Η μυασθένεια gravis (Myasthenia gravis, MG) είναι μία αυτοάνοση νόσος η οποία επηρεάζει την ομαλή λειτουργία της νευρομυϊκής σύναψης. Το μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών (80-85%) εμφανίζουν αντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (AChR), ενώ 5-7% των ασθενών εμφανίζουν αντισώματα έναντι της ειδικής κινάσης μυϊκής (MuSK). Η MuSK είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη της νευρομυϊκής σύναψης αλλά επίσης, εκφράζεται και στην ώριμη νευρομυϊκή σύναψη όπου εμπλέκεται, μέσω της αγρίνης, στην αγκυροβόληση των υποδοχέων της ακετυλοχολίνης στη μεμβράνη. Η MuSK αποτελείται από μια εξωκυτταρική περιοχή (ECD), η οποία περιέχει τρεις περιοχές τύπου–ανοσοσφαιρίνης (Ig-like) και μια περιοχή πλούσια σε κυστεΐνες (Fz), μια διαμεμβρανική και μία κυτταροπλασματική περιοχή η οποία περιέχει την καταλυτική περιοχή της κινάσης. Οι θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη μυασθένεια είναι μη ειδικές και περιλαμβάνουν τη χορήγηση ουσιών που αναστέλλουν τη δράση της ακετυλοχολινεστεράσης, ανοσοκατασταλτικών και ανοσορυθμιστικών φαρμάκων, ενδοφλέβιων ανοσοσφαιρινών καθώς και την πλασμαφαίρεση. Ωστόσο, η ανοσοκαταστολή συχνά συνδέεται με σοβαρές παρενέργειες ενώ κατά τη χορήγηση ενδοφλέβιων ανοσοσφαιρινών, η πιθανότητα μετάγγισης άγνωστων μέχρι στιγμής μολυσματικών παραγόντων δεν μπορεί να αποκλειστεί. Επιπλέον, σε καμία από τις παραπάνω θεραπευτικές προσεγγίσεις δεν στοχεύονται επιλεκτικά τα αντισώματα και ταυτόχρονα συνοδεύονται από υψηλό κόστος εφαρμογής και περιορισμένη διαθεσιμότητα. Μια υποσχόμενη αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για την MuSK μυασθένεια αποτελεί η μέθοδος της ανοσοπροσρόφησης. Η βασική αρχή αυτή της προσέγγισης έγκειται στην ακινητοποίηση της εξωκυτταρικής περιοχής της MuSK ως ανοσοπροσροφητή σε ένα σταθερό υπόστρωμα, κατασκευάζοντας έτσι ανοσοπροσροφητικές στήλες οι οποίες θα αφαιρούν από τον ορό του ασθενούς μόνο τα MuSK αντισώματα. Η παρούσα εργασία, είχε ως στόχο την έκφραση και το χαρακτηρισμό της εξωκυτταρικής περιοχής της MuSK σε διάφορα συστήματα έκφρασης στοχεύοντας στη δημιουργία ενός ανοσοπροσροφητή ο οποίος παράγεται σε μεγάλες ποσότητες αλλά και σε μία διαμόρφωση η οποία είναι ικανή να αναγνωρίζεται από την πλειονότητα των MuSK αντισωμάτων. Με σκοπό τη δημιουργία κατάλληλων ανοσοπροσροφητών εκφράστηκαν δύο διαφορετικές πρωτεΐνες, όπου η μία αποτελείται από ολόκληρο το εξωκυτταρικό τμήμα της MuSK (MuSK-ECDf) ενώ η άλλη είναι μικρότερη αφού υπολείπεται την περιοχή πλούσια σε κυστεΐνες (MuSK-ECDΔFz). Οι προσπάθειες στα συστήματα έκφρασης COS-7, HEK293 και E.coli απέβησαν άκαρπες αφού είτε οι πρωτεΐνες δεν εκφράστηκαν στη σωστή διαμόρφωση ή δεν αποδείχθηκαν κατάλληλοι ανοσοπροσροφητές. Και οι δύο πρωτεΐνες εκφράστηκαν επιτυχώς στο ετερόλογο σύστημα P. pastoris σε διαλυτή μορφή και σε ικανοποιητικά επίπεδα έκφρασης με την MuSK-ECDf πρωτεΐνη να εμφανίζει καλύτερα επίπεδα έκφρασης. Μετά τον καθαρισμό των δύο πρωτεϊνών με χρωματογραφίες συγγένειας και μοριακής διήθησης, οι πρωτεΐνες ακινητοποιήθηκαν σε υπόστρωμα σεφαρόζης και ακολούθησε ο χαρακτηρισμός τους ως ανοσοπροσροφητές. Και οι δύο ανοσοπροσροφητές έχουν τη δυνατότητα να αφαιρούν την πλειονότητα των MuSK αντισωμάτων από τον ορό των MuSK-μυασθενών με τον MuSK-ECDΔFz ανοσοπροσροφητή να εμφανίζει μικρότερη ικανότητα πρόσδεσης αντισωμάτων σε ορισμένους ορούς. Ο χαρακτηρισμός των δύο ανοσοπροσροφητών έδειξε ότι και οι δύο είναι ειδικοί για τα MuSK αντισώματα, μπορούν να αφαιρούν μεγάλες ποσότητες MuSK αντισωμάτων από τον ορό MuSK-μυασθενών, μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν, να αποθηκευτούν για μεγάλο χρονικό διάστημα και επίσης, παραμένουν σταθεροί στο υπόστρωμα σεφαρόζης κατά τη διάρκεια της ανοσοπροσρόφησης. Όι παραπάνω παράμετροι μπορούν να οδηγήσουν σε μία θεραπευτική προσέγγιση με χαμηλό κόστος για τον ασθενή αλλά ιδιαίτερα αποτελεσματική ως προς την αφαίρεση μόνο των παθογόνων MuSK αντισωμάτων. Στη συνέχεια, ακολούθησαν πειράματα χρησιμοποιώντας ζώα εργαστηρίου στα οποία φάνηκε ότι τα πειράματα ανοσοπροσρόφησης με τον MuSK-ECDf ανοσοπροσροφητή δεν εμφανίζουν καμία τοξική επίδραση σε κουνέλια. Επίσης, με πειράματα παθητικής μεταφοράς σε ποντίκια αποδείχθηκε η αποτελεσματικότητα των ανοσοπροσροφητικών στηλών να αφαιρούν τα MuSK αντισώματα από τον ορό των MuSK-μυασθενών όπως επίσης και η παθογονικότητα των απομονωμένων MuSK αντισωμάτων. Όλα τα παραπάνω αποτελέσματα καθιστούν εφικτή την ανάπτυξη μίας νέας θεραπευτικής προσέγγισης για τη MuSK μυασθένεια με χαμηλό κόστος για τον ασθενή και με το πλεονέκτημα της επιλεκτικής αφαίρεσης των MuSK αντισωμάτων από τον ορό. / Myasthenia gravis (MG) is an antibody-mediated autoimmune disease that affects the neuromuscular junction (NMJ). About 85% of MG patients have antibodies against the muscle nicotinic acetylcholine receptor (AChR), while about 5-7% of patients have antibodies against the muscle specific kinase (MuSK). MuSK is important during the development of the NMJ and it is also expressed at the mature NMJ, where it mediates the agrin-induced clustering of AChRs. MuSK is a transmembrane protein which consists of an extracellular region, a transmembrane domain and an intracellular, tyrosine kinase, catalytic domain. The extracellular domain (ECD) consists of three immunoglobulin–like (Ig) domains and a cysteine-rich domain (CRD). Current treatments of MG, such as cholinesterase inhibitors, immunosuppressive agents, intravenous immunoglobulin, thymectomy and plasmapheresis, are non specific, causing several side effects such as the removal of indispensable plasma components observed by plasmapheresis. We aim to develop an antigen-specific therapy in which only MuSK antibodies will be removed from patients’ sera using the immobilized MuSK-ECD as immunoadsorbent. Furthermore, the above treatments are not specific for the removal of the pathogenic antibodies and also, they have high cost and limited availability for the patients. The selective removal of MuSK antibodies from the blood of MuSK-MG patients with an extracorporeal technique similar to plasmapheresis could be a therapeutic option. The method is based on the immobilization of the extracellular domain (ECD) of MuSK as immunoabsorbent in an appropriate substrate for the construction of immunoadsorption columns which remove the MuSK antibodies from the MuSK-MG sera. The purpose of the current project was the expression of the ECD of MuSK in different expression systems in high amounts with appropriate conformation for the recognition of the majority of the MuSK antibodies and their use as immunoabsorbents. For the development of the appropriate immunoabsorbents, two different proteins were expressed; the one consisted of the whole ECD of MuSK (MuSK-ECDf) and the other was smaller because of the lack of the cysteine-rich region (MuSK-ECDΔFz). All efforts for protein expression in COS-7, HEK293 and E. coli were not successful because either the expression proteins were not in appropriate conformation or they worked not efficiently as immunoabsorbents. However, both proteins were expressed successfully in the heterologous system P. pastoris as secreted soluble proteins with satisfactory expression yields and much higher expression yield of MuSK-ECDΔFz than that of MuSK-ECDf. After the protein purification using metal affinity and gel filtration chromatography, the proteins were immobilized on CNBr activated sepharose beads and characterized as immunoabsorbents. Both immunoabsorbents remove effectively the majority of the MuSK antibodies from MG patients’ sera with the MuSK-ECDΔFz immunoadsorbent to show lower binding affinity in some sera. Further, both immunoaborbents are specific for the MuSK antibodies, show high binding capacity, are recyclable, can be stored effectively and are stable during the immunoadsorption. Furthermore, animal experiments showed that the ex-vivo clearance of plasma with the immobilized MuSK-ECDf had no toxic effects in rabbits. Finally, passive transfer experiments in mice showed the effectiveness of the immunoadsorption columns regarding the removal of the MuSK antibodies from patients’ sera and also, the pathogenicity of the removed MuSK antibodies. In conclusion, the above results are expected to lead to a therapeutic approach using the MuSK-ECD as specific immunoadsorbent for the ex vivo clearance of the MuSK-MG plasma and in parallel with a small cost for the patient.

Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης, μέλη της υπερ-οικογένειας των ιοντικών διαύλων ενεργοποιούμενων από προσδέτη, είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες μεγέθους ~290 kDa. Ανάλογα με την τοπολογία και τα φαρμακολογικά τους χαρακτηριστικά οι νικοτινικοί υποδοχείς διακρίνονται σε νευρικούς και μυϊκούς υποδοχείς. Οι νευρικοί υποδοχείς εκφράζονται κυρίως στα περιφερειακά γάγγλια και σε συγκεκριμένα τμήματα του εγκεφάλου, καθώς και σε μη νευρικούς ιστούς όπως είναι τα επιθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Οι μυϊκοί υποδοχείς απαντώνται στις μετασυναπτικές μεμβράνες των νευρομυϊκών συνάψεων των σπονδυλωτών, όπου ενέχονται στη διαβίβαση της νευρικής ώσης στους μυς και στα ηλεκτρικά όργανα ορισμένων ψαριών. Επιπλέον από το φυσιολογικό του ρόλο, ο μυϊκός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης αποτελεί στόχο για πολλά κληρονομικά και επίκτητα νοσήματα, με σημαντικότερο και καλύτερα μελετημένο το αυτοάνοσο νόσημα μυασθένεια. Στο μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών με μυασθένεια (~80%) ανιχνεύονται στο ορό αυτοαντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (αντί-υποδοχέα αντισώματα) τα οποία οδηγούν στην ελάττωση των διαθέσιμων λειτουργικών υποδοχέων στη νευρομυϊκή σύναψη. Η μείωση του αριθμού των υποδοχέων προκαλεί αδυναμία δέσμευσης της ακετυλοχολίνης από τη μετασυναπτική μεμβράνη, αναστολή της σύσπασης του μυ και εκδήλωση μυϊκής κόπωσης και αδυναμίας, συμπτώματα χαρακτηριστικά της μυασθένειας. Οι υποδοχείς της μετασυναπτικής μεμβράνης δύνανται να ελαττωθούν μέσω δράσης του συμπληρώματος, αντιγονικής τροποποίησης ή λειτουργικής παρεμπόδισης. Οι σύγχρονες θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη μυασθένεια είναι μη ειδικές και περιλαμβάνουν τη χορήγηση ουσιών που αναστέλλουν τη δράση της ακετυλοχολινεστεράσης, ανοσοκατασταλτικών και ανοσορυθμιστικών φαρμάκων, ενδοφλέβιων ανοσοσφαιρινών καθώς και την πλασμαφαίρεση. Μια υποσχόμενη αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για την μυασθένεια αποτελεί η μέθοδος της αναοσοπροσρόφησης. Η βασική αρχή αυτή της προσέγγισης έγκειται στην ακινητοποίηση των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα ως ανοσοπροσροφητών σε ένα σταθερό υπόστρωμα, κατασκευάζοντας έτσι ανοσοπροσροφητικές στήλες. Για την προσέγγιση αυτή απαραίτητη είναι η απόκτηση ενός ανοσοπροσροφητή με διαμόρφωση που να προσομοιάζει αυτή του αντιγόνου-στόχου. Ωστόσο, η απόκτηση μεγάλων ποσοτήτων του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης καθίσταται εξαιρετικά δύσκολη εξαιτίας του μεγάλου μεγέθους του, του υδρόφοβου χαρακτήρα του και της αδυναμίας απομόνωσης του σε μεγάλες ποσότητες από φυσικές πηγές. Για τους λόγους αυτούς, η έρευνα προσανατολίζεται στην μελέτη των εξωκυτταρικών περιοχών (ΕΚΠ) του ανθρώπινου νικοτινικού υποδοχέα στις οποίες προσδένεται η πλειονότητα των αυτοαντισωμάτων των μυασθενών. Η καθήλωση ανασυνδυασμένων ΕΚΠ των υπομονάδων α1, β, γ, δ και ε του υποδοχέα ως ανοσοπροσροφητών εκφρασμένων στο ετερόλογο σύστημα Pichia pastoris είχε περιγραφεί και προηγουμένως από το εργαστήριό μας. Ωστόσο, αν και η χρήση των πρωτεϊνών αυτών ως ανοσοπροσροφητών κατάφερε την αφαίρεση ενός ποσοστού αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών, δεν επετεύχθη η ικανοποιητική απομάκρυνσή τους. Η παρούσα εργασία, είχε ως στόχο την έκφραση και το χαρακτηρισμό των συνδεδεμένων ΕΚΠ των υπομονάδων α1, β, γ ή ε και δ του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης στο σύστημα έκφρασης P. pastoris. Στοχεύοντας στη δημιουργία ενός βελτιωμένου ανοσοπροσροφητή, πραγματοποιήθηκε η σύνδεση όλων των ΕΚΠ των υπομονάδων του υποδοχέα χρησιμοποιώντας έναν πεπτιδικό συνδέτη. Τα πενταμερή β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ και β-δ-α1-ε-α1 ΕΚΠ, κατασκευάστηκαν σε μία προσπάθεια μίμησης της διαμόρφωσης ολόκληρου του υποδοχέα σε ένα μοναδικό πολυπεπτίδιο. Τα πενταμερή, θεωρητικά φέρουν το σύνολο των αντιγονικών επιτόπων που αναγνωρίζουν τα αντισώματα αλλά και τις διεπιφάνειες των υπομονάδων που πιθανολογείται ότι είναι επίσης ανοσογόνες. Παράλληλα, μελετήθηκαν και τα διμερή α1-β ΕΚΠ και β-α1 ΕΚΠ, τα οποία προέκυψαν ως ενδιάμεσα στάδια στην κατασκευή των πενταμερών και φέρουν την πλειονότητα των επιτόπων έναντι των οποίων κατευθύνονται τα αυτοαντισώματα. Τα πενταμερή β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ και β-δ-α1-ε-α1 ΕΚΠ εκφράστηκαν επιτυχώς στο ετερόλογο σύστημα P. pastoris σε διαλυτή μορφή αλλά με ιδιαίτερα χαμηλό επίπεδο έκφρασης. Επιπλέον η ανοσοπροσροφητική τους ικανότητα ως προς την αφαίρεση αυτοαντισωμάτων όχι μόνο δεν βελτιώθηκε αλλά παρουσιάστηκε μειωμένη σε σχέση με τις επιμέρους υπομονάδες. Αντίθετα, όσο αφορά στη χρήση συγκαταμερών στη θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, το διμερές α1-β ΕΚΠ φαίνεται να τηρεί ένα σύνολο προϋποθέσεων έναντι των πενταμερών β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ, β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ και β-α1 ΕΚΠ που το καθιστούν καλό υποψήφιο ανοσοπροσροφητή. Σε αυτές συγκαταλέγονται το σχετικά υψηλό επίπεδο παραγωγής του από το ετερόλογο σύστημα έκφρασης του P. pastoris καθώς και το γεγονός ότι απομονώνεται σε καθαρή μορφή. Σε ότι αφορά το ανοσοπροσροφητικό του προφίλ, φέρει την πλειονότητα των επιτόπων έναντι των οποίων κατευθύνονται τα αυτοαντισώματα και τα απομακρύνει εξίσου αποδοτικά όσο και το μείγμα των μεμονωμένων α1 και β ΕΚΠ. Επιπλέον, το α1-β ΕΚΠ ως ένα πολυπεπτίδιο, υπερτερεί έναντι των μεμονωμένων α1 ΕΚΠ και β ΕΚΠ καθώς ο χαρακτηρισμός του όσο αφορά τις δοκιμασίες με στόχο την έγκριση για κλινική χρήση αναμένεται να είναι ευκολότερος έναντι των δύο πρωτεϊνών. Τέλος, η υψηλή χωρητικότητά του ως προς την αφαίρεση αυτοαντισωμάτων μπορεί να εξασφαλίσει χαμηλό κόστος παραγωγής, έναν παράγοντα σημαντικό για την εφαρμογή της αντιγονοειδικής θεραπευτικής προσέγγισης σε μεγάλη κλίμακα. Ο επιτυχής χαρακτηρισμός του α1-β ΕΚΠ σχετικά με παραμέτρους σταθερότητας, τοξικότητας και ασφάλειας θα μπορούσε να σηματοδοτήσει την έναρξη των κλινικών δοκιμών για τη