Human T lymphotropic virus type -1 (HTLV-1) infections are important causes of mortality and morbidity in endemic areas worldwide. There is neither a vaccine specific for the virus nor satisfactory treatment for the associated malignancy or inflammatory syndromes. HTLV-1 associated infective dermatitis (IDH) is a chronic dermatitis that has been observed in a variable proportion of HTLV-1 infected children. IDH may serve as an early clinical marker for HTLV-1 and an indicator of increased risk for developing other HTLV-1 associated conditions such as adult T cell leukaemia/lymphoma (ATLL) and HTLV-1-associated myelopathy or transient spastic paraparesis (HAM/TSP). However the mechanisms underlying IDH and the relationships with HAM/TSP and ATLL are poorly understood. We undertook skin biopsies from 14 cases with IDH, and controls which included five asymptomatic carriers (ACs) and 18 healthy uninfected individuals from South Africa. We conducted clinical assessments, proviral load, allergen-specific IgE, peripheral blood and cutaneous T cell and virological analyses. We obtained relevant clinical history and examined all cases and controls based on a pre-formed questionnaire. Despite the partial clinical similarities with atopic dermatitis, the individuals with IDH did not have an increased incidence of atopic disease including asthma or rhinitis. Furthermore house dust mite-specific IgE levels were not elevated in the cases compared to the controls, suggesting that atopy is not a predisposing factor for the development of IDH in HTLV-1 infected individuals. Circulating proviral load was significantly higher in those with IDH compared to asymptomatic carriers and skin biopsy revealed acanthosis, and lymphocytic epidermotropism associated with a superficial perivascular and periadnexal lymphocytic infiltration of CD8+, and CD4+ T cells. Furthermore IDH associated with an infiltrate of epidermal and dermal FoxP3+ T cells and lesional down-regulation of filaggrin expression compared to non-lesional skin. We did not observe an elevation of pro-inflammatory cytokines in the sera of individuals with IDH compared to the controls. We investigated integration patterns in the skin and blood of 10 cases with IDH, and two asymptomatic carrier (AC) individuals from South Africa. We first showed that the virus is present in the skin at high levels (total mean levels of 47.09 proviral copies per 1000 cells) as comparable to that which has been observed in blood (total mean levels 137 proviral copies per 1000 cells). Using a high throughput Illumina sequencing system in collaboration with Professor Bangham, we mapped and quantified the relationship between oligoclonal proliferation of HTLV-1 infected T cells in the skin and blood of IDH patients. It was found that in IDH, a selective outgrowth of certain clones is favoured, supporting the possibility of skin-specific factors exerting positive selection on proliferation. In IDH, there was not a preferential integration of the provirus in transcriptionally active regions of the gene sites, as had been observed in other HTLV-1 associated conditions. These observations imply that the selection forces that favour oligoclonal proliferation of HTLV-1+ T cells differ fundamentally between simple HTLV-1 infection and other events associated with the dermatitis. In conclusion, these data show that HTLV-1 is not associated with an atopic diathesis. Given the lack of elevated pro-inflammatory cytokines and presence of a cutaneous infiltrate of FoxP3+ T cells, the findings suggest that high levels of HTLV-1 replication promotes a regulatory environment leading to filaggrin down-regulation, cutaneous susceptibility to infection, and secondary inflammatory skin disease. Viral integration patterns would support the presence of skin-specific positive selection, perhaps eventually leading to expansion of particular clones with the potential to develop towards ATLL. It remains to be explained whether the high viral load in IDH changes over time, more specifically in the steps leading to ATLL.

