El presente estudio tiene como objetivo determinar la prevalencia e identificar las especies implicadas en los procesos parasitarios del ganado ovino en la Región de Murcia. Para ello, se han examinado 181 ovejas adultas de raza Segureña procedentes de las seis comarcas en que se divide la Región. De cada animal se recogió la cabeza, el sistema digestivo y el cardio-respiratorio para su examen. Asimismo, se tomó una muestra de heces del recto que fue analizada mediante las técnicas de concentración por flotación, concentración por sedimentación y migración larvaria. Todos los animales albergaban una o más especies parásitas, siendo los ovinos del Altiplano y el Noroeste, los de prevalencias más elevadas. Los parásitos encontrados, fueron: Oestrus ovis (38,1%), nematodos broncopulmonares (72,4%), metacestodos (9,9%), nematodos gastrointestinales (91,7%) y trematodos hepáticos (32%). Entre los nematodos broncopulmonares, la especie más prevalente fue Cystocaulus ocreatus (67,7% ) y entre los gastrointestinales destacó Teladorsagia circumcincta (81%). / The aim of this study is to determine the prevalence and to identify the parasitic species affecting sheep in Murcia Region. We examined 181 adult Segureña sheep coming from different areas of Murcia. The head, digestive tract and cardio-respiratory system were removed from every animal for their exam. Also, a faecal sample collected from the rectum of each animal was analysed using the three main coprological techniques (floatation, sedimentation and larval migration). The whole sheep population analysed was parasited by one or more species, being the most affected ones those coming from the Altiplano and Noroeste regions. The found parasites were: Oestrus ovis (38,1%), (72,4%), larval cestodes (9,9%), gastrointestinal nematodes (91,7%) and hepatic trematodes (32%). Within lungworm, the most prevalent species was Cystocaulus ocreatus (67,7%), whereas Teladorsagia circumcincta (81%) highlighted within gastrointestinal nematodes.

El buen funcionamiento de una explotación porcina depende, en parte, de un buen control reproductivo dentro de la misma. Para ello es fundamental disponer de un semen de buena calidad. Sin embargo, esta calidad no se mantiene siempre constante. Existen numerosos factores que pueden influenciar la calidad de un eyaculado. Estos factores pueden clasificarse en factores intrínsecos al animal y factores extrínsecos. Uno de los factores extrínsecos más característicos es el fotoperíodo. El fotoperíodo es un factor muy controvertido en la especie porcina. El estudio de su efecto sobre la reproducción se ha centrado, en gran parte, en la valoración de los cambios producidos en los niveles séricos de diversas hormonas sexuales, como FSH, LH y testosterona. Sin embargo, estos resultados difieren mucho entre autores. Los objetivos de este estudio fueron evaluar el efecto de la luz natural y de dos regímenes lumínicos artificiales sobre la calidad seminal del verraco. Las muestras de semen se obtuvieron de un total de 30 verracos. De éstos, 14 estaban sometidos a un régimen de luz natural y 16 a un régimen de luz artificial. Los verracos del grupo de luz natural fueron sometidos, durante la primera mitad del estudio, a un fotoperíodo creciente y a un fotoperíodo decreciente durante la segunda. Los verracos del grupo de luz fueron sometidos, durante la primera mitad del estudio, a un total de 9 horas de luz diarias y en la segunda mitad a un total de 16 horas de luz diarias. El resto de condiciones de estabulación se mantuvieron constantes durante todo el estudio para todos los animales.La calidad seminal se evaluó mediante determinación de los porcentajes de viabilidad, estado de los acrosomas y anomalías morfológicas, test de resistencia osmótica, ritmo de producción de L-lactato y motilidad. La calidad seminal se determinó con el semen fresco diluido y con el mismo semen conservado durante 72 horas a 16 ºC.En el análisis de resultados se observaron pocas diferencias significativas entre los diferentes tratamientos lumínicos. Las diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) se observaron, casi exclusivamente, en los porcentajes de distribución de las subpoblaciones espermáticas. La mayoría de parámetros analizados no presentaron diferencias significativas. Tampoco se observaron diferencias significativas entre semen fresco diluido y semen conservado, excepto en los porcentajes de distribución de las subpoblaciones.Históricamente, el fotoperíodo se ha considerado un factor modulador de la función reproductora. Sin embargo, nuestros resultados indican que éste no es el caso en la especie porcina. El parámetro que más se vio afectado fue el porcentaje de distribución subpoblacional. Estas variaciones observadas en los porcentajes de distribución subpoblacional podrían deberse, por un lado, a un efecto de la luz sobre el epidídimo y, por otro, a un efecto de la luz sobre el testículo. Las variaciones lumínicas producirían alteraciones en la secreción de testosterona que provocarían cambios en el proceso de maduración y/o espermatogénesis. Sin embargo, es importante recordar que los cambios observados