χρήση του ως ανοσοπροσροφητή στην εφαρμογή της νέας θεραπευτικής προσέγγισης για τη μυασθένεια σε ανθρώπους. / Myasthenia gravis is an antibody mediated autoimmune disease that affects the neuromuscular junction. The muscle nicotinic acetylcholine receptor (AChR) is the main antigen in myasthenia gravis. Circulating antibodies against the acetylcholine receptor are the main pathogenic factors, causing loss of the available functional receptors at the neuromuscular junction with the consequent impairment of signal transduction. Muscle nicotinic acetylcholine receptors are transmembrane proteins formed by 5 homologous subunits: two α subunits and three β, γ (in the embryo and replaced by ε in the adult) and δ. Typically, each subunit consists of an N-terminal extracellular domain (ECD), a transmembrane region and a cytoplasmic loop. The ECDs carry most of the epitopes for MG autoantibodies ,with subunit α baring the main immunogenic region. Current MG treatments include the use of anticholinesterase drugs, immunosuppressants or immunomodulators, plasmapheresis and thymectomy with none of these approaches being specific. The selective removal of anti-AChR antibodies from the blood of MG patients with an extracorporeal technique similar to plasmapheresis could be a therapeutic option. In our laboratory, we aim to develop this method using recombinant extracellular domains (ECDs) of the AChR subunits (α, β, γ, δ and ε) as immunoadsorbents immobilized on CN-Br Sepharose. We have previously described the expression of the individual ECDs in P. pastoris system and their characterization. The aim of this dissertation was to study and characterize the linked ECDs of the α, β, γ, δ and ε subunits expressed in the yeast P. pastoris system. In an attempt to improve immunoadsorption efficiency we expressed the AChR subunits linked with a flexible peptide linker 24 amino acids long. More specifically we designed and characterized two pentameric constucts namely β-δ-α1-γ-α1 ECD & β-δ-α1-ε-α1 ECD to mimic the whole pentameric extracellular domain of the AChR in a native conformation. We also examined two dimeric constructs (α1-β ECD & β1-α ECD) since these subunits carry the majority of MG epitopes. Regarding the pentamers, they were successfully expressed in the P.pastoris system but with the expression yield being relatively low. Furthermore their immunoadsorbing ability was limited in comparison with the mixture of all five ECDs. This fact, combined with their small expression yield, poses a serious obstacle for their use in therapy. On the other hand, both expression yield and antibody binding of the α1-β dimer were satisfactory, at least as good as the mixture of individual α and β ECDs. In addiction, the high capacity of thee α1-β ECD in combination with its expression yield suggests that few milligrams of protein could be sufficient for the clearance of the plasma from an average titer patient. Such a quantity could be easily obtained, allowing the large scale application of the method, while reducing the cost. Therefore, the α1-β dimer constitutes a suitable candidate to be used as efficient immunoadsorbent in the development of a specific therapy against MG. Further characterization of the α1-β ECD, with respect to stability, toxicity and safety aspects, could mark the initiation of animal studies. The successful completion of these studies is crucial for the advancement into clinical trials, for the use of the α1-β ECD as immunoadsorbent in the antigen-specific therapy for myasthenia gravis.

Ο μυϊκός νικοτινικός υποδοχέας ακετυλοχολίνης (nAChR), είναι ένα πενταμερές κανάλι ιόντων νατρίου, το οποίο εδράζεται στους σκελετικούς μύες στη νευρομυϊκή σύναψη και μετατρέπει τις νευρικές ώσεις σε μυϊκές συσπάσεις. Το κανάλι αυτό γίνεται στόχος του ανοσοποιητικού συστήματος, που παράγει στην περίπτωση της βαριάς μυασθένειας αντισώματα εναντίον του. Η συχνότητα της ασθένειας αυτής στο γενικό πληθυσμό είναι 125-400 περιπτώσεις/εκατομμύριο, με αναλογία ανδρών/γυναικών ασθενών 1:2. Τα πρώτα συμπτώματα της νόσου είναι διπλωπία και βλεφαρόπτωση που εξελίσσονται σε γενική μυϊκή αδυναμία και εύκολη κόπωση έως παράλυση των άκρων ή ακόμα και των αναπνευστικών μυών. Οι καθιερωμένες σήμερα θεραπείες της βαριάς μυασθένειας περιλαμβάνουν χορήγηση αντιχολινεστερασικών, ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων, θυμεκτομή, πλασμαφαίρεση, καθώς και ενδοφλέβια χορήγηση ανθρωπίνων ανοσοσφαιρινών σε μεγάλες δόσεις. Όμως κοινός παρονομαστής όλων αυτών των θεραπειών είναι η έλλειψη εκλεκτικότητας καθώς και οι παρενέργειες. Τα παραπάνω προβλήματα έχουν κάνει φανερή την ανάγκη για εξεύρεση νέων και πιο εξειδικευμένων θεραπειών, όπως θεραπείες στις οποίες τα παθολογικά αυτοαντισώματα θα αφαιρούνται εκλεκτικά από την κυκλοφορία. Η μελέτη που έγινε στοχεύει στην εκλεκτική αφαίρεση των παθολογικών αντισωμάτων από το αίμα μυασθενών, με μυϊκούς nAChRs ή τμήματα αυτών, που είτε θα χορηγούνται ενδοφλεβίως, είτε θα βρίσκονται ομοιοπολικά προσδεμένα σε στήλες χρωματογραφίας από όπου θα περνά ο ορός. Στο πρώτο μέρος της μελέτης δημιουργήθηκαν παρασκευάσματα που περιείχαν το μυϊκού τύπου nAChR από τα ηλεκτρικά όργανα του ψαριού Torpedo californica (Τ. nAChR). Συγκεκριμένα, παρασκευάστηκε Τ. nAChR ο οποίος ήταν διαλυμένος σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS), σε PBS/Χολικό νάτριο 2% (PBS/Χ.Ν.2%) καθώς επίσης και ενσωματωμένος σε λιποσώματα επικαλυμμένα με αλυσίδες πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG), με στόχο την παράταση του χρόνου ημιζωής στον οργανισμό και τη μείωση της αντιγονικότητας. Τα παρασκευάσματα συγκρίθηκαν μεταξύ τους ως προς την ικανότητά τους να δεσμεύουν το μονοκλωνικό αντίσωμα mAb35 (ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που προσδένεται σε μυϊκούς nAChRs) καθώς και I125-α-μπουγκαροτοξίνη (I125-α-Bgt) (πρωτεΐνη-συστατικό του δηλητηρίου του φιδιού Bungarus multicinctus και ανταγωνιστής ακετυλοχολίνης, ραδιοσημασμένη με I125), σε διάφορα χρονικά διαστήματα από την παρασκευή τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τη μεγαλύτερη ικανότητα δέσμευσης έχει το παρασκεύασμα στο οποίο ο Τ. nAChR είναι διαλυμένος σε PBS/Χ.