Los receptores Fc-gamma (Fc-gR) median muchas de las funciones inmunes de la IgG. Están presentes en numerosas células del sistema inmune y su activación (tras la unión al fragmento Fc de la IgG) permite el desarrollo de funciones tales como la fagocitosis, la citotoxicidad dependiente de anticuerpos y la liberación de enzimas proteolíticas. Existen polimorfismos genéticos que modifican la afinidad de los Fc-gR y por tanto su capacidad funcional. Estos polimorfismos se han relacionado con enfermedades autoinmunes, infecciosas y con la eficacia de agentes monoclonales. El penfigoide ampolloso (PA) es una patología ampollosa autoinmune caracterizada por el deposito de autoanticuerpos en la membrana basal de la piel. Estos anticuerpos activan a neutrófilos vía el receptor Fc-gR, los cuales liberan enzimas proteolíticas que degradan la membrana basal causando el daño tisular. Los agentes monoclonales han revolucionado el tratamiento de las formas moderadas y graves de psoriasis. Sin embargo, en torno a un 30% de los pacientes no presentarán una respuesta adecuada. En la actualidad no existen factores farmacogenéticos definidos que puedan predecir la respuesta a biológicos en la psoriasis. Teniendo en cuenta el contrastado papel del los Fc-gR en modelos animales de PA, los polimorfismos genéticos de Fc-gR podrían relacionarse a nivel clínico con el PA, tanto como marcadores como modificadores de esta enfermedad. Por otra parte, los polimorfismos de Fc-gR también podrían predecir la respuesta a biológicos en la psoriasis, ya que los agentes empleados (etanercept, infliximab y adalimumab) contienen el fragmento Fc en su estructura. Esta influencia podría venir dada por un aumento en las capacidades citotóxicas de estos agentes, o por una alteración de los mecanismos de eliminación de estos fármacos dependientes del sistema reticuloendotelial. El objetivo de esta tesis fue estudiar la influencia de los polimorfismos de Fc-gR en 2 patologías cutáneas inmunomediadas mediante el estudio genético de grupos de pacientes y controles. Por un lado, se pretendía detectar si los polimorfismos de Fc-gR se asocian al PA o si modifican el pronostico de esta enfermedad, y por otro, si dichos polimorfismos son marcadores farmacogenéticos de respuesta clínica en aquellos pacientes psoriásicos tratados con agentes biológicos. Se realizó estudio genético de los polimorfismos Fc-gRIIA-H131R, Fc-gRIIB-I187T y Fc-gRIIIA-V158F en un grupo de 41 pacientes con PA y un grupo control de 115 individuos sanos y de Fc-gRIIA-H131R y Fc-gRIIIA-V158F en un grupo de 70 pacientes con psoriasis tratados agentes anti-TNF-alfa. Se realizó un análisis retrospectivo de los datos clínicos de los pacientes con PA y una valoración clínica retrospectiva de la respuesta a biológicos en pacientes con psoriasis. En el caso del PA observamos, en un modelo multivariante, una tendencia a la asociación del alelo F de Fc-gRIIIA-V158F con las formas más graves de PA, definidas como la necesidad de añadir tratamiento inmunosupresor. Por otra parte, los pacientes psoriáticos con alelos de alta afinidad (aislados o en combinación) de los polimorfismos a estudio presentaron, de forma independiente, una respuesta terapéutica más rápida a terapia biológica en forma de un porcentaje de superficie corporal afecta menor a las 6-8 semanas de tratamiento, probablemente en relación con una mayor eliminación de células patogénicas con TNF-alfa en membrana. Nuestros resultados tienen implicación clínica ya que, por un lado, los pacientes con PA y presencia del alelo F, podría beneficiarse de la introducción temprana de inmunosupresores y, por otro, la presencia de alelos de alta afinidad en los polimorfismos de Fc-gR podría predecir una respuesta clínica mas precoz en pacientes con psoriasis tratados con biológicos, lo cual puede ser de especial importancia en casos graves. / Fc gamma receptors (Fc-gammaR) mediate most of the immune functions of IgG. There are single-nucleotide polimorphims affecting Fc-gammaR genes that influence affinity and thus functions of Fc-gammaR. These polymorphisms have been linked clinically with infectious and autoimmune disease but also with the degree of response to monoclonal antibodies containing the Fc fragment. Bullous pemphigoid (BP) is an autoimmune disease where pathogenic antibodies bind antigens in the basal membrane of the skin. Such antibodies activate neutrophils through Fc-gammaR, which make these cells liberate proteolytic enzymes that cause tissue injury and blisters in the skin. Monoclonal agents have improved greatly the outcome of patients with psoriasis. However up to 30% does not achieve a significant response. There are not currently pharmacogenetic markers that could predict the outcome of biological therapy in psoriasis. The main objective of this thesis was to study the influence of Fc-gammaR polymorphisms in 2 immune-mediated skin diseases: a) a possible influence, in terms of susceptibility or disease modification, of Fc-gammaR polymorphisms in BP; and b) the potential role of Fc-gammaR polymorphisms as pharmacogenetic markers in patients with psoriasis treated with anti-TNF-alpha therapy. We performed the determination of the genotype of Fc-gammaRIIA-H131R, Fc-gammaRIIB-I187T and Fc-gammaRIIIA-V158F in 41 patients with BP and 115 controls and Fc-gammaRIIA-H131R and Fc-gammaRIIIA-V158F genotypes in 70 patients with psoriasis that underwent anti-TNF-alpha treatment. Clinical charts were reviewed in order to establish correlations. In the BP study, we observed an association between the presence of Fc-gammaRIIIA-158F with the most severe forms of BP, defined as the need for immunosuppressants. With regard to the psoriasis study, we detected that patients with high affinity alleles (alone or in combination) presented a quick response to biologics, measured as a lower body surface area affected in the week 6-8. Our results present clinical implications, since for example, patients with BP harboring the F allele may benefit from an early introduction of immunosuppressants. On the other hand, the presence of Fc-gammaR high affinity alleles may predict an early response to biologics in psoriasis, which may be critical especially in severe cases.

