Introduction & Aims: Not only is sepsis a devastating clinical syndrome it has immense direct and indirect costs to the NHS. Sepsis is caused by bacterial molecules, the most common, lipopolysaccharide (LPS). The current diagnostic assay utilises Factor C (FC) a protein that initiates the coagulation cascade in horseshoe crabs, which activates in the presence of minute amounts of LPS forming the basis of the Pyrogene® assay. However, activation of FC in this assay requires an hour to complete, a reaction that occurs within seconds in its native environment, suggesting that key chaperones are absent from the commercial assay. FC is a thiol rich protein and our hypothesis is that changes in the redox environment together with a deeper understanding of potential unidentified chaperones will improve LPS activation, ultimately reducing the assay time. Methods: FC was over-expressed and purified using Gateway® cloning system and a series of purification techniques. Western blot analysis and the FC assay assessed the efficiency of purified FC under various redox conditions. Finally, using targeted affinity proteomics key proteins involved in LPS binding were identified. Results & Implications: FC was successfully over-epxressed and partially purified using its GST-tag. Further optimisation of FC purification should be considered. This formed the template for the generation of 6 CXXC mutants, (3X N-terrninal and 3X double thiol mutants) that showed altered FC activity. The activity of the N-terminal mutants was reduced by up to 20% (G323C), suggesting that the N-terminal cysteine residue is required for the function of FC. However, double CXXC mutants improved activity by 20% (G323C-G332C) indicating that the protein can correctly fold resulting in more factorable LPS binding conditions. The importance of the redox environment is further demonstrated when the activity of FC is lost when incubated with the reducing agent DD, however, oxidising agents improved the activity. These findings confirm that disulphide bonding is key in regulating FC activity. Finally, targeted affinity proteomics identified Tachylectin-2, Hemagglutinin/Amebocyte aggregation factor (18K-LAF), which suggests that they may play similar roles to LBP and CD14 signalling. These proteins can be further investigated by including them in current LPS detection assays to assess if they improve on Fe activity and reactions times. More interestingly, the identification of Coagulogen, that has not previously been implicated in LPS binding, has led to the hypothesis that it these proteins may interact and form a metabolon, which may give an insight as to how the horseshoe crab can complete the cascade in 90 seconds.

Clostridium difficile is a major cause of nosocomial intestinal infection. The pathogen possesses two potent toxins, Toxin A and Toxin B, both of which contribute to diarrhoea, intestinal inflammation and tissue damage. Antibiotics are effective against the disease, however around 20 % of patients on treatment relapse after the termination of antibiotic therapy. The binding of Toxin A to a receptor on human intestinal epithelial cells initiates disease: this is considered the starting point from which the toxin elicits its effect. One feature of the carboxy-terminal domain of Toxin A is the presence of repeating units of amino acids that form a series of binding sites able to recognise disaccharides and trisaccharides on glycolipid and glycoprotein receptor molecules. Antibody response against the toxin can protect against C. difficile disease and efforts to generate vaccines have focused upon the carboxy-terminal, receptor binding domain. The aims of this project were to use phage display to isolate recombinant antibodies against those features of the carboxy-terminal domain of Toxin A thought to be responsible for receptor-binding and to assess if the antibodies were capable protecting against the action of Toxin A. Using published crystallographic data that has shown the interaction of Toxin A and trisaccharide, a region of about 113 amino acids from the carboxy-terminal region of Toxin A was expressed as a fusion to maltose-binding protein. The MBP fusion protein was expressed, purified on amylose resin, and characterised. The fusion protein was then used to isolate single chain antibodies from the Tomlinson libraries of scFvs, a synthetically diversified phage display library of single scaffold human antibodies. Conventional bio-panning methods were used in which the MBP fusion protein was bound to a plastic surface and the phage display libraries were pre-mixed with native MBP to inhibit the isolation of anti-MBP antibodies. Progressive enrichment of scFvs through 3 rounds of selection was observed. Those scFvs that showed strongest reaction against the target protein in ELISA but failed to react with native MBP were sequenced, expressed as soluble antibodies and purified on nickel chelating columns. While the resulting panel of scFvs showed similarities of sequence, none were identical. All were reactive with native, full-length Toxin A and appeared to bind to conformational (nonlinear) epitopes. Cross-reaction with Toxin B from C. difficile was also evident. A panel of truncation mutants were generated from the MBP fusion protein and using these in ELISA with the scFvs, reactivity appeared to be directed to features of a long repeat sequence of Toxin A. To assay whether the isolated scFvs possessed biological activity of significance, in vitro and in vivo protection assays were established. For experiments in vitro, the action of Toxin A upon cultured Vero cells was studied. Native Toxin A triggered a conversion of the cells from stellate to rounded morphology. When cells were exposed to 100 ng of toxin, this effect was evident within 60 minutes; at a 10-fold lower dose, the minimum quantity to which a response was detectable, virtually all cells had undergone rounding within 2 h. When individual scFvs were mixed with 10 ng of Toxin A prior to addition to Vero cells, there was a consistent delay in cytopathic activity that extended to 5 h. In this assay, the percentage of cells that had retained their stellate morphology 5 h post-challenge was dependent on the scFv used. To quantify the potency of this neutralising activity, the amount of each scFv required to achieve 50% protection during a 2 h challenge period was established. This revealed 3.5-fold difference between the most and the least effefctive scFv. The most potent scFv was used in an in vivo assay in which Toxin A was administered to the ligated intestinal loops of rats. Again, protective activity was evident. Overall, phage display technology enabled the assembly of a panel of scFv antibodies against the putative receptor binding site in the carboxy-terminal domain of Toxin A from C. difficile. The scFvs were able to protect against the cytopathic activity of Toxin A in vitro and in vivo and proposals are made about how these observations could be taken forward in a model of C. difficile infection that best mimics the human disease.