Ν.2%. Επίσης προσδιορίστηκαν και συγκρίθηκαν τα ποσοστά του mAb35, τα οποία δεσμεύτηκαν in vivo σε αρουραίους από τα ίδια παρασκευάσματα με Τ. nAChR. Τα πειράματα αυτά έδειξαν ότι μόνο ο Τ. nAChR που ήταν διαλυμένος σε PBS/Χ.Ν.2% μπόρεσε να δεσμεύσει ποσοτικά το mAb35. Τέλος έγιναν πειράματα βιοκατανομών, του Τ. nAChR ραδιοσημασμένου με I125-α-Bgt, στα παραπάνω παρασκευάσματα, σε αρουραίους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μέγιστο χρόνο ζωής in vivo έχει ο ενσωματωμένος υποδοχέας σε λιποσώματα επικαλυμμένα με PEG. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν εξωκυτταρικά τμήματα του ανθρωπίνου μυϊκού nAChR (ECDs), εκφρασμένα στο ζυμομύκητα Pichia pastoris και σε κύτταρα εντόμων High Five (από τις ωοθήκες του εντόμου Trichoplusia ni). Τα Pichia pastoris και High Five α1 ECDs συγκρίθηκαν μεταξύ τους ως προς την ικανότητα να δεσμεύουν αντισώματα από ορούς μυασθενών χρησιμοποιώντας τη ραδιοανοσολογική μέθοδο. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων με ορούς 5 ασθενών, έδειξαν ότι το High Five α1 ECD δεσμεύει υπερδιπλάσια ποσοστά αυτοαντισωμάτων σε σχέση με το Pichia pastoris α1 ECD. Από τα πειράματα αυτά φαίνεται πως το High Five α1 ECD πλεονεκτεί του Pichia pastoris α1 ECD ποιοτικά. Συνολικά από τη μελέτη που έγινε, προέκυψε μια σειρά από συμπεράσματα. Κατ’ αρχήν αποδείχθηκε ότι nAChRs, όπως ο Τ. nAChR, μπορούν να ενσωματωθούν σε πολλά διαφορετικά παρασκευάσματα όπως σε PBS, PBS/Χ.Ν.2% και λιποσώματα, τα οποία επηρεάζουν τις ιδιότητές τους, όπως την ικανότητα δέσμευσης mAb35 και I125-α-Bgt και το χρόνο ημιζωής στον οργανισμό. Όπως αποδείχθηκε ο Τ. nAChR μπορεί να δεσμεύει mAb35 σε οποιαδήποτε από τα παραπάνω παρασκευάσματα in vitro, ενώ in vivo μπορεί να το δεσμεύει όταν είναι διαλυμένος σε PBS/Χ.Ν.2%. Επίσης φάνηκε ότι μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής in vivo έχει ο Τ. nAChR ενσωματωμένος σε λιποσώματα επικαλυμμένα με PEG. Τέλος αποδείχθηκε ότι ανασυνδυασμένα ECDs της ανθρώπινης α1 υπομονάδας του μυϊκού nAChR, δεσμεύουν αυτοαντισώματα από τον ορό μυασθενών και ότι η ικανότητα δέσμευσης των τμημάτων αυτών, επηρεάζεται από το σύστημα στο οποίο εκφράζονται. Η πληροφορία αυτή πρέπει να ληφθεί υπόψη στη κατασκευή ανοσοπροσροφητικών στηλών για τη θεραπεία της βαριάς μυασθένειας. / The muscle nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) is a pentameric cation channel, which is located at the neuromuscular synapse and converts neuronal impulses into muscle contractions. In myasthenia gravis patients, this particular channel is targeted by the immune system, which produces antibodies against it. The incidence of the disease is about 125-400 cases per million. The first symptoms of the disease are diplopia and blepharoptosis, which may shift to general weakness and fatigability. The established therapies for myasthenia gravis, include administration of acetylcholinesterase inhibitors, immunosuppresive drugs, thymectomy, plasmaphaeresis and administration of intravenous immunoglobulins (IVIGs). Unfortunately all these therapies are not specific and have many serious side effects. This has made clear the need for more specific therapies, in which pathological autoantibodies will not be produced or will be removed selectively. This project aims at the specific aphaeresis of pathological autoantibodies from the patients’ blood by using the muscle nAChR or extracellular domains (ECDs) of its subunits. These molecules will either be administered i.v. or will be covalently conjugated on chromatography beads, forming a column by which the serum could pass and be cleaned from autoantibodies. In the first part of this project, formulations of nAChR, from the electric organs of fish Torpedo californica (T. nAChR), were prepared. Particularly T. nAChR was diluted in PBS and PBS/Sodium Cholate 2% (PBS/S.Ch.2%) and incorporated into liposomes coated by polyethylenoglycol (PEG) chains in different percentages, in order to achieve longer half-life in vivo. Their ability to bind mAb35 (a monoclonal antibody that binds muscle nAChRs) and I125-α- bungarotoxin (I125-labeled toxin from the poison of the snake Bungarus multicinctus, a well studied nAChR antagonist) were compared. The results showed that T. nAChR has the best binding capacity in vitro in the PBS/S.Ch.2%. Apart from the in vitro mAb35 binding measurements, in vivo binding experiments were also performed, using Lewis rats. Results indicate that only T. nAChR in the PBS/S.Ch.2% formulation binds mAb35 quantitatively in vivo. Finally, the biodistribution of T. nAChR in several formulations was also studied in rats. T. nAChR formulations were radiolabelled using I125-α-bungarotoxin and administered i.v. The results indicate that T. nAChR has the longest half-life time when incorporated into PEG-coated liposomes. In the second part of this project, ECDs of human muscle nAChR α1 subunit, expressed in the yeast Pichia pastoris and High Five insect cells were used. Pichia pastoris and High Five α1 ECDs were measured and compared for their ability to bind autoantibodies from myasthenic patients’ sera using radioimmunoassay. The results from 5 patients’ sera indicate that High Five α1 ECD binds more than twice more autoantibodies than Pichia pastoris α1 ECD. In conclusion, it was proved that nAChRs can be incorporated to many different formulations, like PBS, PBS/S.Ch.2% and liposomes, which affect its binding capacity and half-life time. It was shown that Τ. nAChR, when incorporated into any of the above formulations, can bind mAb35 in vitro, while in vivo only in PBS/S.Ch.2% formulation. In addition, it was proved that Τ. nAChR has longer half-life time in vivo when incorporated in PEG-coated liposomes. In the last part of the project, it was shown that ECDs of human nAChR α1 subunit binds autoantibodies from myasthenia gravis patient’s serum and their binding capacity is strongly affected by the expression system.

Ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης ανήκει στην υπερ-οικογένεια των ιοντικών διάυλων ενεργοποιούμενων μέσω προσδέτη (ligand-gated ion channels). Οι υπομονάδες των υποδοχέων που ανήκουν στην οικογένεια αυτή, φέρουν στο αμινοτελικό τους άκρο τη χαρακτηριστική κυστεϊνική θηλιά (Cys-loop) μεταξύ δύο συντηρημένων καταλοίπων κυστεΐνης, οι οποίες συνδέονται με δισουλφιδικό δεσμό. Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης είναι μεγάλες διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που αποτελούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες και χωρίζονται σε δυο κατηγορίες, τους νευρικούς και τους μυϊκούς. Οι νευρικοί υποδοχείς εκφράζονται κυρίως στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα, καθώς και σε μη-νευρικούς ιστούς, όπως τα επιθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Επιπλέον, χωρίζονται σε δύο υποκατηγορίες, τους ετεροπενταμερείς, όπως είναι η (α4)x(β2)y, και τους ομοπενταμερείς, όπως η (α7)5. Οι μυϊκοί υποδοχείς απαντώνται στις μετασυναπτικές μεμβράνες των νευρομυϊκών συνάψεων των σπονδυλωτών και στα ηλεκτρικά όργανα ορισμένων ψαριών και εμφανίζουν στοιχειομετρία (α1)2β1γδ (στα έμβρυα) ή (α1)2β1εδ (στους ενήλικες). Ο μυϊκός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης σε σχέση με τα υπόλοιπα μέλη της υπερ-οικογένειας, είναι ο καλύτερα μελετημένος ως προς τα χαρακτηριστικά και τη λειτουργία του. Ένας από τους κύριους παράγοντες που συνέβαλε στον εκτεταμένο χαρακτηρισμό του μυϊκού υποδοχέα είναι η δυνατότητα απομόνωσης, σε μεγάλες ποσότητες και σε λειτουργική μορφή, υποδοχέων της ακετυλοχολίνης παρόμοιων με αυτούς της νευρομυϊκής σύναψης από τα ηλεκτρικά όργανα των ψαριών Torpedo και Electrophorus. Οι πρώτες πληροφορίες για την τρισδιάστατη δομή του υποδοχέα δόθηκαν από ένα μοντέλο ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, από υποδοχέα που απομονώθηκε από το ηλεκτρικό όργανο του ψαριού Torpedo marmorata. Στη συνέχεια, η λύση της δομής ενός ομολόγου του εξωκυτταρικού τμήματος του υποδοχέα, της acetylcholine binding protein (AChBP) από το σαλιγκάρι Lymnaea stagnalis έφερε και τις πρώτες πληροφορίες υψηλής ανάλυσης. Η AChBP είναι μια υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη, η οποία σχηματίζει σταθερά ομοπενταμερή, με ομολογία 20%-24% με το εξωκυτταρικό τμήμα των υπομονάδων του υποδοχέα. Πρόσφατα, η λύση της δομής της εξωκυτταρικής περιοχής της α1 υπομονάδας του υποδοχέα ποντικού, στην οποία είχε προσδεθεί ο ανταγωνιστής της ακετυλοχολίνης α-μπουγκαροτοξίνη, προσέφερε επιπλέον πληροφορίες για τα χαρακτηριστικά του υποδοχέα, όπως είναι η κύρια ανοσογόνος περιοχή (MIR) και η συντηρημένη Cys-loop περιοχή. Παρόλα αυτά δεν έχουν δημοσιευτεί υψηλής ανάλυσης πληροφορίες για τη δομή του ανθρώπινου υποδοχέα. Επιπλέον από το φυσιολογικό ρόλο του μυϊκού υποδοχέα, ο οποίος είναι άμεσα υπεύθυνος για τη διαβίβαση της ώσης στη νευρομυϊκή σύναψη, παράλληλα ο υποδοχέας αυτός αποτελεί και στόχο για πολλά κληρονομικά και επίκτητα νοσήματα, στα οποία ανήκει και το αυτοάνοσο νόσημα μυασθένεια. Στη νόσο αυτή, αυτοαντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα προκαλούν μείωση των διαθέσιμων λειτουργικών υποδοχέων στη νευρομυϊκή σύναψη με συνέπεια να παρεμποδίζεται η δράση της ακετυλοχολίνης. Αυτοαντισώματα έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης εντοπίζονται στο 80%-90% των μυασθενών και η παρουσία τους θεωρείται ο κύριος παθογόνος παράγοντας για τη μυασθένεια. Ο σημαντικός ρόλος λοιπόν του υποδοχέα σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις, τον καθιστά αντικείμενο εντατικής έρευνας. Η λεπτομερής ανάλυση της δομής και της λειτουργίας του θα μπορούσε να συμβάλλει στην κατανόηση της δομής και της λειτουργίας των υπόλοιπων υποδοχέων-μελών της υπερ-οικογένειας καθώς επίσης και στην εξιχνίαση του αυτοάνοσου μηχανισμού της μυασθένειας. Ωστόσο, το μεγάλο μέγεθος του μορίου του υποδοχέα, ο υδρόφοβος χαρακτήρας του και η αδυναμία απομόνωσής του από φυσικές πηγές, δυσχεραίνει την πραγματοποίηση δομικών μελετών. Για το λόγο αυτό, είναι αναγκαίο να προκύψουν πρωτεϊνικά μόρια με δομή η οποία να πλησιάζει αρκετά τη φυσική διαμόρφωση του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης και σε ποσότητες ικανές ώστε να είναι εφικτές οι δομικές μελέτες τους. Προηγούμενα, είχαν εκφραστεί στο εργαστήριό μας οι εξωκυτταρικές περιοχές (ΕΚΠ) των υπομονάδων α1, β1, γ και ε (α1ΕΚΠ, β1ΕΚΠ, γΕΚΠ και εΕΚΠ) του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα, χρησιμοποιώντας ως σύστημα έκφρασης το ζυμομύκητα Pichia pastoris. Οι ανασυνδυασμένες αυτές πρωτεΐνες, απομονώθηκαν σε διαλυτή και γλυκοζυλιωμένη μορφή, αναγνωρίζονταν από μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της κάθε υπομονάδας, αλλά και από αντισώματα προερχόμενα από ορούς μυασθενών. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης και η διαλυτότητα δεν ήταν ικανοποιητικά για δομικές μελέτες. Παρόλα αυτά, οι ανασυνδυασμένες αυτές πρωτεΐνες, χρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς για μια καινούρια αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, η οποία έγκειται στην ειδική αφαίρεση των αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών, χρησιμοποιώντας τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες ως ανοσοπροσροφητές. Η χρήση της α1ΕΚΠ του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα ως ανοσοπροσροφητή, είχε ως αποτέλεσμα την αφαίρεση μεγάλου ποσοστού αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών. Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα με τη χρήση των εξωκυτταρικών τμημάτων των υπομονάδων β1, γ και ε ως ανοσοπροσροφητές. Ωστόσο, με τον τρόπο αυτό δεν επιτυγχάνεται πλήρης απομάκρυνση των παθογόνων αυτοαντισωμάτων. Η παρούσα εργασία είχε στόχο τη βελτίωση της δομής, της διαλυτότητας και των επιπέδων έκφρασης των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα, έτσι ώστε να είναι κατάλληλες για δομικές μελέτες και κυρίως για να συμβάλλουν στις προσπάθειες βελτίωσης της αντιγονοειδικής θεραπείας για τη μυασθένεια. Ειδικότερα, το πρώτο μέρος αφορά μελέτες σχετικές με την έκφραση της γΕΚΠ, η οποία σχημάτιζε ολιγομερή και είχε πολύ χαμηλά επίπεδα έκφρασης. Σχεδιάστηκαν λοιπόν 4 μεταλλάγματα, με την προοπτική να προκύψουν πιο διαλυτά και υδρόφιλα μόρια. Οι μεταλλάξεις που σχεδιάστηκαν αφορούσαν στην αντικατάσταση συγκεκριμένων κυστεϊνών, που θα μπορούσαν να σχηματίζουν ακατάλληλους ένδο- ή δια-μοριακούς δεσμούς (μέσω δισουλφιδικών δεσμών), καθώς επίσης και στην αντικατάσταση της υδρόφοβης Cys-loop περιοχής με την αντίστοιχη, πιο υδρόφιλη της AChBP. Στα δύο μεταλλάγματα που έφεραν τη Cys-loop περιοχή της AChBP, παρατηρήθηκε δραματική βελτίωση στα επίπεδα έκφρασης και στη διαλυτότητα των μορίων, ενώ ακόμη προσεγγίστηκε το αναμενόμενο μοριακό μέγεθος, όπως φανέρωσαν τα αποτελέσματα από τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης καθώς και οι μετρήσεις δυναμικής σκέδασης φωτός. Όταν τα δύο βελτιωμένα μεταλλάγματα χρησιμοποιήθηκαν ως ανοσοπροσροφητές για την αντιγονοειδική θεραπεία που προαναφέρθηκε, παρουσίασαν βελτιωμένη ικανότητα πρόσδεσης αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών, συγκριτικά με την αγρίου τύπου γΕΚΠ. Τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν ότι η υδρόφοβη Cys-loop περιοχή της αγρίου τύπου γΕΚΠ συμβάλλει σημαντικά στη δημιουργία συσσωματωμάτων κατά την έκφραση της ΕΚΠ και για το λόγο αυτό ακολούθησε η αντικατάσταση αυτής της περιοχής και στις υπόλοιπες ΕΚΠ των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα. Προκειμένου να βελτιωθεί περαιτέρω η αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, πραγματοποιήθηκαν