Dada las propiedades fotoprotectoras de un extracto de Polypodium leucotomos (EPL), su administración oral podría prevenir la fotocarcinogénesis. Para comprobar esta hipótesis se llevaron a cabo cinco estudios. En el primero se determinó una notable actividad antioxidante mediante los métodos ORAC y FRAP. Otros tres estudios valoraron los efectos protectores del EPL en animales irradiados, demostrando la capacidad antitumoral del tratamiento al ralentizar el proceso carcinogénico aumentando la supervivencia. Además, el tratamiento favoreció las respuestas del sistema antioxidante, la activación de la p53 tendiendo a disminuir la proliferación celular en la epidermis, contrarrestó los signos de fotoenvejecimiento, mantuvo el número de células de Langerhans y estimuló las defensas tisulares. El último estudio, realizado en humanos, demostró que el tratamiento con cápsulas de EPL modifica parámetros relacionados con el estado oxidativo en sangre de humanos. Estos resultados avalan la efectividad del EPL administrado por vía oral como fotoprotector de acción sistémica. / Given the photoprotective properties of Polypodium leucotomos extract (EPL), it was proposed that taking it orally would prevent photocarcinogenesis. To test this hypothesis, five studies were undertaken. In the first, ORAC and FRAP methods indicated a notable antioxidant activity for the extract. Another three studies weighed the protective effects of the EPL in irradiated test animals, demonstrating its anti-tumor capacity by slowing down the progression of carcinogenesis, thereby lengthening survival. The treatment also: favored the response of the antioxidant system by activating p53 which tended to diminish epidermal cell proliferation; counteracted the signs of light-induced ageing; maintained the number of Langerhans cells; and stimulated the defenses of the tissue. The final study, undertaken in humans, showed that oral administration of encapsulated EPL modifies parameters of the oxidative state of human blood. These results attest to the effectiveness of EPL as a systemic photoprotector when administered orally.

Androgens are the main regulators of human hair growth stimulating larger, terminal hair development e.g. beard and causing scalp balding, androgenetic alopecia. Hair disorders cause psychological distress but are poorly controlled. Androgens probably act by altering regulatory paracrine factors produced by the mesenchyme-derived dermal papilla. This study aimed to investigate paracrine factors involved in androgen-regulated alopecia, particularly hepatocyte growth factor (HGF) family members, by investigating their in vivo status. Balding and non-balding scalp hair follicles and their component tissues were isolated and analysed by molecular biological methods (reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), quantitative PCR and DNA microarray analysis), cell culture and immunohistochemistry. Scalp follicles expressed a range of paracrine messenger genes. The dermal papilla, cultured dermal papilla cells and dermal sheath expressed several HGF family genes, while matrix cells only produced the receptor RON suggesting autocrine roles for HGF and MSP, but a paracrine route only for MSP. Comparing balding and non-balding follicles from the same individuals revealed the expected reduction in several keratin and keratin-related protein genes supporting this approach's validity. There were also significant differences in paracrine factors previously implicated in androgen action by in vitro studies. Several factors believed to increase during androgen stimulation of larger, darker follicles, e.g. IGF-I and SCF, were lowered in balding follicles, while putative inhibitory factors, e.g. TGFß-1, were increased. HGF and MSP and their receptors, c-Met and RON, were significantly reduced. These results increase our understanding of androgen action in human hair follicles; this could lead to better treatments for hair disorders.

Hair growth disorders cause significant psychological distress, but are poorly controlled. Since prostaglandin F₂α (PGF₂α) and prostamide F₂α analogue glaucoma treatments cause eyelash growth as side-effects, they may be useful for alopecia. How they function is unknown; possibilities include direct action on hair follicles or stimulating follicular blood flow. It is important to clarify whether scalp follicles can also respond as human follicle response to androgens differ with body site. Therefore, human scalp follicles were grown in vitro in organ culture with PGF₂α, latanoprost, a PGF₂α analogue, and bimatoprost, a prostamide F₂α analogue, with, or without, appropriate antagonists, and the presence of PGF₂α (FP) and prostamide F₂α receptors were investigated using molecular biological and immunohiostochemical methods. Each treatment significantly stimulated follicle growth rate, the percentage of growing follicles, and the amount of hair produced in a dose-responsive manner (10nM-1μM); the receptor antagonists blocked these effects. Immunohistochemistry of frozen scalp sections demonstrated FP protein only in dermal papillae and connective tissue sheaths. RT-PCR identified FP and various prostamide F₂α receptors in anagen follicles and isolated dermal papillae and bulbar connective tissue sheath, but not in bulb matrix or other epithelial tissues. Therefore, isolated human scalp hair follicles can respond biologically to PGF₂α and related pharmaceuticals in organ culture via follicular receptors and express the genes and protein for FP and prostamide F₂α receptors. PGF₂α-related drugs appear to act directly on follicles via receptors in the regulatory dermal papilla. They offer an exciting, novel approach for treating alopecia and merit clinical investigation.