Staphylococcus aureus is a leading cause of healthcare associated infection. Efforts to reduce the burden of S. aureus infections in healthcare settings have targeted patient carriage and preventing person-to-person transmission. These measures have only been partially successful. Our understanding of S. aureus transmission is limited by low discrimination of currently available typing techniques. The high resolution offered by whole-genome sequencing (WGS) has the potential to overcome these limitations. Work undertaken in this thesis exploits recent advances in WGS to understand S. aureus transmission in health care settings and in so doing establish the potential for WGS to replace current typing systems in infection control practice. The first study compares conventional approaches and WGS to investigate an outbreak of Methicillin Resistant S. aureus (M RSA) blood stream infections in a single UK hospital. By WGS, isolates within the EMRSA-16 lineage (one of the two dominant nosocomial MRSA lineages) showed strikingly low genetic diversity demonstrating the emergence of a clonal variant. This clonal variant, indistinguishable from the ancestral strain by conventional typing, accounted for 89% ofEMRSA-16 bacteraemia isolates at the outbreak hospital from 2006 and was associated with greater neutrophilia (p<0.00 1) compared with infection caused by other strains. Investigation of local and national S. aureus collections revealed the presence of isolates highly related to the variant in other hospitals across England, suggesting spread across large geographical areas. This represents the first report of a clonal variant being associated with an outbreak and provides novel insight into the epidemiology and population structures within dominant S. aureus lineages. The second study investigated the role of colonised patients as the source of new S. aureus acquisition in a hospital setting. Over 14 months all patients admitted to an adult intensive care unit were assessed for carriage, acquisition and their role in transmission. Among 680 patients where two or more serial samples were available only 44 acquisitions were observed. Isolates were available for genetic analysis from 37 acquisitions and among these only 7 (18.9%) could be explained by patient-topatient transmission. WGS disproved 3 transmission events indicated by conventional methods (spa-typing combined with overlapping patient stay) and also revealed 4 transmission and 2 acquisition events.

Σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η επιδημιολογική μελέτη των σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων από πηκτάση–αρνητικούς σταφυλοκόκκους (CNS) σε ασθενείς της Μονάδας Εντατικής Θεραπείας των πρόωρων νεογνών του Πανεπιστημιακoύ Γενικού Νοσοκομείου Πατρών (ΠΓΝΠ) μεταξύ 2002-2004. Κατά τη διάρκεια της μελέτης, συλλέχθηκαν συνολικά 287 στελέχη CNS. Τα στελέχη ελέγχθηκαν για την παραγωγή της πρωτεΐνης PBP2α και την ύπαρξη του γονιδίου mecA για τον προσδιορισμό των ανθεκτικών στη methicillin στελεχών CNS. Από το σύνολο των 287 CNS, τα 132 (46%) χαρακτηρίσθηκαν ως MRCNS. Τα MRCNS αποτελούν σοβαρό πρόβλημα για τα νοσοκομεία, γιατί αυξάνουν τον χρόνο παραμονής των ασθενών στο νοσοκομείο, άρα και το κόστος νοσηλείας και θεραπείας. Έγινε μελέτη του φαινοτύπου αντοχής των στελεχών σε αντιβιοτικά, της κλωνικής τους διασποράς και της ικανότητάς παραγωγής βιομεμβράνης σε σύγκριση με την παρουσία των γονιδίων του οπερονίου ica. Για την επιδημιολογική μελέτη των λοιμώξεων που οφείλονται σε MRCNS, μέθοδος αναφοράς είναι η PFGE, κυρίως