προσπάθειες να συνεκφραστούν όλες οι ΕΚΠ των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα, με σκοπό να δημιουργηθούν σύμπλοκα που διαθέτουν και τις διεπιφάνειες μεταξύ των ΕΚΠ του υποδοχέα, οι οποίες πιστεύεται ότι είναι και αυτές ανοσογόνες. Στις προσπάθειες αυτές χρησιμοποιήθηκαν οι μεταλλαγμένες ΕΚΠ των υπομονάδων που φέρουν τη Cys-loop περιοχή της AChBP. Οι αρχικές συνεκφράσεις των ΕΚΠ όλων των υπομονάδων του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα ήταν ανεπιτυχείς όσον αφορά στη δημιουργία συμπλόκων. Προκειμένου λοιπόν, να πραγματοποιηθεί ο συνδυασμός όλων των ΕΚΠ των υπομονάδων και η δημιουργία ενός λειτουργικού μορίου, το επόμενο βήμα ήταν η σύνδεση των υπομονάδων με ένα πεπτιδικό συνδέτη επαναλαμβανόμενων αμινοξέων. Ο συνδέτης που χρησιμοποιήθηκε αποτελείται από οκτώ επαναλαμβανόμενες τριάδες των αμινοξέων αλανίνη – γλυκίνη – σερίνη (AGS)8. Αρχικά κατασκευάστηκαν όλα τα ζεύγη (συγκαταμερή) που χρειάζονται, για να επακολουθήσουν πολλαπλά στάδια υποκλωνοποιήσεων, προκειμένου να σχηματιστεί το πενταμερές. Όλα τα συγκαταμερή παρουσίασαν το αναμενόμενο μοριακό βάρος όπως φάνηκε από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE), γεγονός που σημαίνει ότι ο συνδέτης δεν πρωτεολύεται και είναι ικανός να συγκρατεί τις υπομονάδες ενωμένες. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης που παρουσίασαν τα συγκαταμερή ήταν ικανοποιητικά και όλα τα συγκαταμερή που έφεραν την α1ΕΚΠ διατήρησαν την ικανότητα να προσδένουν σημασμένη α-μπουγκαροτοξίνη, η οποία προσδένεται ειδικά στην α1ΕΚΠ με υψηλή συγγένεια. Ωστόσο, τα αποτελέσματα από τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης, φανέρωσαν ότι όλα τα συγκαταμερή εκλούονται δίνοντας ένα ευρύ φάσμα μοριακών βαρών, από μονομερή μέχρι ολιγομερή και συσσωματώματα. Τέλος, η α1ΕΚΠ-(AGS)8-γΕΚΠ παρουσίασε αυξημένη ικανότητα πρόσδεσης 125Ι-α-Βgt συγκριτικά με την γΕΚΠ-(AGS)8-α1ΕΚΠ, γεγονός που σημαίνει ότι η σειρά με την οποία συνδέονται οι υπομονάδες, παίζει σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση των μορίων. Στην προσπάθεια βελτίωσης της διαμόρφωσης και των χαρακτηριστικών των συγκαταμερών, έγινε χρήση ενός μεγαλύτερου συνδέτη, αποτελούμενου από έντεκα επαναλαμβανόμενες τριάδες των αμινοξέων αλανίνη – γλυκίνη – σερίνη (AGS)11, ωστόσο δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα τελικά προϊόντα έκφρασης. Όσον αφορά στη χρήση των συγκαταμερών στη θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλα τα συγκαταμερή διατήρησαν πλήρως την ικανότητα να προσδένουν αυτοαντισώματα από τους ορούς των μυασθενών, αν και δε βελτίωναν περαιτέρω την ικανότητα ανοσοπροσρόφησης των επιμέρους ΕΚΠ. Συμπερασματικά λοιπόν, καταλήγουμε ότι η αντικατάσταση της υδρόφοβης Cys-loop περιοχής των ΕΚΠ των υπομονάδων με την αντίστοιχη, υδρόφιλη περιοχή του ομολόγου AChBP, οδηγεί στη δημιουργία μορίων με βελτιωμένα χαρακτηριστικά, όπως είναι τα επίπεδα έκφρασης και η διαλυτότητα των μορίων. Τα μόρια αυτά μπορούν στη συνέχεια να συνδεθούν με ένα πεπτιδικό συνδέτη και να παραχθούν συγκαταμερή με σωστή διαμόρφωση, τα οποία διατηρούν τα λειτουργικά χαρακτηριστικά τους, όπως είναι η πρόσδεση σημασμένης α-μπουγκαροτοξίνης και η πρόσδεση αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών. Τα δεδομένα αυτά ενισχύουν την πεποίθηση ότι είναι εφικτή η κατασκευή του ετεροπενταμερούς του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα που θα αποτελείται μόνο από τις ΕΚΠ των υπομονάδων του. / The nicotinic acetylcholine receptor (AChR) belongs to the superfamily of pentameric ligand-gated ion channels (LGIC), also known as the Cys-loop receptor family. The subunits of the receptors belonging to this superfamily carry at their N-terminal domain characteristic, highly conserved Cys-loop region, a string of 13 amino acids linked by a disulfide bond. AChRs are large, transmembrane glycoproteins, which are composed of five homologous subunits, arranged around a central ion channel and they are divided into two subgroups, the neuronal and the muscle type. The neuronal receptors are expressed mainly in the central and the peripheral nervous system, as well as in non-neuronal tissues, such as epithelial and immune cells. Moreover, the neuronal receptors are further subdivided into two categories, the heteropentamers, such as (α4)x(β2)y, and the homopentamers, such as (α7)5. The muscle AChRs are located on the postsynaptic membrane of the neuromuscular junction and have the subunit composition α2βγδ (embryonic) or α2βεδ (adult). The muscle AChR is the best studied model from the superfamily of the LGICs, as far as its characteristics and function are concerned. One of the major reasons which contributed to its extensive characterization is the ability to isolate, in great amounts and in a functional form, AChRs similar to these of the neuromuscular junction from the electric organs of the fishes Torpedo and Electrophorus. An electron microscopy model of the Torpedo marmorata, purified from the electric organ of the electric ray, provided the first information about the three-dimensional structure of the AChR. The first high resolution insight was provided by the solved crystal structure of the AChBP from the snail Lymnaea stagnalis, a homologue of the extracellular domain (ECD) of the AChR. The AChBP is a soluble protein, which forms stable homopentamers and shares high homology with the ECDs of the AChR (20%-24%). Recently, the solved crystal structure of a mutated mouse α1ECD bound to α-bungarotoxin provided further information for a number of receptor-specific elements, including the main immunogenic region (MIR) and the Cys-loop. Nevertheless, high resolution information about the three-dimensional structure of the human AChR has not been reported so far. In addition to the physiological role of the muscle AChR, which is responsible for mediating the neuromuscular transmission, the muscle AChR is the target for a number of acquired and hereditary diseases, including the autoimmune disease myasthenia gravis (MG). In MG, autoantibodies against the AChR cause loss of the available and functional AChRs in the neuromuscular junction, and as a consequence, the action of acetylcholine is blocked. Autoantibodies against AChR are found in nearly 80%-90% of patients with generalized MG and are considered the main pathogenic factor in MG. The important pathophysiological roles of the AChRs made them subject to intensive research. The detailed analysis of the structure and function of the AChR could contribute to the understanding of the structure and function of the rest of the members of the superfamily, as well as to the comprehension of the pathogenic mechanism of MG. However, the fact that the AChR is a big, hydrophobic molecule, difficult to purify from natural sources, make the accomplishment of structural studies hard. It is necessary to generate recombinant molecules with conformation similar to that of the native AChR, in efficient amounts, in order to perform structural studies. We have previously expressed the human muscle AChR α1, β1, γ and ε ECDs using the yeast Pichia pastoris. These recombinant proteins were purified in a soluble and glycosylated form, recognizable by both monoclonal antibodies and a considerable percentage of anti-subunit antibodies in positive sera from MG patients. However, both the expression yield and the solubility of these proteins were not satisfactory for structural studies. Nevertheless, they were successfully used for a novel, antigen-specific therapeutic approach against MG, regarding the specific removal of the autoantibodies from MG