El estrés oxidativo es una consecuencia directa del necesario consumo de oxígeno por parte de los organismos vivos aerobios, y su intensidad y consecuencias dependen de la capacidad de nuestros sistemas de defensa específicos para contrarrestar las especies reactivas del oxígeno (ERO) generadas, entre las cuales destacan los radicales libres del oxígeno (RLO). Numerosas circunstancias, fisiológicas o patológicas, pueden incrementar la producción de RLO y, por tanto, aumentar el estrés oxidativo. Entre ellas está la radiación UV (RUV), a la que todos nosotros estamos expuestos con mayor o menor intensidad y asiduidad.La exposición a la RUV es causa de numerosas alteraciones cutáneas, incluido el cáncer de piel. El progresivo aumento de este tipo de cáncer en las últimas décadas ha suscitado una gran preocupación sanitaria y social, por lo cual todos los aspectos relacionados con la fotoprotección son objeto de investigación desde diversos puntos de vista: físico, químico, biológico y sanitario.En este sentido, no cabe duda de que actualmente disponemos de una información muy valiosa acerca de los riesgos de la exposición a la RUV y, al mismo tiempo, existen fotoprotectores muy eficaces y desarrollados con criterios científicos avanzados. No obstante, y a pesar de que el consumo de fotoprotectores no cesa de incrementarse, la incidencia del cáncer de piel sigue aumentando. Con este trabajo pretendemos llamar la atención sobre la falsa sensación de seguridad que puede derivarse del uso incorrecto de fotoprotectores y sobre la necesidad de revisar en profundidad algunos de los conceptos sobre los que se basa la fotoprotección.En consecuencia, en el protocolo experimental desarrollado, se irradiaron lotes de animales (ratas hairless) de forma aguda, crónica o bien tratados con filtros solares. Y se determinaron parámetros bioquímicos reflejo de los radicales libres tanto en sangre como en epidermis. También se determinó el daño producido sobre el material genético, y el número y capacidad funcional de las células inmunitarias de la piel (células de Langerhans). Las principales conclusiones que se derivan de este trabajo son las siguientes:1. La RUV, a partir de dosis equivalentes a 1 DEM (dosis eritemógena mínima), induce cambios sistémicos y cutáneos en los sistemas de defensa específicos frente al estrés oxidativo, simultáneamente a la pérdida de la inmunidad cutánea.2. Dosis suberitemógenas y repetidas de RUV, asimilables a las que recibe una persona sometida a exposiciones moderadas al sol, también determinan pérdida de la inmunidad cutánea y alteraciones indicativas de desequilibrio oxidativo.3. El número de células de Langerhans de la epidermis se correlaciona con diversos parámetros sanguíneos y epidérmicos relacionados con el estrés oxidativo. El hecho de que la actividad de la glutatión peroxidasa y la concentración de glutatión reducido eritrocitarios sean predictores del número de células de Langerhans, sugiere la posibilidad de que dichos parámetros constituyan una alternativa válida para evaluar indirectamente la capacidad inmunitaria cutánea.4. La determinación del factor de protección solar, basado exclusivamente en la capacidad de prevención del eritema, no ofrece las garantías necesarias para una fotoprotección segura frente a la RUV. Es necesario adoptar nuevos criterios de fotoprotección, basados en indicadores más sensibles y precoces que el eritema.5. Los valores del factor de protección solar que presentan los fotoprotectores actuales deben someterse a un juicio crítico. En este sentido, sería prudente reducir dichos valores a la mitad o a la tercera parte.6. Puesto que muchos de los efectos de la RUV derivan del estrés oxidativo, es muy recomendable desarrollar nuevas fórmulas fotoprotectoras que incluyan principios activos capaces de restaurar el equilibrio oxidativo y de neutralizar los efectos de los radicales libres. / The oxidative stress is a direct consequence of the necessary consumption of oxygen by the living aerobic organisms, and its intensity and consequences depend on the capacity of specific defence systems to counteract the generated reactive oxygen species (ROS), among which the most relevant are the oxygen free radicals (OFR). Numerous circumstances, physiological or pathological, can increase the production of OFR and, therefore, increase the oxidative stress. Among them there is the UV radiation (UVR), to which we are all exposed with greater or smaller intensity and frequency. Exposition to UVR cause numerous cutaneous alterations, included the skin cancer. The progressive increase of this type of cancer in the last decades provoke a great social and sanitary concern; in consequence all the aspects related to photoprotection are object of investigation from different points of view: physical, chemical, biological and sanitary. In this sense, there is no doubt that at the present we have very valuable information about the risks of the exposition to the UVR and, at the same time, there are very efficient sunscreens, which are developed with advanced scientific criteria. Nevertheless, and in spite of the fact that the consumption of sunscreens increases day by day, the incidence of skin cancer increases continuously. With this work we intend to point out the false sensation of security that can be derived from the incorrect use of sunscreens and the need of a depth revision about some of the concepts which photoprotecction is based. Consequently, in the development of experimental protocols, we irradiated groups of animals (hairless rats) in the following way: acute radiations, chronic radiations and radiations with sunscreens. Different biochemical parameters related to OFR were determined in blood and in epidermis. The damage produced on the genetic material, and the number and functional capacity of the immune cells of the skin (Langerhans cells) were also evaluated. The main conclusions derived from this work are the following:1. UVR, from equivalent dose to 1 MED (minimal erithemal dose), induces systemic and cutaneous changes in the specific defence systems in front of oxidative stress, simultaneously to the loose of the cutaneous immunity. 2. Suberithemal and repeated doses of UVR, similar to the received by a person exposed to moderate sun exposure, also determine the lost of the cutaneous immunity and produce oxidative stress relative alterations.3. The number of epidermal Langerhans cells correlates with diverse blood and epidermal parameters related to oxidative stress. The fact that the eritrocytari activity of GPx and concentration of GSH can be predictors of the number of Langerhans cells, suggests the possibility that these parameters could constitute a valid alternative to indirectly evaluate the cutaneous immune capacity. 4. The evaluation of the sun protection factor (SPF), based exclusively in the capacity of prevention from erithema, does not offer the needed guarantees for a sure photoprotection against the UVR. It is necessary to adopt new criteria of photoprotection, based on premature and more sensitive indicators than the erithema. 5. The values of SPF of the sunscreens should be submitted to a critical judgment. In this sense, would be prudent the reduction of this values to the half or to the third part.Due to the fact that many of the effects of the UVR derive from the oxidative stress, is very recommendable to develop new photoprotective formulations that include capable active principles to restore the oxidative equilibrium and to neutralize the effects of free radicals.

