de la transformación de las queratosis seborreicas en queratosis liquenoides, lo que ha permitido comprobar la hipótesis de que las queratosis liquenoides son un fenómeno regresivo que aparece en algunas lesiones intra-epidérmicas. Otra conclusión que se obtiene del estudio es que la dermatoscopia es una técnica que, no sólo puede mejorar nuestra precisión diagnóstica, sino que también puede ayudarnos a estudiar la evolución de lesiones dinámicas, como las queratosis liquenoides, y conocer mejor su etiopatogenia. El tercer trabajo es el estudio publicado en el que se ha evaluado dermatoscópicamente un mayor número de dermatofibromas (412). De entre los hallazgos más relevantes, destacan la presencia de estructuras vasculares en el 49.5% de los dermatofibromas, hallazgo no descrito anteriormente; la comprobación de que el patrón formado por un retículo pigmentado discreto en periferia y un parche blanco central es el más frecuente en los dermatofibromas, aunque con un porcentaje más discreto (35%); la existencia de 10 patrones nuevos asociados a los dermatofibromas, de entre los que destaca el patrón atípico, indistinguible del melanoma, en el 6% de los dermatofibromas. El cuarto trabajo es el estudio dermatoscópico publicado sobre angioqueratomas solitarios con un mayor número de casos recogidos (32). El estudio estadístico de las estructuras dermatoscópicas reveló que la estructura “lagunas oscuras” era la más característica del angioqueratoma solitario, con una sensibilidad del 93.8%, una especificidad del 99.1%, un valor predictivo positivo de 93.8% y un valor predictivo negativo del 99.1%. No se encontraron lagunas oscuras en ningún melanoma ni en ningún carcinoma basocelular. El patrón que demostró ser más característico fue el patrón 1, aunque estadísticamente no fue superior a la estructura aislada “lagunas oscuras”. La dermatoscopia ha demostrado ser especialmente útil en el diagnóstico del angioqueratoma solitario, un tumor que crea importantes dificultades diagnósticas en la clínica. Finalmente, el quinto trabajo es el estudio dermatoscópico publicado sobre granulomas piogénicos con un mayor número de casos recogidos (122). El estudio estadístico de las estructuras dermatoscópicas reveló que ninguna es 100% específica del granuloma piogénico; sin embargo, las estructuras “collarete blanquecino” y “líneas blancas en rail” demostraron una alta especificidad (91% y 81%, respectivamente). Existen 3 patrones que no se han hallado en los melanomas amelanóticos del estudio y que representan el 52% de los patrones de presentación de los granulomas piogénicos. Sin embargo, los autores del estudio consideramos que la biopsia o la exéresis de todos los granulomas piogénicos debe ser recomendada; puesto que, aunque los patrones descritos no se hayan encontrado en los melanomas del estudio, las estructuras que lo forman, sí; pudiéndose dar el caso de su coexistencia en un melanoma. / DESCRIPTION AND EVALUATION OF THE DERMOSCOPIC STRUCTURES AND PATTERNS OF NONMELANOCYTIC CUTANEOUS LESIONS AND THE DIFFERENTIAL DIAGNOSIS WITH MELANOMA Dermoscopy is an in vivo, non-invasive technique that has revealed a new dimension of clinical morphology in pigmented and non-pigmented skin lesions. Previous studies have demonstrated that the use of dermoscopy improves the clinical accuracy in diagnosing melanoma and other skin lesions and may be used to clarify patterns in order to differentiate benign from malignant lesions. This work includes five studies that tries to describe dermoscopically 4 non-melanocytic skin tumours (lichenoid keratoses, dermatofibromas, solitary angiokeratomas and pyogenic granulomas). In the first study, we evaluated dermoscopically 24 cases of seborrheic keratoses regressing to lichenoid keratoses that illustrate the intermediate stage of this phenomenon. The two most common dermoscopic patterns associated with lichenoid keratoses were the localized and diffused granular patterns that are characterized by the presence of brownish grey, reddish brown, bluish grey or whitish grey coarse granules. In the second work, we studied the natural evolution of 22 other cases of intermediate stage of the regression of seborrheic keratoses in lichenoid keratoses using sequential dermoscopy imaging in time and we observed the complete or partial disappearing of the seborrehic keratosis part in all lesions. This finding support the proposal that lichenoid keratosis represents a regressive response to a pre-existent epidermal lesion. In the third study, we evaluated dermoscopically 412 dermatofibromas. Ten dermoscopic patterns were observed. The most common pattern seen in our series (34.7% of cases) was central white patch and peripheral pigment network, but in 65.3% of the cases, dermatofibromas presented different patterns including simulators of melanoma. Moreover, we observed vascular structures in 49.5% of dermatofibromas. In the fourth work, we evaluated dermoscopically 32 solitary angiokeratomas and 224 other tumours. The dermoscopic structure known as “dark lacunas” and the pattern consisting of “dark lacunas plus whitish veil” demonstrated a high sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and reproducibility of solitary angiokeratomas. Finally, in the fifth study, we evaluated dermoscopically 122 pyogenic granulomas and 140 other reddish or pinkish tumours. Even though some dermoscopic patterns were useful in the recognition of pyogenic granulomas, dermoscopy does not substitute histology, mostly when vessels are present, since melanoma should not be ruled out. In conclusion, the present work confirms that dermoscopy is a helpful tool which may increase the clinician´s diagnostic accuracy of some non-melanocytic skin tumours and allows the observer to differentiate it from other cutaneous tumors, including malignant melanoma.