son pocos y de aparente poca relevancia. Así, podríamos afirmar que nuestros resultados no justifican, de ningún modo, cambios en el sistema de iluminación de las naves, dado que la luz no parece ejercer un efecto relevante sobre la calidad seminal del verraco. / The smooth running of a pig keeping depends, partly, on a good reproductive control. Thus, a good seminal quality is essential. However, this quality doesn't remain constant all the time. There are several factors which can influence the quality of ejaculate, and which can be classified in intrinsic and extrinsic to animal. One of the most characteristic extrinsic factors is photoperiod. Photoperiod is a very controversial factor in porcine species. The effect of photoperiod on porcine reproduction has resulted, mainly, in serum level changes on hormones like FSH, LH and testosterone. However, these results differ among authors.The aims of this study were to evaluate the effect of natural light and two artificial light patterns on boar semen quality. The samples were obtained from 30 boars. Fourteen of them were exposed to natural light, and the other sixteen to artificial light. The natural light group was exposed to an increasing light pattern during the first 6 months of the study, and to a decreasing light pattern during the last 6 months. The artificial light group was exposed to 9 hours of light daily during the first 6 months of the study, and to 16 hours during the last 6 months. Experimental conditions other than photoperiod were the same for all the animals during the whole of the study.Seminal quality was evaluated by determining viability, acrosome status and morphologic abnormalities percentages, osmotic resistance test, L-lactate rate rhythm and motility. Seminal quality was determined with both fresh diluted semen and the same samples refrigerated during 72 hours at 16ºC.Not many differences were observed among light patterns when analysing the results. Statistical differences (P<0.05) were observed, almost exclusively, in subpopulations distribution percentages. Most of the analysed parameters did not present statistical differences. No statistical differences between fresh diluted and refrigerated semen were observed either.Historically, photoperiod has been considered a modulator factor of reproductive function. However, our results indicate this is not the case in porcine species. The most affected parameter was the percentage of subpopulations distribution. The changes observed in subpopulations distribution percentages can be due, on the one hand, to an effect of the light on the epididymis and, on the other hand, to an effect of the light on the testis. Variations in light would produce changes in testosterone secretion which would produce changes in the maturation and/or spermatogenesis process. However, it is important to remember that the observed changes are not outstanding. So, we could affirm that our results do not justify changes in the lightning system in the farms, because light does not affect seminal quality in boars.

Tesis por compendio de publicaciones / La industria porcina tiene un considerable interés en el uso de la transferencia de embriones, incluyendo la criopreservación de los mismos. Sin embargo, la utilización comercial de la transferencia de embriones en esta especie ha sido muy limitada debido principalmente a la necesidad de utilizar procedimientos quirúrgicos para la obtención y transferencia de los embriones, y a las dificultades encontradas para la criopreservación de dichos embriones mediante los protocolos tradicionales. Últimamente, se han abierto nuevas expectativas para la utilización comercial de esta tecnología gracias al desarrollo de un procedimiento para transferir embriones por vía no quirúrgica y al desarrollo de la vitrificación como método alternativo a los procedimientos tradicionales de criopreservación. El objetivo de esta tesis es mejorar la transferencia vía no quirúrgica de embriones vitrificados-calentados y, desarrollar un protocolo de vitrificación eficiente para los estadios tempranos de desarrollo de embriones porcinos obtenidos, pudiendo aumentar su viabilidad post-calentamiento. / The swine industry has a considerable interest for the use of embryo transfer and cryopreservation since these technologies may allow the transport and storage of valuable genetic material with minimal health risks and cost. However, the commercial application of embryo transfer in pig has been traditionally limited due to the need of surgical transfer procedures and the difficulties for long-term storage of pig embryos by using traditional cryopreservation methods. However, new perspectives for embryo transfer and embryo cryopreservation have occurred with the development of a new device, for non-surgical embryo transfer and with the development of vitrification as an alternative to traditional cryopreservation methods. This thesis was designed to improve the non-surgical deep intrauterine embryo transfer procedure with vitrified embryos and develop an efficient and practical vitrification protocol for porcine embryos at very early developmental stages.