El carcinoma basocel•lular (CBC) és la neoplàsia més freqüent en l’ésser humà. La importància d’aquest tumor rau tant en la gran morbiditat que produeix com en l’enorme despesa sanitària que ocasiona als sistemes de salut de gairebé tot el món. Malgrat que el seu tractament és essencialment quirúrgic, existeixen casos on no està indicat aquest abordatge terapèutic i seria interessant el fet de conèixer les alteracions moleculars que comporten la formació de la neoplàsia per tal d’establir possibles dianes farmacològiques. Per aquestes raons hem cregut convenient aprofundir en l’estudi d’aquest tumor, centrant-nos en la fisiopatologia i intentant cultivant-lo “in vitro”. A través de l’estudi de la síndrome de Gorlin-Goltz s’ha establert la importància de la via Sonic hedgehog (Shh) en la fisopatologia del CBC. Nosaltres, mitjançant tècniques com l’immunoblot i la immunohistoquímica (mesurant els nivells de proteïna Gli1) hem determinat que aquesta via està activada en aproximadament la meitat dels casos de CBC esporàdic, confirmant les dades que es coneixen sobre aquest tema. Analitzant vies alternatives, hem trobat mostres amb alta activitat de b-catenina sense afectació de la via Shh i això ens fa pensar que la via Wnt pot tenir un paper fonamental en aquests casos. Hem detectat per immunoblot l’acumulació de b-catenina en la meitat dels casos estudiats, relacionat-se de forma directa amb l’activitat proliferativa de la neoplasia. / El carcinoma basocelular (CBC) es la neoplasia más frecuente en el ser humano. La importancia de este tumor radica tanto en la gran morbilidad que produce como en el enorme gasto sanitario que ocasiona a los sistemas de salud de casi todo el mundo. A pesar de que su tratamiento es esencialmente quirúrgico, existen casos donde no está indicado este abordaje terapéutico y sería interesante el hecho de conocer las alteraciones moleculares que comportan la formación la neoplasia para establecer posibles dianas farmacológicas. Por estas razones hemos creído conveniente profundizar en el estudio de este tumor, centrándonos en la fisiopatología e intentando su cultivo “in vitro”. A través del estudio del síndrome de Gorlin-Goltz se ha establecido la importancia de la via Sonic hedgehog (Shh) en la fisiopatología del CBC. Nosotros, mediante técnicas como el inmunoblot y la inmunohistoquímica (midiendo los niveles de proteína Gli1) hemos determinado que esta vía está activada en aproximadamente la mitad de los casos de CBC esporádico, confirmando los datos que se conocían sobre este tema. Analizando vías alternativas, hemos encontrado muestras con alta actividad de b-catenina sin afectación de la vía Shh y esto nos hace pensar que la vía Wnt puede tener un papel fundamental en estos casos. Hemos detectado por inmunoblot la acumulación de b-catenina en la mitad de los casos estudiados, relacionándose de forma directa con la actividad proliferativa de la neoplasia. / Basal cell carcinoma (BCC) is the most common malignancy in humans. The importance of this tumor lies both in the high morbidity produced as in the high costs caused to the health systems of whole world. Although its treatment is essentially surgical, there are cases where it is not indicated this therapeutic approach, then it would be interesting to know the molecular alterations that involve the formation of this neoplasm to establish potential drug targets.For these reasons we have decided to study this tumor, focusing on the physiopathology and their culture "in vitro". Through the study of Gorlin-Goltz syndrome, the importance of the Sonic hedgehog pathway (Shh) in the pathophysiology of BCC was well established. Using techniques such as immunoblotting and immunohistochemistry (measuring protein levels Gli1), we have determined that this pathway is activated in about half of cases of sporadic BCC, confirming the previously known data. Analyzing alternative pathways, we found samples with high activity of b-catenin pathway without affecting Shh. This fact makes us think that the Wnt pathway may have a important role in these cases. We detected by immunoblot the accumulation b-catenin in half of the cases studied, interacting directly with the proliferative activity of the neoplasm.