Introducción: Los carcinomas cutáneos son las neoplasias más frecuentes en los receptores de un trasplante renal (RTRs). Hasta el momento, los datos existentes sobre los factores de riesgo para el desarrollo de estos carcinomas y su posible relación con la infección por el virus del papiloma humano (VPH) en los RTRs son controvertidos.Objectivos : Investigar, prospectivamente, la incidencia acumulada de lesiones cancerosas y precancerosas así como sus factores de riesgo en un grupo RTRs con un estrecho seguimiento del área mediterránea de España. Evaluación del espectro de tipos de VPH detectados en las lesiones cutáneas de los RTRs comparándolo con los que se observen en las lesiones de los pacientes inmunocompetentes.Pacientes y métodos: Se incluyeron en el estudio 174 RTRs que fueron revisados en el momento del trasplante y cada 6 meses. Se calculó la incidencia acumulada y para analizar el papel potencial de los diferentes factores de riesgo (edad en el momento del trasplante, causa del fallo renal, duración de la diálisis previa al trasplante, tipo de régimen inmunosupresor, fototipo e historia de exposición solar ocupacional se utilizó la regresión de Cox.Resultados : Tras una media de seguimiento de 72 meses (rango 12-140), 39 pacientes (25,3%) desarrollaron 142 tumores [84 carcinomas basocelulares (CB) y 58 carcinomas escamosos (CE)]. El ratio CB/ CE fue de 1,4 : 1. La incidencia acumulada para los carcinomas cutáneos fue del 13% a los 3 años del trasplante incrementándose a un 27,5% a los 6 años y un 48% a los 10 años. Sólo la edad en el momento del trasplante y la exposición solar ocupacional demostraron ser factores de riesgo estadísticamente demostrados (P < 0,001). Hemos detectado el VPH en un 22% del total de las lesiones analizadas, el 42% de las lesiones fueron positivas y sólo se detectó VPH en 2 queratosis precancerosas y 1 un carcinoma basocelular.Conclusiones: Nuestro estudio confirma la elevada incidencia de carcinomas cutáneos de nuestro medio siendo la exposición solar ocupacional y la edad en el momento del trasplante los factores de riesgo principales para su desarrollo. Nosotros creemos que esto justifica que todos los pacientes receptores de un órgano trasplantado sean incluidos en un programa educacional sobre la prevención de los factores de riesgo y al mismo tiempo se realice un seguimiento por dermatólogos para facilitar el diagnóstico y tratamiento precoz. Creemos que a baja sensibilidad demostrada por la técnica que hemos utilizado para la detección del virus del papiloma humano no nos permite obtener conclusiones a este respecto. / Background Skin cancer is the most common malignancy occurring in kidney transplant recipients (KTRs). Available data concerning the detection of human papillomavirus in cutaneous lesions of KTRs are conflicting.Objectives: Our purpose was to investigate, prospectively, the cumulative incidence of cancerous and precancerous skin lesions as well as their risk factors in a close follow-up population of KTRs from a Mediterranean area of Spain. Evaluate the spectrum of HPV-types in cutaneous lesions from KTRs comparing it with those observed in immunocompetent patient.Patients and methods: One hundred and seventy-four consecutive KTRs were examined at the moment of transplant and then at 6-month intervals. The cumulative incidence of skin cancer was computed. To analyse the role of potential risk factors (age at transplantation, cause of renal failure, duration of pretransplant dialysis, type of immunosuppressive regimen, sun-reactive skin type and history of occupational sun exposure), the Cox regression method was used. HPV was studied, using consensus primers of L1, in 184 skin biopsy specimens corresponding to 64 KTRs and 43 immunocompetent.Results: After a median follow-up of 72 months (range, 12-140), 39 patients (25,3%) developed 142 tumours [84 basal cell carcinoma (BCC) and 58 squamous cell carcinoma (SCC)]. The BCC/SCC ratio was 1,4 : 1. The cumulative incidence for skin cancer