σε συνδυασμό και με υβριδισμό του χρωμοσωμικού DNA με ειδικούς ανιχνευτές. Όλα τα στελέχη MRCNS ήταν πολυανθεκτικά και η πλειονότητά τους παρήγαγε βιομεμβράνη (89%). Μεταξύ των 115 στελεχών S. epidermidis αναδείχθηκε ένας κυριάρχος κλώνος (z) (77 στελέχη) και ακολούθησε ο κλώνος (g). Τα δέκα από τα δεκαέξι στελέχη του είδους S. haemolyticus ανήκαν στον κλώνο (y). Το οπερόνιο ica συμβάλλει στην παραγωγή της εξωκυττάριας ουσίας polysaccharide-intercellular-adhesin (ΡΙΑ) που είναι το κύριο συστατικό του biofilm. Η έκφραση των γονιδίων του οπερονίου ica επάγεται από την παρουσία του ρυθμιστικού γονιδίου sarA, ενώ καταστέλλεται από το γονίδιο icaR. Τα περισσότερα στελέχη που ήταν biofilm-θετικά (80%) έφεραν όλα τα γονίδια του οπερονίου ica και το τρανσποζόνιο IS256, ενώ τα υπόλοιπα 23 είχαν ποικίλους συνδυασμούς των γονιδίων. Η παρουσία όλων των γονιδίων του οπερονίου ica ανιχνεύθηκε σε τρία από τα δεκαπέντε biofilm-αρνητικά στελέχη. Αναδείχθηκαν ένας κύριος και δύο δευτερεύοντες biofilm-θετικοί, πολυανθεκτικοί MRCNS κλώνοι, που αποίκισαν και προξένησαν λοιμώξεις στα πρόωρα νεογνά. Μέρος της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η διερεύνηση της επίδρασης του χρόνου επώασης στη γονιδιακή έκφραση σε δεκατέσσερα αντιπροσωπευτικά στελέχη. Αυτό έγινε μέσω της ποσοτικοποίησης με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (RT-PCR) των γονιδίων icaA και icaD τα οποία κυρίως σχετίζονται με την παραγωγή biofilm, καθώς και δύο ρυθμιστικών γονιδίων icaR και sarA σε σύγκριση με ένα συντηρημένο γονίδιο αναφοράς (23S rDNA). Ο έλεγχος έγινε σε στελέχη S. epidermidis που ήταν ανθεκτικά στη methicillin, κατατάσσονταν σε διαφορετικούς κλώνους, εμφάνιζαν διαφορετικό φαινότυπο σύνθεσης βιομεμβράνης και έφεραν ποικίλους συνδυασμούς γονίδιων. Οι αντιδράσεις απόλυτης ποσοτικοποίησης έκφρασης των γονιδίων είχαν υψηλή απόδοση (1,86 και 1,84 για την επώαση στις τέσσερις ώρες και δύο ώρες, αντίστοιχα). Η μαθηματική ανάλυση δεν έδειξε ιδιαίτερα μεγάλες διαφορές μεταξύ των αποτελεσμάτων για τα τέσσερα γονίδια και τους δύο χρόνους επώασης. Αυτό που παρατηρήθηκε ήταν οτι η έκφραση ήταν υψηλότερη στα biofilm-θετικά στελέχη. Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση της βακτηριακής προσκόλλησης στις διάφορες επιφάνειες τροποποιημένου και μη τροποποιημένου γυαλιού, πραγματοποιήθηκαν δυναμικά πειράματα, κάτω από δύο διαφορετικές συνθήκες ροής, σε δύο χρόνους επώασης σε τέσσερα στελέχη S. epidermidis. Η βακτηριακή προσκόλληση, η παραγωγή biofilm και ο σχηματισμός βιομεμβράνης στις τροποποιημένες επιφάνειες ήταν αυξημένα σε σχέση με τις μη τροποποιημένες. Αυτό ήταν σε συμφωνία με τα αποτελέσματα της γονιδιακής έκφρασης των γονιδίων icaA και icaD, μετά από ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων icaA και icaD με RT-PCR, που έδειξε αυξημένες τιμές στις τροποποιημένες επιφάνειες, κυρίως στην υψηλή ροή. Επομένως, ο συνδυασμός της δράσης της χημείας της επιφάνειας και της ροής, επηρεάζουν την προσκόλληση, τον φαινότυπο και το γονότυπο των βακτηριακών στελεχών, όπως και την προσαρμογή τους στις αλλαγές του περιβάλλοντος. Η μελέτη της γονιδιακής έκφρασης μπορεί να βοηθήσει στην κατανόηση των αλληλεπιδράσεων της βακτηριακής προσκόλλησης με το βιοϋλικό. / A total of 132 methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci (MRCNS) isolated from preterm neonates were studied for antibiotic resistance patterns, clonal distribution and biofilm formation in relation to the presence of ica operon. All MR-CNS were multi-resistant while the majority (89%) produced biofilm. Among 115 Staphylococcus