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Tesis por compendio de publicaciones / Melanoma is the most aggressive form of skin cancer and it is highly resistant to all current modalities of cancer therapy, including cytotoxic drugs as methotrexate (MTX), an antifolate widely used in clinical oncology against many cancer types. Recently, our lab discovered a new melanoma-specific mechanism of MTX resistance by which folate receptor α (FR-α)–mediated endocytotic transport of MTX facilitates melanosomal drug sequestration and cellular export in melanoma cells, thereby reducing the accumulation of MTX in intracellular compartments. That low MTX intracellular concentration is just able to induce cell growth arrest, but not cell death in melanoma cells. Particularly, we found that melanoma treatment with MTX induces cell cycle arrest without inducing apoptosis, activates melanin synthesis and melanosome biogenesis, and accelerates melanosomal export; but the cellular and molecular processes by which MTX mediates all these effects had not been elucidated. The Main Objective of the present PhD Thesis was the identification of the molecular basis of the cell cycle arrest, the activation of melanogenesis and the acceleration of melanosome transport induced by MTX treatment that, collectively, protect melanoma cells against MTX-induced apoptosis. The Secondary Objective, was the development of new therapeutic strategies combining MTX with drugs directed against molecular targets that are key components of the mechanisms of melanoma resistance to MTX. Regarding the Techniques and Instrumentation, we used several experimental models, including melanoma and non melanoma cell lines, an artificial skin melanoma model, and mice melanoma xenografts. We also employed a battery of cell biology techniques (viability, apoptosis and migration assays; electronic and optical microscopy; flow citometry; immunohistochemistry, immunofluorescence, etc.); biochemistry techniques (western blotting, protein immunoprecipitation, mass spectrometry, enzymatic activity determination by UV-VIS espectroscopy, etc.); molecular biology techniques (nucleic acid extraction, PCR, RT-qPCR, chromatin immunoprecipitation, etc.). The Results of the implementation of these techniques were subjected to the appropriate statistical tests and are summarized bellow. Since the ability of cells to delay cell cycle progression and halt DNA synthesis represents a defensive mechanism that spares potential toxicity, firstly we focused on deciphering the molecular basis of the MTX-induced cell cycle arrest. We identified the transcription factor E2F1 and the checkpoint kinase 1 (Chk1) as key mediators of this mechanism of resistance. The results indicated that MTX stimulated the transcriptional activity of E2F1 on the promoters of dihydrofolate reductase (DHFR) and thymidylate synthase (TS), which lead to an increase in the dTTP levels, instead of dTTP depletion as occurs in MTX-sensible cells. Since dTTP is an allosteric inhibitor of ribonucleotide reductase, which is necessary for the synthesis of all the dNTPs, dTTP excess induced DNA replication fork stress that activates the ATR/Chk1 DNA damage signaling pathway. Under these conditions, melanoma cells were protected from apoptosis by arresting their cell cycle in early S-phase. However, abrogation of this checkpoint by CHEK1 silencing or by UCN-01 (7-hydroxystaurosporine)-mediated Chk1 inhibition, rapidly triggered MTX-induced cell death, suggesting that inhibition of Chk1 in combination with this kind of antimetabolite chemotherapy is a viable therapeutic strategy to overcome melanoma resistance. Secondly, we focused on the study of the activation of melanogenesis observed after MTX treatment. Our results showed that Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) that normally acts as a master regulator of melanocyte development, function and survival, is responsible for the activation of melanogenesis in melanoma after MTX treatment. In fact, MTX treatment increases the expression of this transcription factor which in turn induces the expression of melanocytic differentiation genes driving melanin production and melanosome biogenesis as tyrosinase (TYR). The increased TYR expression in response to MTX-mediated MITF activation provided an opportunity to design a two step strategy consisting in the combination of MTX with a prodrug that our group had previously designed to be activated by TYR. This prodrug is a compound called 3-O-(3,4,5-trimethoxybenzoyl)-(-)-epicatechin (TMECG) that inhibits the enzyme DHFR with high affinity. The combination of MTX and TMECG was able to induce depletion of thymidine pools, double-strand DNA breaks, and highly efficient E2F1-mediated apoptosis in vitro and in vivo. Recently, it has been recognized that MITF acts as a melanoma rheostat in determining tumor subpopulation identity. In melanomas, reduced MITF expression leads to G1 arrested, invasive cells with stem-like properties including the ability to initiate tumors with high efficiency. By contrast, elevated MITF leads to activation of differentiation genes. In between, intermediate levels of MITF allow the proliferation of melanoma cells. Consequently, tumors comprise a mix of MITF-positive and negative melanoma cells. Therefore, the increase of MITF expression by MTX treatment would drive heterogeneous populations of tumor cells to a differentiated