was 13% after 3 years of graft survival, increasing to 27·5% at 6 years and 48% at 10 years. Only age at the time of transplantation and occupational sun exposure had statistical significance as risk factors (P < 0,001). We found HPV in 22% of total of cutaneous lesions tested, 42% of warts were positives and only in 2 precancerous keratoses and 1 basal cell carcinomas HPV was detected. Conclusions: Our study confirms the high incidence of non-melanoma skin cancer among KTRs in a Mediterranean population with occupational sun exposure and the patient's age at the time of transplantation being the main risk factors. We believe that all organ transplant programs should provide educational information about protecting oneself from the sun as well as include follow-up visits by dermatologists in order to facilitate early diagnosis and treatment of skin cancer.In relation to the HPV, we believe that the low sensitivity of the method used do not allow us to dispute the role of HPV in skin cancer of KTRs.

El propósito de este trabajo es estudiar una serie de pacientes afectos de enfermedades hematológicas, en edad pediátrica, sometidos a un trasplante de progenitores hemopoyéticos (TPH). Para ello se ha realizado el seguimiento del trasplante en pacientes que han recibido un trasplante alogénico deun donante de diferente sexo mediante el estudio del QUIMERISMO y se ha relacionado con diferentes parámetros clínico-biológicos; el seguimiento en pacientes que presentaban una alteración cromosómica al diagnóstico, tanto si recibían un TPH autólogo o un TPH alogénico, mediante el estudio de la ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL (EMR); y se ha evaluado la Influencia del cariotipo observado y del pronóstico de las alteraciones cromosómicas detectadas en el diagnóstico de la enfermedad, en la recaída y en la supervivencia post-trasplante.Se han obtenido los siguientes resultados:En el estudio del quimerismo se ha establecido un valor umbral del 1%, para considerar detección de células del paciente. Se han detectado células del paciente en el 42% de los casos mediante la técnica de FISH y en el 16% mediante citogenética. 10 de ellos, han presentado un QM estable, de los cuales seis mostraron un aumento de células del paciente que provocó la recaída clínica en tres; en uno de ellos se detectó el aumento de las células residuales antes de la recaída clínica. Se ha observado una relación estadísticamente significativa entre la presencia de QM y el seso del paciente (el 80% con QM eran niñas, y el 69% con QC eran niños) y el régimen de acondicionamiento (el 60% con QM habían recibido únicamente quimioterapia mientras que el 80% con QC habían recibido quimioterapia e ICT). La SG ha sido la misma para los pacientes con QM o con QC (65%) y la SLE ha sido menor para el grupo con QM (51% vs 75%).En el estudio de la EMR se ha establecido un valor umbral del 6% de núcleos con la fusión para considerar presencia de la reorganización BCR/ABL mediante FISH. Se ha detectado el cariotipo observado al diagnóstico en el 26% (10/38) de los pacientes. De los 10 pacientes que han presentado la EMR, en ocho la detección coincidió con la recaída clínica y en dos la detección se realizó antes de la recaída.EN EL estudio del CARIOTIPO Y su Influencia en la EVOLUCION POSTTRASPLANTE se ha observado que las alteraciones cromosómicas detectadas al diagnóstico de la enfermedad, han mantenido su valor pronóstico después del TPH. Se ha observado la evidencia de una peor evolución de las alteraciones en 11q23 en las LLA (han fallecido 2/4), y una evolución no tan desfavorable en las LMA (no ha fallecido ninguno de 4). En la presente serie, la presencia de un cariotipo alterado ha constituido un factor de mal pronóstico, teniendo en cuenta que la SG, la SLE ha sido menor y la PR mayor en el grupo de pacientes con cariotipo alterado. El valor pronóstico del cariotipo se ha mantenido post-TPH, teniendo en cuenta que la SG, la SLE ha sido menor y la PR mayor en el grupo de pacientes