epidermidis, a major clone (z) was identified (77 strains), followed by clone g. Ten out of 16 S. haemolyticus belonged to a common clone (y). Most of the biofilm-positive strains (80%) possessed all tested genes, while the remaining 23 had a variety of gene combinations. Presence of the entire ica cluster was detected in three out of 15 biofilm-negative strains. One major and two minor biofilm-positive, multi-resistant MRCNS clones were disseminated, colonizing and infecting hospitalized preterm neonates. Fourteen representative MR- S. epidermidis strains were selected and investigated for the expression of icaA and icaD genes, and two regulatory genes, icaR (repressor) and sarA (inducer), towards a housekeeping gene (23SrDNA), by Real-Time PCR (RT-PCR). These strains belonged to various clones, had different combinations of ica genes and biofilm-forming phenotypes. The experiments were performed in two incubation times, after two and four hours. Νο differences were observed at the gene expression level at the two tested times. In general, biofilm-positive strains had higher expression rates for ica operon and sarA genes and lower for the repressor of ica cluster gene (icaR). In order to investigate the interaction of bacteria with the surfaces after attachment, dynamic experiments were performed under two flow conditions. Two different surfaces were used, a modified and a non-modified glass surface. Bacterial adhesion, as well as biofilm production and biofilm formation, was much higher on the modified surface than on the non-modified one for four S. epidermidis strains. This was in agreement with icaA and icaD gene expression that showed increased expression by RT-PCR, for the bacteria adhered at the modified substrate, especially under the high shear rate. Therefore, the combined effect of surface chemistry and shear significantly influence the adhesion of interacting bacterial cells. This indicates that analysis of gene expression not only can greatly refine our knowledge of bacterial-material interactions, but also yield novel biomarkers for potential use in biocompatibility assessment.

Σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η επιδημιολογική μελέτη των λοιμώξεων από πηκτάση-αρνητικούς σταφυλοκόκκους (CNS) σε ασθενείς με προσθετικά υλικά, όπως ενδαγγειακούς καθετήρες και η σύγκριση με στελέχη που προκαλούν βακτηριαιμία. Συνολικά μελετήθηκαν 168 Staphylococcus epidermidis και 58 S. haemolyticus από βακτηριαιμίες (BSIs, 100 στελέχη) και εντοπισμένες λοιμώξεις σχετιζόμενες με την εφαρμογή προσθετικών υλικών (PDAIs, 126 στελέχη) από ασθενείς του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών (ΠΓΝΠ) και του Νοσοκομείου Παίδων Πεντέλης (ΝΠΠ). Η πλειοψηφία των στελεχών (89.8%) ήταν ανθεκτικά στην methicillin (MR-CNS) και πολυανθεκτικά (90.7%). Βιομεμβράνη συνέθεταν τα 106/226 στελέχη, ενώ 208 παρήγαγαν β-λακταμάση. Τα γονίδια σύνθεσης προσκολλητινών aap, fnbA και bap βρέθηκαν σε συχνότητα 40.3%, 35.8% και 20.4% αντίστοιχα. Οι S. epidermidis έφεραν τα γονίδια atlE και fbe σε ποσοστά 88.1% και 81%, αντίστοιχα. Από τα γονίδια σύνθεσης τοξινών, συχνότερο ήταν το γονίδιο της τοξίνης τοξικής καταπληξίας tst (8.4%) ενώ τα γονίδια που κωδικοποιούν τις εντεροτοξίνες sea, sec βρέθηκαν μόνο σε μικρό ποσοστό στελεχών S. epidermidis και S. haemolyticus (5.3% και 3.1% του συνολικού πληθυσμού αντίστοιχα). Κανένα στέλεχος δεν έφερε τα γονίδια σύνθεσης των εντεροτοξινών seb και sed. Ο πληθυσμός των στελεχών S. epidermidis έδειξε μεγάλη γενετική ποικιλομορφία, με 67 PFGE τύπους, μεταξύ των οποίων δύο κύριοι