and less invasive phenotype and, at the same time, would sensitize these differentiated cells to the TYR-processed prodrug TMECG in a cell-specific fashion. In a different approach, we explored the molecular basis of the activation of the transport of melanosomes observed after MTX treatment with the aim of designing a therapeutic strategy driven to block the MTX export within melanosomes. We identified a new MTX-activated molecular pathway involved in the export of melanosomes, in which the motor protein MyosinVa (MyoVa) plays a key role. Our results demonstrated that melanoma treatment with MTX leads to Akt2-dependent MyoVa phosphorylation, which enhances its ability to interact with melanosomes and accelerates their exportation. Due to these findings, we designed a combined therapy driven to block this MyoVa/Akt2 pathway. Because UCN-01 is also a potent inhibitor of PDK1, which activates Akt by phosphorylation, we hypothesized that the inhibition of this Akt2 phosphorylation by UCN-01 may result in the disruption of MTX stimulated melanosome transport. In fact, MTX/UCN-01 combined therapy prevented MTX export by blocking melanosome transport and was able to induce a highly efficient E2F1-mediated apoptosis in culture and in vivo. In summary, we observed that the combination of MTX and UCN-01 may represent a therapeutic option for the treatment of this evasive disease / El melanoma es el tipo de cáncer de piel más agresivo y muestra una alta resistencia frente a todas las terapias anticancerígenas disponibles en la actualidad, incluyendo agentes citotóxicos como el metotrexato (MTX), un antifolato ampliamente utilizado en oncología clínica. Recientemente, nuestro laboratorio ha descubierto un nuevo mecanismo de resistencia al MTX específico de las células de melanoma por el cual, la endocitosis de esta droga mediada por el receptor de fólico α (FR-α) conduce al secuestro del MTX en los melanosomas y a su expulsión al exterior celular, reduciendo así la acumulación de esta droga en los compartimentos intracelulares. Esta baja concentración de MTX en el interior celular es capaz únicamente de inducir un arresto del crecimiento, pero no de inducir la muerte de las células de melanoma. Por tanto, se sabía que el tratamiento con MTX es capaz de inducir arresto del ciclo celular sin inducir apoptosis, de activar la síntesis de melanina y la biogénesis de melanosomas, y de acelerar el transporte de melanosomas, pero los mecanismos celulares y moleculares por los cuales el MTX mediaba estos efectos era desconocido. El Objetivo Principal de esta Tesis Doctoral fue la identificación de las bases moleculares del arresto del ciclo celular, de la activación de la melanogénesis y de la aceleración del transporte melanosomal inducidos por el tratamiento con MTX que, en conjunto, protegen a las células de melanoma de la apoptosis inducida por el MTX. El Objetivo Secundario fue el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas combinando el MTX con agentes dirigidos frente a dianas moleculares clave en los mecanismos de resistencia. En cuanto a las Técnicas e Instrumentación, se emplearon como modelos experimentales varias líneas celulares de melanoma y de otros tipos de cáncer, un modelo de melanoma de piel artificial y un modelo de xenoinjerto de melanoma en ratón. Además, empleamos una batería de técnicas de biología celular (ensayos de viabilidad, apoptosis y migración; microscopía óptica y electrónica; inmunohistoquímica; inmunoflorescencia, etc.); técnicas de bioquímica (western blot, inmunoprecipitación de proteínas, espectrometría de masas, determinación de actividad enzimática mediante espectroscopía UV-VIS, etc.); técnicas de biología molecular (extracción de ácidos nucleicos, PCR, RT-qPCR, inmunoprecipitación de cromatina, etc.) Los Resultados de la implementación de las citadas técnicas fueron sometidos a las pruebas estadísticas apropiadas y se resumen a continuación: Dado que se ha descrito que la capacidad de las células de detener la síntesis de ADN constituye un mecanismo de defensa que evita posibles daños, en primer lugar nos centramos en descifrar las bases moleculares del arresto del ciclo celular inducido por el MTX. Así, identificamos al factor de transcripción E2F1 y a la quinasa Chk1 como mediadores de este mecanismo de resistencia. Nuestros resultados demostraron que el tratamiento con MTX estimulaba la actividad transcripcional de E2F1 sobre los promotores de los genes de la dihidrofolato reductasa (DHFR) y la timidilato sintasa (TS). Esto conducía a un incremento en los niveles de dTTP, en lugar de a una depleción de dTTP, como ocurre en células sensibles al MTX. Puesto que el dTTP es un inhibidor alostérico de la ribonucleótido reductasa que es necesaria para la síntesis de todos los dNTPs, este exceso de dTTP inducía un estrés en las horquillas de replicación capaz de activar la vía de señalización del daño al ADN mediada por ATR/Chk1. En estas condiciones, las células de melanoma evitan la apoptosis mediante el arresto de su ciclo celular al inicio de la fase S. Sin embargo, la eliminación de este checkpoint mediante el silenciamiento genético de CHEK1 o mediante la inhibición de esta quinasa con UCN-01 (7-hidroxistaurosporina) tras el tratamiento con MTX desencadena rápidamente la muerte celular, sugiriendo que la inhibición de Chk1 en combinación con este tipo de antimetabolitos es una estrategia terapéutica eficaz para vencer la