con cariotipo de pronóstico desfavorable. En la presente serie, la indicación de un TPH autólogo en le grupo de pacientes con cariotipo de mal pronóstico, no ha resultado en una mejora en la supervivencia de estos, que quizás podrían beneficiarse de un TPH alogénico no emparentado; ya que la SG y la PR ha sido del 51,8% y del 31%, respectivamente para los pacientes que recibieron un TPH alogénico y del 33% y del 75% respectivamente, para los pacientes que recibieron un TPH autólogo, siendo estas diferencias estadísticamente significativas. / In this work we have performed the follow-up of children with haematological diseases who received a progenitor cells transplantation (PCT). We have studied of chimerism in a sex-mismatched allogeneic PCT, the minimal residual disease (MRD) when the patient showed a chromosome aberration at diagnosis of the malignant disease, and we have analyzed the correlation between the karyotype at diagnosis and the outcome after of the PCT.- In the chimerism analysis we have observed a mixed chimerism (MC) we have detected more than 1% of host cells. The 42% patients showed host cells by FISH, and only the 16% by cytogenetics. Ten of them showed MC, and six of them showed a increase of the host cells, in one patient before of the clinical relapse a progressive increase of host cells was detected. The results indicate that female patients and a less intensive conditioning regimen are significantly associated with the MC status. The overall survival (OS) was similar for the patients with MC or donor chimerism (DC), and leukaemia-free survival was higher in DC than in the MC groups.- In the follow-up of MRD, BCR/ABL reorganization has been considered to exist when more than 6% of fusion nuclei was observed. The karyotype observed at diagnosis was detected 26% of patients. In two of them the karyotype showed at diagnosis was observed before of the clinical relapse.- The prognosis of the karyotype observed at diagnosis has been similar as prognostic factor in the outcome after PCT. The prognosis of 11~23 chromosome aberration in LLA was worse in LMA. To detect an abnormal karyotype at diagnosis of the disease are predictors of a poor outcome after PCT. To detect a karyotype of the worst prognosis at diagnosis of the disease are predictors of a poor outcome after PCT. The outcome of patient who showed a karyotype of worst prognosis at diagnosis of the disease and received an autologous PCT was worse the group of patients with karyotype of worst prognosis and who received an allogenic PCT.

Migraine is one of most disabling neurological disorders for which the genetic and molecular mechanisms are not fully resolved. This PhD thesis has focused on the functional characterization of two new missense mutations in CACNA1A, the pore forming subunit of the CaV2.1 channel, associated to migraine. The analysis of these mutations revealed that the functional interactions of CaV2.1 mutant channel with regulatory proteins implicated in synaptic transmission (i.e. G proteins and SNARE proteins) are altered and may be responsible for the observed clinical phenotype. Moreover, our studies also propose that mutations in CACNA1A can be not only causative of the disease but modifiers of the migraine symptoms as well. / La migranya és un dels trastorns neurològics més incapacitant les causes genètiques i moleculars del qual no estan del tot resoltes. Aquesta tesi doctoral s’ha centrat en la caracterització funcional de dues noves mutacions amb canvi de sentit en CACNA1A, la subunitat formadora del porus del canal CaV2.1, associades a migranya. L’anàlisi d’aquestes mutacions ha desvetllat que les interaccions funcionals del canal mutant CaV2.1 amb proteïnes reguladores implicades en la neurotransmissió (proteïnes G i proteïnes SNARE) estan alterades i poden ser responsables dels fenotips clínics observats. A més, els nostres estudis proposen que mutacions en CACNA1A poden no només ser causa de la malaltia sinó també modificar-ne els símptomes.