τύποι (a, b) με 50 και 36 στελέχη αντίστοιχα. Έλεγχος με MLST ανέδειξε τρεις κύριους κλώνους (ST2, ST5 και ST16) που ανήκαν στο ίδιο κλωνικό σύμπλεγμα (Clonal Complex 2). Τα στελέχη του PFGE τύπου a παρουσίασαν υψηλότερα ποσοστά αντοχής στα αντιμικροβιακά clindamycin, ciprofloxacin, fusidic acid, SXT και στις αμινογλυκοσίδες, ενώ τα στελέχη του τύπου b έφεραν συχνότερα το γονίδιο aap (p=0.049). Τα στελέχη S. haemolyticus παρουσίασαν μικρότερη γενετική ποικιλομορφία, με έναν κύριο PFGE τύπο (h), που περιελάμβανε 44/58 στελέχη (75.9% του συνολικού πληθυσμού). Τα στελέχη CNS από BSIs ήταν συχνότερα ανθεκτικά στην methicillin (p<0.001) και στα υπόλοιπα αντιμικροβιακά (p<0.05), ενώ υπερείχαν και στην παραγωγή biofilm (p=0.003). Αντιθέτως, οι CNS από PDAIs έφεραν συχνότερα τα γονίδια των προσκολλητινών aap (p=0.006) και bap (p=0.045). Σε ένα δεύτερο σκέλος της παρούσας ερευνητικής εργασίας μελετήθηκε ένας πληθυσμός S. lugdunensis από το ΠΓΝΠ (37 στελέχη) και το ΝΠΠ (1 στέλεχος). Ο S. lugdunensis κατέχει ιδιαίτερη θέση μεταξύ των CNS, καθώς μπορεί να μιμηθεί την παθογόνο δράση του S. aureus και να προκαλέσει σοβαρές λοιμώξεις. Είκοσι δύο S. lugdunensis απομονώθηκαν από ασθενείς με λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων (Skin and Soft Tissue Infections: SSTIs), εννέα από εν τω βάθει λοιμώξεις (Deep Sited Infections: DSIs), συμπεριλαμβανομένων τριών στελεχών από ασθενείς με βακτηριαιμία, και επτά στελέχη από λοιμώξεις σχετιζόμενες με προσθετικά υλικά, κυρίως ενδαγγειακούς καθετήρες, (PDAIs). Όλα τα στελέχη ήταν ευαίσθητα στην methicillin (MS-CNS), στις αμινογλυκοσίδες (kanamycin, gentamicin), καθώς και στα: ciprofloxacin, rifampicin, teicoplanin, vancomycin, linezolid και daptomycin, ενώ μόνο τέσσερα στελέχη ήταν πολυανθεκτικά. Οι S. lugdunensis της συλλογής μας έδειξαν μικρή γενετική ποικιλομορφία. Τα 38 στελέχη ταξινομήθηκαν σε επτά κλώνους, με δύο κύριους PFGE τύπους (C και D), οι οποίοι περιελάμβαναν 22 και εννέα στελέχη αντίστοιχα. Τα 26 από τα 38 στελέχη έφεραν το οπερόνιο ica, ενώ συνολικά 14 ήταν biofilm-θετικά. Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση της παρουσίας του ica με κάποιο κλώνο, αλλά ούτε και με την παραγωγή βιομεμβράνης. Οι S. lugdunensis από PDAIs ήταν συχνότερα biofilm-θετικοί σε σχέση με τα στελέχη από SSTIs και DSIs, ενώ ο κύριος κλώνος C παρήγαγε biofilm σε μεγαλύτερο ποσοστό από τον D, δεύτερο σε συχνότητα κλώνο. Το γονίδιο fbl ανιχνεύθηκε σε όλα τα στελέχη S. lugdunensis που εξετάστηκαν, επιβεβαιώνοντας την φαινοτυπική ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους. Ο επόμενος κατά σειρά συχνότητας παράγοντας παθογένειας που ανιχνεύθηκε ήταν το γονίδιο atlL, το οποίο βρέθηκε σε 36 από τα 38 στελέχη (94.7%). Ακολουθούν οι παράγοντες vwbl και slush, που βρέθηκαν σε 31 (81.6%) και 15 (39.5%) S. lugdunensis, αντίστοιχα. Τα στελέχη από εν τω βάθει λοιμώξεις (DSIs) έφεραν σε μεγαλύτερο ποσοστό τα γονίδια vwbl και slush σε σχέση με αυτά από PDAIs και SSTIs . Ο κλώνος C υπερείχε στην παρουσία του ermC, ενώ τα στελέχη που ανήκαν στον κλώνο D έφεραν σε μεγαλύτερο ποσοστό τα γονίδια vwbl και slush. / Coagulase-negative staphylococci (CNS), especially Staphylococcus epidermidis and S. haemolyticus, have emerged as opportunistic pathogens in patients with low immune response or indwelling medical devices. In the present study, bloodstream (BSIs) and prosthetic-device associated infections (PDAIs) CNS isolates were compared in terms of biofilm formation, antimicrobial resistance, clonal distribution, adhesin and toxin genes carriage. A collection of 226 CNS (168 