resistencia del melanoma. En segundo lugar, nos centramos en el estudio de la activación de la melanogénesis por el MTX. Nuestros resultados demostraron que el factor de transcripción MITF (Microphthalmia-associated transcription factor) que, en melanocitos normales actúa como un regulador clave del desarrollo, función y supervivencia, era el responsable de la activación de la melanogénesis tras el tratamiento con MTX. De hecho, el MTX incrementa la expresión de este factor de transcripción el cual, a su vez, induce la expresión de genes implicados en la diferenciación melanocítica que conducen a la producción de melanina, como la enzima tirosinasa (TYR), y a la biogénesis de melanosomas. Este aumento en la expresión de TYR en respuesta a la activación de MITF mediada por MTX nos permitió diseñar una estrategia terapéutica basada en la combinación de MTX con una prodroga activada por TYR que había sido sintetizada previamente en nuestro laboratorio. Esta prodroga es el compuesto denominado 3-O-(3,4,5-trimetoxibenzoil)-(-)-epicatequina (TMECG), capaz de inhibir a la enzima DHFR con una alta afinidad. La combinación MTX/TMECG fue capaz de inducir el agotamiento de las reservas de timidina, roturas de doble cadena en el ADN y la apoptosis mediada por E2F1 con una alta eficacia, tanto in vitro como in vivo. Recientemente se ha descrito que MITF actúa como un reóstato en melanoma, determinando la identidad de las distintas subpoblaciones tumorales. Según este modelo, bajos niveles de MITF dan lugar a células arrestadas en G1, altamente invasivas con propiedades de célula madre, incluyendo una alta capacidad de iniciar tumores. Por el contrario, niveles elevados de MITF conducen a la activación de genes de diferenciación. Entre ambos, niveles intermedios de MITF permiten la proliferación de las células de melanoma. En consecuencia, los tumores suponen una mezcla de células con distintos niveles de MITF. Por tanto, el aumento de la expresión de MITF por el tratamiento con MTX conduciría a las poblaciones heterogéneas de células tumorales hacia un fenotipo común, diferenciado y menos invasivo, y, al mismo tiempo, sensibilizaría a estas células diferenciadas a una prodroga activada por TYR como el TMECG. En una aproximación diferente, estudiamos las bases moleculares de la activación del transporte de melanosomas inducida por el tratamiento con MTX. En este sentido, identificamos una nueva vía molecular implicada en la exportación de melanosomas en la que juega un papel esencial la proteína motora Miosina Va (MyoVa). Nuestros resultados demostraron que el tratamiento del melanoma con MTX conduce a una fosforilación de MyoVa mediada por Akt2 que incrementa la capacidad de esta proteína de interaccionar con los melanosomas y acelera su exportación. En vista de estos hallazgos, diseñamos una terapia combinada encaminada a bloquear la activación del transporte mediada por esta vía. Dado que se ha descrito que el UCN-01 es un potente inhibidor de PDK1, la cual activa a Akt por fosforilación, diseñamos una terapia de MTX combinado con UCN-01 para bloquear el transporte melanosomal. Efectivamente, la terapia combinada MTX/UCN-01 logró evitar la exportación de MTX mediante el bloqueo del transporte melanosomal y fue capaz de inducir la apoptosis mediada por E2F1 con una alta eficiencia tanto in vitro como in vivo.

This research charts the long cultural trajectory of albinism from early modern travel encounters and Enlightenment exhibitions to medical classification and biological experimentation. It argues the whiteness of albinism functioned as a visible provocation to thinkers involved in work crucial to major conceptual developments in western science and medicine. It stresses this rare complexion was a prism through which medical and scientific researchers studied human variation, disease and inheritance. It examines how albinism paralleled a broader historical production of modern racial and pathological identities. T¬his research traces medico-scientific discourses in order to understand their affect on people diagnosed with albinism. It commences with analysis of ‘unusually white’ people in travel narratives and Enlightenment ephemera between 1650-1799. It bridges plural representations of ‘unusual whiteness’ as sub-human or racially distinct with the crystallisation from the 1770s of a pathological definition for ‘leucoethiopia’. It demonstrates circulation of medical case studies and the formal classification of albinism as congenital disease by medical men in 1822 reflected a far-reaching revolution in medical thought and practice across Europe. It links this medical paradigm shift with the rise of heredity theory from the 1850s. It argues widespread experimentation with albino animals supported fierce early twentieth-century debates among biologists about Mendel’s laws of heredity. It concludes with analysis of the dialectic between medical knowledge about albinism and ‘albino’ identities. It argues people with albinism both internalised and camouflaged medical associations with defect through the adoption of class privilege and individual social tactics. Overall, this research makes a significant claim to rethink the histories of race, disability and medicine. It spotlights albinism as a critical nexus to understand the making of the normal and the pathological body, and it pinpoints the unstable relationship between medical diagnosis and individual agency.