La dermatomiositis (DM) es una enfermedad sistémica de probable origen autoinmune que combina una miopatía inflamatoria, que se manifiesta por debilidad muscular proximal simétrica, con lesiones cutáneas características.Los objetivos de esta tesis fueron los siguientes:I. Caracterización fenotípica de las células de morfología dendrítica en lesiones cutáneas de DM y determinación de la presencia de marcadores de activación inmunológica ( moléculas de adhesión y HLA-DR) en las células dendríticas. Establecer las diferencias cualitativas y cuantitativas de las células dendríticas factor XIIIa positivas y las células dendríticas CD34 positivas en piel afecta y aparentemente sana de pacientes con DM y comparar con el lupus eritematoso.II. Analizar la relación entre las células del infiltrado inflamatorio y la microvasculatura dérmica con la presencia de :a) Moléculas de adhesiónb) Antígeno asociado al linfocito cutáneo.c) Depósitos del complejo de ataque de membrana.III. Caracterización fenotípica de las células de morfología dendrítica en el infiltrado inflamatorio muscular y comparación con los hallazgos cutáneos.IV. Establecer el grado de fotosensibilidad en pacientes con DM y estudio comparativo de las células dendríticas y presencia de depósitos del complejo de ataque de membrana en lesiones fotoinducidas.Los infiltrados inflamatorios focales en piel afecta de DM están compuestos fundamentalmente por linfocitos T helper, gran número de macrófagos y alguna célula de Langerhans (Hausmann y cols., 1991). Dados los avances en el campo de la inmunohistoquímica que demostraban la importancia de las células dendríticas en los procesos inmunológicos (Caux y cols.,1996) es interesante conocer si las recientemente descritas células dendríticas factor XIIIa positivas y las células dendríticas CD34 positivas forman también parte de los infiltrados inflamatorios de la DM. Los hallazgos más relevantes de esta tesis son los siguientes:El número de células dendríticas factor XIIIa positivas en el intersticio de la dermis en las lesiones cutáneas de la dermatomiositis está muy disminuido en relación con el patrón propio de la piel sana y no forman parte del infiltrado inflamatorio. Sin embargo, existe un discreto aumento de estas células en la zona perivascular de la dermis. El hecho de que la mayoría de células dendríticas factor XIIIa positivas, como hemos dicho situados preferentemente alrededor de los vasos dérmicos, expresan en su superficie los antígenos del sistema mayor de histocompatibilidad HLA-DR sugiere que estas células ejercen un papel en el desarrollo de las lesiones cutáneas, aunque por el momento es desconocido. La demostración de que existe una disminución de las células dendríticas factor XIIIa positivas en las lesiones cutáneas de la dermatomiositis apoya la teoría de que estas células serían de una estirpe celular funcionalmente similar a la de las células de Langerhans. Es un hecho previamente conocido que las células de Langerhans están prácticamente ausentes en la epidermis suprayacente a los infiltrados inflamatorios de las lesiones cutáneas de la dermatomiositis.De forma similar a lo que ocurre con las células de Langerhans, no existen células dendríticas factor XIIIa positivas en el músculo sano. Nuestro estudio ha permitido demostrar la ausencia de estas células también en el músculo afecto por la dermatomiositis. Ello representa un hecho más que apoya la evidencia de que los mecanismos que originan y desarrollan la inflamación en piel y músculo son distintos.El número de células dendríticas CD34 positivas está aumentado en el intersticio de la dermis de las lesiones cutáneas de dermatomiositis, aunque se observa una disminución de las mismas en la zona perivascular. Estudios in vitro han demostrado un aumento de las moléculas de adhesión en la zona perivascular coincidiendo con la disminución del número de células CD34 positivas. Las células CD34 positivas podrían actuar regulando (inhibiendo) la adhesión y la migración celular.Se ha comprobado un notable aumento de estas células en el tejido septal del músculo afecto por la dermatomiositis. Desde los septos, las células dendríticas CD34 positivas invaden la zona periférica del músculo en las áreas en las que existe atrofia perifascicular. Se encuentran también junto a macrófagos en las zonas donde existe necrosis de las fibras musculares así como rodeando los infiltrados inflamatorios, pero no formando