S. epidermidis and 58 S. haemolyticus) recovered from BSIs (100) and PDAIs (126) of different patients in the Patras tertiary-care University General Hospital (UGHP) and Pentelis Paediatric Hospital in Athens (PPHA), was tested for biofilm formation, antimicrobial susceptibility, mecA, ica operon, adhesin (aap, bap, fnbA, atlE, fbe) and toxin (tst, sea, seb, sec, sed) genes carriage. All CNS were classified into pulsotypes by PFGE, whereas S. epidermidis strains were assigned to sequence types by MLST. In total, 106 isolates (46.9%) produced biofilm, whereas 150 (66.4%) carried ica operon. Most isolates carried mecA and were multidrug resistant (90.7%). The adhesin encoding genes aap, fnbA and bap were identified in 40.3%, 35.8% and 20.4% of the total population, respectively. Genes encoding AtlE and Fbe were found in 88.1% and 81% of S. epidermidis isolates, respectively. CNS recovered from BSIs prevailed in biofilm formation (P=0.003), resistance to antimicrobials and mecA carriage (P<0.001) as compared to isolates derived from PDAIs. CNS from PDAIs carried more frequently aap and bap genes (P=0.006 and P=0.045, respectively). No statistically significant difference in toxin genes carriage was identified (P>0.05). Even though PFGE showed genetic diversity, especially among S. epidermidis, analysis of representative strains from the main PFGE types by MLST, revealed three major clones (ST2, ST5, ST16). A clonal relationship was found concerning antimicrobial susceptibility, ica and aap gene carriage, reinforcing the aspect of clonal expansion in hospital settings. Pathogenesis of BSIs is associated with biofilm formation and high-level antimicrobial resistance, whereas PDAIs are related to the adhesion capability of CNS. In the second part of this study we analyzed a collection of S. lugdunensis isolates recovered from different inpatients hospitalized in UGHP (37 isolates) and PPHA (one isolate) during a six-year period (2008-2013). S. lugdunensis has emerged as a significant human pathogen with distinct clinical and microbiological characteristics. A collection of 38 S. lugdunensis was tested for biofilm formation, antimicrobial susceptibility, clonal distribution, virulence factors (ica operon, fbl, atlL, vwbl, slush) and antibiotic resistance genes (mecA, ermC) carriage. The majority (22) was isolated from skin and soft tissue infections (SSTIs), nine from deep-sited infections (DSIs), including three bacteraemias and seven from PDAIs. All isolates were oxacillin-susceptible, mecA-negative and fbl-positive. The higher resistance rate was detected for ampicillin (50%), followed by erythromycin and clindamycin (18.4%). Fourteen isolates (36.8%) produced biofilm, 26 carried ica operon, but no relation between ica carriage and biofilm formation was identified. Biofilm formation was more frequent in isolates recovered from PDAIs. Thirty six strains (94.7%) carried atlL, 31 (81.6%) vwbl, whereas, slush was detected in fifteen (39.5%). PFGE revealed low level of genetic diversity: strains were classified into seven pulsotypes, with two major clones C and D including 22 and nine strains, respectively. Type C strains, recovered from all infection sites, prevailed in biofilm formation and ermC carriage, whereas, type D strains, associated with SSTIs and DSIs, carried more frequently vwbl, slush or both genes. Despite susceptibility to antimicrobials, clonal expansion and carriage of virulence factors combined with biofilm-producing ability render this species an important pathogen that should not be ignored.