sera, using these proteins as immunoadsorbents. The use of the human α1ECD as an immunoadsorbent resulted in the removal of a great percentage of autoantibodies from sera derived from MG patients. The results were similar when the β1, γ and ε ECDs were used as immunoadsorbents. However, the complete removal of the pathogenic autoantibodies from the MG sera was not achieved. We aimed at the improvement of the structure, solubility and expression yield of the ECDs of the muscle AChR, in order to render them suitable for structural studies and mainly to use them for the amelioration of the antigen-specific therapeutic approach against MG. For this, we selected the γECD, which formed oligomers and displayed a low expression yield and constructed four mutants of the protein. The mutations were concerning the replacement of certain cysteines, which could form inappropriate intra- or inter-molecular bonding and thus aggregation, as well as the substitution of the hydrophobic Cys-loop region by its counterpart, more hydrophilic AChBP Cys-loop. The two mutants which carried the Cys-loop of the AChBP displayed a dramatic improvement at the expression yield and solubility, while they approached the expected molecular size, according to the results from gel filtration and dynamic light scattering. When these two improved mutants were used as immunoadsorbents, they exhibited an increased ability to bind autoantibodies from MG sera, compared with the wild type γECD. These results indicate that the hydrophobic Cys-loop region of the γECD importantly contributes to the formation of aggregates during the expression of the ECD, and consequently followed the replacement of this region at the rest ECDs of the muscle AChR. In order to further ameliorate the antigen-specific therapeutic approach against MG, we carried out efforts to co-express all of the ECDs of the muscle AChR, targeting to create complexes which would carry the interfaces between the ECDs, which are thought to be also immunogenic. At these efforts, the mutant forms of the ECDs which carried the Cys-loop of the AChBP were used. These initial co-expressions of the ECDs were not successful, with the respect to the creation of complexes. In order to combine the ECDs of all the subunits and construct a functional molecule, the next step was the binding of these ECDs with a linker of repeated amino acids. The linker that was used, was consisted of eight repeated triplets of the amino acids alanine-glycine-serine (AGS)8. At the beginning were constructed the pairs (concatamers) which were needed in order to follow subclonings, preparative to form the pentamer. All of the concatamers displayed the expected molecular weight, according the results of the SDS-PAGE. This fact suggests that the linker does not undergo proteolysis, and thus is capable of retaining the subunits conjoint. Furthermore, the expression yield of the concatamers was satisfactory and they retained their ability to bind radiolabelled α-bungarotoxin, which is specifically binds to the α1ECD with high affinity. However, the results from the gel filtration indicated that all the concatamers eluted in a broad spectrum of molecular weights, from monomers to oligomers. In an effort to improve the conformation and the characteristics of the concatamers, a bigger linker which was consisted of eleven repeated triplets of the amino acids alanine-glycine-serine (AGS)11 was used, but the final products where shown to be similar. With respect to the use of the concatamers at the therapeutic approach against MG, the results showed that all the concatamers retain the ability to bind autoantibodies from MG sera, although there was no further improvement in the immunoadsorbing ability of the single ECDs. Conclusively, the substitution of the hydrophobic Cys-loop of the ECDs by the corresponding, more hydrophilic of the AChBP, results in the construction of molecules with improved characteristics, such as the expression yield and the solubility. The molecules are able to be linked together and form concatamers with the appropriate conformation, retaining their functionality, such as the binding of radiolabelled α-bungarotoxin and autoantibodies from MG sera. These results demonstrate that it is feasible to construct the heteropentamer of the human muscle AChR, which will consist only of the ECDs.

Σκοπός: Η θυμεκτομή αποτελεί κοινώς αποδεκτή θεραπεία της μυασθένειας με τις διάφορες προσπελάσεις να αναφέρονται ως ανάλογης αξίας για την επίτευξη ύφεσης της νόσου. Έχοντας πλέον την μόνιμη σταθερή ύφεση ως καθαρή και μετρήσιμη νευρολογική έκβαση των μυασθενικών ασθενών μετά θυμεκτομή και γνωρίζοντας ότι η ύφεση της νόσου αποτελεί χρόνο-εξαρτώμενο γεγονός, πραγματοποιήσαμε μια αναδρομική μελέτη των ασθενών με μυασθένεια που αντιμετωπίστηκαν χειρουργικά με σκοπό τον πιο αξιόπιστο καθορισμό του ρόλου των μεγίστων θυμικών εκτομών και την ταυτοποίηση προγνωστικών παραγόντων για ύφεση της νόσου μετά θυμεκτομή. Υλικό και μέθοδος. Η μελέτη περιλαμβάνει 78 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε τροποποιημένη μέγιστη θυμεκτομή από το 1990 έως το 2007. Οι ενδείξεις θυμεκτομής περιελάμβαναν: οφθαλμική μυασθένεια ανθιστάμενη στη φαρμακευτική αγωγή, γενικευμένη μυασθένεια και μυασθένεια με θύμωμα. Τα στοιχεία που συλλέχθηκαν αφορούσαν τη βαρύτητα της νόσου (τροποποιημένη Osserman ταξινόμηση), την προεγχειρητική φαρμακευτική αγωγή, την ηλικία έναρξης της νόσου (≤ 40/ > 40 έτη), το χρονικό διάστημα που μεσολάβησε από τη διάγνωση στη θυμεκτομή (≤ 12/ > 12 μήνες), το φύλο, την ιστολογία του θύμου αδένα, τη θνητότητα και τις επιπλοκές. Στους ασθενείς με θύμωμα περαιτέρω στοιχεία που ελήφθησαν υπόψη αφορούσαν τον ιστολογικό τύπο του θυμώματος κατά την Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας και το στάδιο του όγκου κατά Masaoka. Η εκτίμηση της νευρολογικής έκβασης στο τέλος του μετεγχειρητικού follow up έγινε βάση της νέας ταξινόμησης του Αμερικανικού Ιδρύματος για τη Βαρεία Μυασθένεια με την πλήρη σταθερή ύφεση να λαμβάνεται υπόψη για τον καθορισμό της επάρκειας της διενεργηθείσας εκτομής και για τη σύγκριση των αποτελεσμάτων μας με αυτά προηγουμένων μελετών. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με το SPSS 17 και αφορούσε δύο ομάδες ασθενών ανάλογα με την παρουσία ή μη θυμώματος. Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της επίπτωσης των υπό εκτίμηση προγνωστικών παραγόντων στην επίτευξη της πλήρους ύφεσης ενώ η Cox Regression ανάλυση αποτέλεσε το μοντέλο για την ανάλυση της ταυτόχρονης επίδρασης των υπό μελέτη παραμέτρων στην επίτευξη πλήρους σταθερής ύφεσης. Τιμές του p < 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Αποτελέσματα: 51 ασθενείς είχαν μυασθένεια χωρίς θύμωμα και 27 ασθενείς παρανεοπλασματική μυασθένεια. Δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στα προεγχειρητικά κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών πλην της αναμενομένης εμφάνισης της νόσου σε απώτερη ηλικία στους ασθενείς με θύμωμα. Η θνητότητα ήταν μηδενική ενώ η χειρουργική νοσηρότητα, ανάλογη προηγουμένων μελετών θυμεκτομής με διαφορετικού τύπου προσπέλασεις, ανήλθε στο 7,7% και ήταν ως επί το πλείστον ήσσονος σημασίας. Το ποσοστό μετεγχειρητικής μυασθενικής κρίσης ήταν μόλις 3,8%. Οι ασθενείς με μυασθένεια και θύμωμα βίωσαν όψιμη νευρολογική έκβαση ανάλογη αυτής των ασθενών χωρίς θύμωμα (πιθανότητα ύφεσης 74,5% vs 85,7%, p= 0.632). Η μη χρήση στεροειδών στην προεγχειρητική φαρμακευτική αγωγή, ως έμμεσος δείκτης της βαρύτητας της νόσου, σχετίστηκε με στατιστικά καλύτερη πιθανότητα για πλήρη ύφεση των συμπτωμάτων τόσο