parte de los mismos. El papel de las células dendríticas CD34 positivas en estos procesos inflamatorios es desconocido por el momento. El aumento de expresión de las moléculas de adhesión VCAM e ICAM-1 por estas células en relación con la piel sana es un argumento a favor de su participación específica en estos procesos.Se puede concluir, a la luz de lo explicado, que en la DM existen cambios en la distribución de las células dendríticas localizadas en la unidad microvascular dérmica, encrucijada entre la dermis y la circulación sistémica donde se cree que ocurren los cambios primarios de la DM. Posiblemente cambios antigénicos externos, cambios microambientales en las citocinas o la lesión microvascular primaria podrían resultar en un cambio en la distribución de las células dendríticas y éstas a su vez ser responsables de la respuesta inmune en la DM.El HECA-452 (marcador del antígeno asociado al linfocito cutáneo-CLA) se expresa en un 60-70% de las células de los infiltrados inflamatorios cutáneos. No existe expresión de HECA-452 en las mismas células inflamatorias del músculo. Así confirmamos que el CLA participa en el reclutamiento específico de las células inflamatorias hacia la piel afecta de DM.Se ha demostrado el depósito constante del complejo de ataque de membrana (MAC) en la unión dermoepidérmica y en los vasos del plexo vascular superficial, aunque no únicamente en la zona donde existe infiltrado inflamatorio, sino también en zonas alejadas del mismo.La radiación ultravioleta probablemente actúe como factor desencadenante de la reacción inmune anómala que ocurre en la DM en personas genéticamente predispuestos. En nuestro estudio encontramos fotosensibilidad en más de la mitad de los pacientes afectos pero sólo 3 tenían una dosis eritema mínimo patológica. Nosotros no pudimos inducir con la radiación UVB lesiones clínicamente compatibles con DM. Probablemente, y al igual que sucede en el lupus eritematoso son precisas dosis mayores y repetidas de radiación ultravioleta. El estudio de los depósitos del complejo de ataque de membrana en las lesiones cutáneas fotoinducidas muestra ya su presencia en las muestras obtenidas por biopsia realizada a las seis horas después de la exposición lumínica. Esta observación apoya la teoría que supone la participación precoz del complejo de ataque de membrana en el desarrollo de las lesiones inflamatorias de piel y músculo en la dermatomiositis. Este estudio demuestra que la radiación ultravioleta juega un papel en la etiopatogenia de la DM y consecuentemente todos los pacientes deberían minimizar su exposición solar o utilizar filtros solares de amplio espectro para reducir el empeoramiento o prevenir un brote de DM.

HIPÒTESI DE TREBALL. L'angiogènesi al melanoma maligne està influenciada per factors autocrins i paracrins, entre els que es troba el VEGF. La influència del VEGF és especialment significativa a les primeres fases del desenvolupament tumoral.La modificació de l'equilibri angiogènic actuant sobre el VEGF podria condicionar un canvi significatiu al creixement tumoral i la seva capacitat metastàtica.OBJECTIUS.1.- Valorar l'expressió de VEGF en una sèrie de melanomes malignes primaris cutanis humans de baix risc.2.- Valorar el creixement tumoral i l'angiogènesi als tumors desenvolupats en ratolins atímics inoculats ortotòpicament amb les línies de melanoma humà A375P i A375MM, coinjectades o no amb Matrigel. 3.- Avaluar la influència de la modificació genètica de l'expressió de VEGF, mitjançant la transfecció del cDNA del VEGF en sentit i antisentit a les línies de melanoma humà A375P i A375MM, als tumors desenvolupats a ratolins atímics a partir de la injecció ortotòpica d'ambdues línies així modificades.MÈTODES.1.- Melanomes humans: 53 melanomes malignes cutanis primaris. Angiogènesi: tinció amb Ulex Europaeus I. Expressió VEGF: anàlisi immunohistoquímica.2.- Expressió de VEGF a línies de melanoma humà xenoempeltades a ratolins immunodeprimits: Inoculació ortotòpica a ratolins Balb/c nude de les línies A375P i A375MM, la meitat coinjectades amb Matrigel. Angiogènesi: tinció immunohistoquímica amb Ac anti-factor VIII. Expressió VEGF: anàlisi immunohistoquímica.3.