Ο S. epidermidis αποτελεί κύριο μέλος της χλωρίδας του δέρματος και των βλεννογόνων του ανθρώπου, ενώ συνιστά ένα από τα συχνότερα παθογόνα που προκαλούν νοσοκομειακές λοιμώξεις, ιδιαίτερα σε ανοσοκατασταλμένους ή ασθενείς φέροντες προσθετικά υλικά. Κύριος λοιμογόνος παράγοντας του S. epidermidis είναι ο σχηματισμός βιομεμβράνης. Διάφοροι πολυσακχαρίτες έχουν απομονωθεί από την εξωκυττάρια ουσία του S. epidermidis και έχουν συσχετισθεί με το σχηματισμό βιομεμβράνης καθώς και με την παθογόνο δράση τους. Ο πλέον μελετημένος και εδραιωμένος είναι ο ΡΙΑ, ενώ οι άλλοι πολυσακχαρίτες (PS/A ή PNSG ή PNAG και το SSA) απεδείχθησαν τελικώς ότι είναι ταυτόσημοι ή χημικώς ανάλογοι του ΡΙΑ. Ο ΡΙΑ είναι μία ομογλυκάνη αποτελούμενη από μονάδες Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης συνδεδεμένες με β-1,6-γλυκοζιτικό δεσμό και η σύνθεσή του ελέγχεται από ένζυμα που κωδικοποιούνται από τον icaADBC γενετικό τόπο. Η εξωκυττάρια ουσία του S. epidermidis περιέχει επίσης έναν πολυσακχαρίτη, τον 20-kDaPS, ο οποίος απομονώθηκε από ερευνητές του Πανεπιστημίου Πατρών και αποτελείται κυρίως από γλυκόζη, Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη, και είναι μερικώς θειωμένος. Ο 20-kDaPS αντιορός αναστέλλει την προσκόλληση του S. epidermidis στα ενδοθηλιακά κύτταρα και την εμφάνιση βακτηριακής κερατίτιδας σε κουνέλια. Με βάση αναλύσεις κλινικών στελεχών, ο 20-kDaPS εκφράζεται σε μεγάλο ποσοστό στελεχών S. epidermidis, ενώ δεν ανευρέθηκε σε στελέχη άλλων πηκτάση αρνητικών σταφυλοκόκκων. Η παρεμβολή αλληλουχιών εισδοχής σε διάφορα σημεία του icaADBC οπερονίου, το οποίο ελέγχει τη σύνθεση του ΡΙΑ, δεν παρεμβάλλεται στην έκφραση του 20-kDaPS. Η κατεργασία βακτηριακών κυττάρων S. epidermidis με το ένζυμο dispersin B, το οποίο διασπά ειδικά τον β-1,6-γλυκοζιτικό δεσμό που συνθέτει το πολυμερές του ΡΙΑ, και με μετα-περιοδικό νάτριο που διασπά το δεσμό μεταξύ των ατόμων άνθρακα C-3 και C-4 των μονομερών Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης, οδηγεί σε διάσπαση της βιομεμβράνης, χωρίς όμως να διαφοροποιείται αντιγονικά ο 20-kDaPS. Τα κλάσματα, μετά την έκλουση της εξωκυττάριας ουσίας του S. epidermidis από στήλη Q-Sepharose, που εμφανίζουν τη μεγαλύτερη ανοσοδραστικότητα για τον ΡΙΑ, στερούνται πλήρως 20-kDaPS. Η προεπώαση κλινικού στελέχους που δεν εκφράζει τον 20-kDaPS με τον πολυσακχαρίτη αναστέλλει την ενδοκυττάρωση, ενώ η προεπώαση του πρότυπου στελέχους ATCC35983 που συνθέτει τον 20-kDaPS με ειδικό αντιορό ενισχύει την ενδοκυττάρωση από τα ανθρώπινα μακροφάγα. Κατά συνέπεια, ο icaADBC γενετικός τόπος δεν εμπλέκεται στη σύνθεση του 20-kDaPS. Οι ανοσοχημικές και χρωματογραφικές ιδιότητες του PIA και του 20-kDaPS είναι διακριτές. Ο 20-kDaPS πιθανό να επιδεικνύει αντιφαγοκυτταρική δράση, ενώ τα ειδικά αντισώματα έχουν δράση οψωνίνης. Η οργάνωση των βακτηρίων εντός βιομεμβράνης προστατεύει από τις αντιμικροβιακές ουσίες και το σύστημα ανοσίας. Τα βακτήρια εντός βιομεμβράνης περιέχουν στην εξωκυττάρια ουσία τους μεγαλύτερα ποσά ΡΙΑ από τα ελεύθερα αναπτυσσόμενα, πλαγκτονικά κύτταρα. Τα βακτήρια εντός βιομεμβράνης επιδεικνύουν μεγαλύτερη ικανότητα για προσκόλληση και επιβίωση εντός των ανθρώπινων μακροφάγων από τα πλαγκτονικά κύτταρα. Τα βακτήρια εντός βιομεμβράνης επάγουν την παραγωγή μικρότερων ποσών φλεγμονωδών κυτταροκινών, όπως ο TNFα, καθώς και Th1 κυτταροκινών, όπως οι IL-12p40, IL-12p70 and IFN-γ, ενώ ενισχύουν τις IL-8, GM-CSF και IL-13. Οι συγκεκριμένες παρατηρήσεις αφορούν ζωντανά βακτηριακά κύτταρα καθώς και βακτηριακά κύτταρα μονιμοποιημένα με φορμαλδεΰδη. Τα ανωτέρω δεδομένα συνάδουν με την ήπια συμπτωματολογία των σχετιζόμενων με βιομεμβράνη λοιμώξεων S. epidermidis και τη διαφυγή της επιτήρησης του ανοσολογικού συστήματος. Συμπερασματικά, ο 20-kDaPS αποτελεί κύριο συστατικό της εξωκυττάριας ουσίας του S. epidermidis με αντιφαγοκυτταρικές και ανοσορρυθμιστικές ιδιότητες. Οι ανοσοχημικές και χρωματογραφικές ιδιότητες του 20-kDaPS είναι πλήρως διακριτές του ΡΙΑ, του κύριου πολυσακχαρίτη που σχετίζεται με το σχηματισμό βιομεμβράνης, ενώ ο γενετικός τόπος icaADBC δε ρυθμίζει τη σύνθεση του 20-kDaPS. Η οργάνωση των βακτηρίων εντός βιομεβράνη εξασφαλίζει αντίσταση στην ενδοκυττάρια