στους ασθενείς με θύμωμα (95% CI 2.687-339.182, p= 0.006) όσο και σε αυτούς χωρίς θύμωμα (CI 95% 1.607-19.183, P= 0.007) στην πολυπαραγοντική ανάλυση. Αξιόλογη διαφορά, αν και στατιστικά μη σημαντική, για τη έκβαση της νόσου είχε η πρώιμη σε σχέση με την απώτερη χειρουργική αντιμετώπιση των ασθενών. Στη σύγκριση των 27 ασθενών με μυασθένεια και θύμωμα με 12 επιπλέον ασθενείς που υποβλήθηκαν στην ίδια επέμβαση για θύμωμα άνευ μυασθένειας η παρουσία των συμπτωμάτων μυϊκής αδυναμίας συνδυάστηκε με στατιστικά σημαντική βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών (100% vs 38,8% στη 10ετία, p< 0.001). Στους ασθενείς με μυασθένεια χωρίς θύμωμα και απώτερης ηλικιακά έναρξης της νόσου το ποσοστό σημαντικής βελτίωσης των μυασθενικών συμπτωμάτων, εξαιρουμένης της πλήρους ύφεσης, ήταν 70%. Στους ασθενείς με μυασθένεια και θύμωμα η ιστολογική ταυτοποίηση των θυμωμάτων κατά την Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας προέκυψε στατιστικά σημαντική τόσο στην μονοπαραγοντική όσο και στην πολυπαραγοντική ανάλυση με τα θυμώματα τύπου Β2, Α και Β3 να επιτυγχάνουν από πολύ καλή έως άριστη πιθανότητα πλήρους ύφεσης και τα θυμώματα τύπου ΑΒ, Β1 και C να έχουν απογοητευτική έκβαση όσον αφορά την ίαση. Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι η τροποποιημένη μεγίστη θυμεκτομή είναι ασφαλής και σχετίζεται με υψηλή πιθανότητα για ίαση των μυασθενικών ασθενών με και χωρίς θύμωμα. Οι ασθενείς πρέπει να αντιμετωπίζονται χειρουργικά πρώιμα μετά τη διάγνωση με κυριότερο προγνωστικό παράγοντα για το απώτερο νευρολογικό αποτέλεσμα την προεγχειρητική βαρύτητα της νόσου. Η ασφαλής και πιο αξιόπιστη εκτίμηση της τελευταίας απαιτεί πιο αντικειμενικά κριτήρια όπως αυτά που θεσπίστηκαν από το Αμερικανικό Ίδρυμα για τη Βαρεία Μυασθένεια. Η ενσωμάτωση σε αυτά τα κριτήρια μοριακών παραμέτρων που φαίνεται να επηρεάζουν την πρόγνωση της νόσου, ενδεχόμενα να βελτιώσουν την αξιοπιστία της κλινικής σταδιοποίησης του MGFA και να αναδείξουν υποομάδες ασθενών με διαφορετική νευρολογική πρόγνωση μετά από θυμεκτομή. Επίσης η πρώιμη διάγνωση των θυμωμάτων εξαιτίας των συνυπαρχόντων μυασθενικών συμπτωμάτων μπορεί να οδηγήσει σε καλύτερη επιβίωση τους συγκεκριμένους ασθενείς. Τέλος η νευρολογική έκβαση των ασθενών με θυμωματώδη μυασθένεια σχετίζεται με τον ιστολογικό τύπο των θυμωμάτων, αλλά όχι αναγκαία και με την κακοήθη συμπεριφορά τους. / Objective: Thymectomy represents a widely accepted treatment for myasthenia gravis with different surgical approaches reported as comparably efficient in achieving disease’s remission. With the complete stable remission being currently accepted as a clear measurable outcome of patients with myasthenia undergoing surgical treatment and the knowledge that disease’s remission should be evaluated as a time dependent event we proceeded to a retrospective analysis of our experience on the surgical management of myasthenic patients. The objective was to access the effect of maximal resection on the neurological outcome and identify predictors of disease remission. Materials and methods: The study group consisted of 78 patients who underwent modified maximal thymectomy for myasthenia from 1990 to 2007. Indications for thymectomy included: ocular myasthenia refractory to medical treatment, generalized myasthenia and thymomatous myasthenia. The data collected included preoperative disease’s severity (modified Osserman classification), preoperative medical treatment, age at onset of the disease (≤ 40/ > 40 years), time elapsed between diagnosis and thymectomy (≤ 12/ > 12 months), gender, thymus gland histology, mortality and morbidity. In thymoma patients further analysis was carried out according the World Health Organization histological classification and the Masaoka stage of the tumors. The evaluation of the neurological outcome at the end of follow up was performed according the Myasthenia Gravis Foundation of America classification. Both the effectiveness of the resection performed and the comparison of our results with those of previous studies were done using the complete stable remission as the end point of the study. The statistical analysis of the results was carried out using the SPSS 17. Kaplan-Meier life table analysis was performed and the log rank test was used to evaluate the effect of the variables examined on the distribution of disease’s remission over time. The Cox proportional hazard model was also applied to verify the concurrent effect of the evaluated factors on the achievement of complete stable remission. P values < 0.05 were considered statistically significant. Results: 51 patients suffered of non thymomatous myasthenia while 27 patients had myasthenia with thymoma. The two groups were comparable in refer to the clinical features of the patients apart the more advanced age at the time of the diagnosis for thymoma patients. There was no perioperative mortality, while the surgical morbidity was comparable to the one reported in other series of patients with different surgical approaches and was 7.7%. The rate of postoperative myasthenic crisis was only 3.8%. Thymoma and non thymoma patients experienced comparable complete stable remission prediction (74.5% vs 85.7% at 15 years, p= 0.632). The absence of steroids in the preoperative medical regimen was statistically associated with the achievement of complete stable remission in both thymoma (95% CI 2.687-339.182, p= 0.006) and non thymoma patients (CI 95% 1.607-19.183, P= 0.007) in multivariate analysis. There was an important difference, although not statistically significant, for the neurological outcome between early and late surgical treatment. When the 27 patients with myasthenia and thymoma were compared with other 12 patients similarly operated for thymoma without symptoms and signs of muscular weakness we found that the presence of myasthenia was statistically associated with improved survival (100% vs 38.8% at 10 years, p< 0.001). Non thymoma patients presenting with late onset myasthenia, experienced high improvement (complete stable remission excluded) rate reaching up to 70% at the end of follow up. Among patients with thymomatous myasthenia gravis the World Health Organization histological classification was statistically associated with the late neurological outcome. Thymoma types A, B3 and B2 reached a high to excellent prediction of disease’s remission while types AB, B2 and C had a disappointing neurological outcome. Conclusons: The present study demonstrated that the modified maximal thymectomy is a safe procedure, associated with an excellent neurological outcome in both thymomatous and non thymomatous myasthenia. The patients should be operated early after the diagnosis is made with the disease’s severity being the prime determinant of the possibility to achieve complete remission of myasthenic symptoms. The evaluation of disease’s severity requires objective criteria like the ones proposed by the Myasthenia Gravis Foundation of America. The inclusion in these criteria of molecular markers related to myasthenia’s prognosis and its neurological outcome after thymectomy may further enhance its validity and may allow the identification of subgroups of patients with different disease prognosis after thymectomy. The presence of muscular weakness may lead to early diagnosis and surgical treatment of thymomas with improved survival. Finally the neurologic outcome in thymoma patients after thymectomy may be statistically associated with the World Health Organization classification subtypes but not necessarily with the aggressiveness of these tumors.