- Modificació de l'expressió de VEGF a línies de melanoma humà xenoempeltades a ratolins immunodeprimits: Construcció del cDNA del VEGF en sentit i antisentit en un vector d'expressió (pRC/CMV), transfecció mitjançant liposomes a les línies A375P i A375MM, selecció dels transfectants i inoculació ortotòpica a ratolins atímics. Extirpació de la meitat dels tumors el més aviat possible (5-6 dies), per a avaluar la malaltia en les seves fases més precoces. Per a l'altra meitat, lliure creixement, calculant les corbes de creixement i extirpant els tumors a l'assolir un volum de 1·1 cm o equivalent. Seguiment de la supervivència dels ratolins. Angiogènesi: immunotinció amb Ac anti-factor VIII.RESULTATS.1.- Melanomes humans: El VEGF ha estat present al 84,9% de melanomes avaluats.Als melanomes en fase de creixement radial (in situ), a 7 de 29 s'ha observat un grau alt d'expressió de VEGF, front 12 de 16 a melanomes amb fase vertical (p=0,002). Una vegada el melanoma era ja invasor, no s'han trobat diferències entre el grau d'expressió de VEGF i el nivell de Breslow. No s'ha trobat relació entre angiogènesi i expressió de VEGF.2.- Expressió de VEGF als tumors desenvolupats als ratolins inoculats: S'ha demostrat una major expressió de VEGF en els estadis més temprans del desenvolupament tumoral, representats aquests per aquells tumors més petits (<0,5 cm) o intervinguts més aviat (< 9 dies).3.- Efecte de la modificació de l'expressió de VEGF sobre les dues línies A375P i A375MM xenoempeltades a ratolins atímics. Transfecció cDNA del VEGF en sentit: ha incrementat significativament el creixement dels tumors a les fases inicials del desenvolupament tumoral (4 clons de 4), a la corba de creixement (2 de 4), i a la supervivència (1 de 4). Transfecció cDNA VEGF en antisentit: cap diferència repecte al control, ni a fases inicials, ni a la corba de creixement, ni a la supervivència. Angiogènesi: no diferències en la densitat vascular entre els diferents clons.CONCLUSIÓ FINAL. El VEGF és determinant a les fases inicials del desenvolupament tumoral al melanoma maligne. Més endavant perd el seu paper protagonista. Igualment, la modificació genètica de la seva expressió en un model in vivo amb línies de melanoma humà xenoempeltades a ratolins atímics té efecte només als moments inicials del creixement tumoral, perdent tota la seva influència a les fases més tardanes del desenvolupament tumoral. / We hypothesized that angiogenesis in melanoma is related to VEGF, and that the modification of the expression of VEGF could influence angiogenesis, tumour growth and metastatic capacity.First, we examined immunohistochemically the expression of VEGF in cutaneous primary melanoma. VEGF expression was graded in a scale from 0 to 3. Angiogenesis was measured with Ulex Europaeus I staining. 84,9% of tumours expressed VEGF. Vertical Growth Phase (VGP) was significatively associated with a higher intensity expression of VEGF when comparing to radial growth phase. However, once VGP had developed, there were no differences in VEGF expression between tumours. Surprisingly, VEGF expression was not related to angiogenesis.Second, in a model of human melanoma cell lines (A375P, A375MM) xenografted to nude mice, we evaluated the expression of VEGF. The most significant finding was a higher intensity expression of VEGF in tumours representing the first steps of tumour development: tumours lower than 0,5 cm in diameter and those extracted before day 9 post-inoculation demonstrated higher expression of VEGF when compared with the remainder.Third, VEGF sense and antisense cDNA were cloned to an expression vector (pRC/CMV) and transfected to A375P and A375MM melanoma cell lines with cationic liposomes; modified cell lines were xenografted to nude mice. To analyse first stages of tumour progression, half of the resultant tumours were extracted when they were minimally detectable. Growth curves of the rest of tumours were measured, and they were excised when reaching a volume of 0,4 cm3. Survival curves of mice were analysed afterwards. Angiogenesis was evaluated with Factor VIII staining.Sense VEGF transfection significatively enhanced tumour growth on initial stages of development (4 clones of 4), on growth curves (2 of 4) and on survival (1 of 4). Antisense VEGF transfection did not show any difference with control clones at any stage. Angiogenesis was not different between the clones.Conclusion: VEGF is decisive at first stages of development in melanoma. The modification of VEGF expression in an in vivo model of human melanoma cell lines xenografted to nude mice plays a role at initial stages of tumour development, losing its influence later.