θανάτωσή τους από τα μακροφάγα και καταστολή της ανοσιακής απόκρισης. / The skin commensal and opportunistic pathogen Staphylococcus epidermidis is a leading cause of hospital-acquired and biomaterial-associated infections. The polysaccharide intercellular adhesin (PIA), a homoglycan composed of β-1,6-linked N-acetylglucosamine residues, synthesized by enzymes encoded by the icaADBC operon is a major functional factor in biofilm accumulation, promoting virulence in experimental biomaterial-associated S. epidermidis infections. Extracellular mucous layer extracts of S. epidermidis contain another major polysaccharide, referred to as 20-kDa polysaccharide (20-kDaPS), composed mainly out of glucose, N-acetylglucosamine, and being partially sulfated. 20-kDaPS antiserum prevents adhesion of S. epidermidis on endothelial cells and development of experimental keratitis in rabbits. Here we provide experimental evidence that 20-kDaPS and PIA represent distinct molecules and that 20-kDaPS is implicated in endocytosis of S. epidermidis bacterial cells by human monocyte-derived macrophages. Analysis of 75 clinical coagulase-negative staphylococci from blood-cultures and central venous catheter tips indicated that 20-kDaPS is expressed exclusively in S. epidermidis but not in other coagulase-negative staphylococcal species. Tn917-insertion in various locations in icaADBC in mutants M10, M22, M23, and M24 of S. epidermidis 1457 are abolished for PIA synthesis, while 20-kDaPS expression appears unaltered as compared to wild-type strains using specific anti-PIA and anti-20-kDaPS antisera. While periodate oxidation and dispersin B treatments abolish immuno-reactivity and intercellular adhesive properties of PIA, no abrogative activity is exerted towards 20-kDaPS immunochemical reactivity following these treatments. PIA polysaccharide I-containing fractions eluted from Q-Sepharose were devoid of detectable 20-kDaPS using specific ELISA. Preincubation of non-20-kDaPS-producing clinical strains with increasing amounts of 20-kDaPS inhibits endocytosis by human macrophages, whereas, preincubation of 20-kDaPS-producing strain ATCC35983 with 20-kDaPS antiserum enhances bacterial endocytosis by human macrophages. In conclusion, icaADBC is not involved in 20-kDaPS synthesis, while the chemical and chromatographic properties of PIA and 20-kDaPS are distinct. 20-kDaPS exhibits anti-phagocytic properties, whereas, 20-kDaPS antiserum may have a beneficial effect on combating infection by 20-kDaPS-producing S. epidermidis. As stated above, biofilm formation is a major virulence factor of S. epidermidis. Biofilm protects bacterial cells from antimicrobial agents and components of the immune system. Interactions of peripheral blood mononuclear cells and monocyte derived macrophages with planktonic or biofilm phase S. epidermidis cells were also studied. Biofilm phase bacteria exhibited higher attachment, as well as, a ten fold higher intracellular survival in monocyte-derived macrophages than their planktonic counterparts. Stimulation of peripheral blood mononuclear cells and monocyte derived macrophages was performed with live or formalin-fixed bacterial cells. Supernatant concentration of selected cytokines was measured by Luminex® xMAP™ technology at different time points. As compared to planktonic phase, biofilm phase bacteria elicited lower amounts of proinflammatory cytokines and Th1 response cytokines, such as TNFα, IL-12p40, IL-12p70 and IFN-γ, whereas, they enhanced production of IL-8, GM-CSF and IL-13. This phenomenon was independent of formalin pretreatment. Taken together, these results may contribute to interpretation of observed silent course of biofilm associated infections. In conclusion, 20-kDaPS represents a major component of S. epidermidis extracellular matrix and data show that 20-kDaPS posseses antiphagocytic and immunomodulatory properties. 20-kDaPS and PIA are immunochemically and chromatographically discrete molecules, whereas icaADBC locus is not involved in 20-kDaPS synthesis. Biofilm mode of growth ensures higher resistance rates to intracellular killing and down regulation of immune responses.