La inmunomodulación se define como la modificación de la respuesta inmune por medio de la administración de sustancias que poseen la capacidad de regular el sistema inmunitario. INMD es un inmunomodulador compuesto por una combinación de LPS detoxificado de E. coli y células inactivadas de Propionibacterium granulosum, que ha demostrado tener un efecto modulador sobre el sistema inmune del cerdo. En el presente trabajo hemos realizado diversos ensayos in vitro e in vivo con el objetivo de evaluar los efectos que produce este compuesto sobre el sistema inmune del porcino.Se realizaron ensayos in vitro para determinar la acción de INMD o sus componentes por separado sobre la producción o expresión de citoquinas en macrófagos alveolares y células mononucleares de sangre periférica, la activación de la fagocitosis en neutrófilos polimorfonucleares, la activación de linfocitos a través del estudio del receptor para IL-2 (CD25) y la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad tipo-II (MHC-II) en macrófagos alveolares. Observamos que los macrófagos alveolares expresaron IL-1, IL6, IL-12 y produjeron TNF-a, pero no se detectó IL-10, mientras las células mononucleares de sangre periférica expresaron IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 y produjeron INF-g. En la fagocitosis, observamos incremento del número de células que se activaron y fagocitaron. Este efecto estuvo correlacionado con P. granulosum. Observamos que INMD y sus componentes por separado indujeron la expresión de MHC-II en macrófagos alveolares, tanto en aquellos infectados con el virus de la enfermedad de Aujeszky como en las células que no infectadas. Para CD25, observamos que INMD y sus componentes por separado fueron capaces de inducir la expresión de esta molécula que nos indica que se produjo la activación de las células mononucleares de sangre periférica. En este caso, la máxima expresión de CD25 se observó con INMD tanto en células infectadas con el virus de la enfermedad de Aujeszky como en aquellas no infectadas.Se realizaron dos pruebas in vivo. En la primera de ellas se evaluó el efecto de la administración de INMD utilizado como coadyuvante a la vacunación contra el virus de la enfermedad de Aujeszky. Se utilizaron 85 cerdos convencionales divididos en dos grupos (grupo A= 43 y grupo B= 42), que fueron vacunados dos veces contra el virus de la enfermedad de Aujeszky. El grupo B recibió simultáneamente con la primera dosis vacunal, una dosis intramuscular de INMD (20 mg/ml de LPS y 250 mg/ml de P. granulosum). Se realizaron tres sangrados, antes de la primera vacunación y la revacunación, y cinco semanas posteriores a esta. Los sueros se analizaron para anticuerpos frente a gE y gB del virus de la enfermedad de Aujeszky, inmunoglobulinas totales (IgG1, IgG2), inmunoglobulinas especificas (IgA, IgG1, IgG2) para el virus de la enfermedad de Aujeszky, linfoproliferación y títulos neutralizantes frente al virus de la enfermedad de Aujeszky. Al inicio del estudio, el 97,6% de los animales del grupo A y 100% del grupo B, presentaban anticuerpos frente gB, mientras que el 11,6% y 19% de los animales de los grupo A y B, respectivamente, presentaban anticuerpos frente a gE, todos de origen maternal. Al final del ensayo, el 96,4% de los cerdos del grupo A y el 87,1% del grupo B eran gB+ y ninguno presentó anticuerpos frente a gE. Tras la primera vacunación y la aplicación de INMD, los animales del grupo B presentaron niveles totales de IgG1 e IgG2 superiores que los animales del grupo A (p<0,01), diferencias que desaparecieron tras la revacunación. Si bien entre estos isotipos se observó la misma tendencia en los anticuerpos específicos frente al virus de la enfermedad de Aujeszky, esta diferencia no fue significativa. Con relación a las IgA, se observó que tras la revacunación el 38,48% de los animales del grupo B presentaban títulos £1:40, mientras que en el grupo A se observaron estos títulos en el 14,81% de los cerdos (p<0,01). En los ensayos de linfoproliferación no se observaron diferencias significativas entre grupos. En cuanto a los títulos de anticuerpos neutralizantes, se observó una respuesta humoral primaria superior en el grupo B con respecto al grupo A (p<0,005), diferencia que desapareció tras la revacunación. Así mismo, en la respuesta primaria el 56,7% de los cerdos del grupo A presentaban títulos £1:4, mientras que entre el grupo B el 25,6% de los animales presentaban este comportamiento (p<0,05). En un segundo ensayo realizado in vivo, se evaluaron los efectos adversos que pudieran ocasionar la aplicación de INMD a una dosis superior a la recomendada. Se utilizaron ocho cerdos de alta sanidad que se dividieron en tres grupos: Grupo A: INMD (1,2 mg/kg P.V. de LPS y 16 mg/kg P.V. de P. granulosum), Grupo B: INMD (2,6 mg/kg P.V. de LPS y 33 mg/kg P.V. de P. granulosum), Grupo C: solución salina estéril. A los tiempos 0, 1, 2, 4, 6 y 24 horas se realizó el sangrado, para determinar los niveles de TNF-a, la medición de la temperatura corporal y evaluación clínica Ninguno de los animales presentó signos clínicos relacionados con la aplicación de LPS y la liberación de niveles altos de citoquinas.De estos resultados podemos concluir que INMD ejerce su acción sobre el sistema inmunitario induciendo la expresión de citoquinas, incrementando la capacidad fagocítica de los PMN y estimulando la expresión de MHC-II y CD25. Estos efectos pueden contribuir sustancialmente al mejoramiento del proceso de respuesta inmune del cerdo en enfermedades y vacunaciones. / Immunomodulation is defined as the modification of the immune response by means of the administration of substances that possess the ability to regulate the immune system. INMD is an immunomodulator composed by a combination of a detoxified LPS of E. coli and inactivated cells of Propionibacterium granulosum that has demonstrated to have a modulatory effect on the immune system of the pig. In the present study we have done several in vitro and in vivo assays with the objective of evaluate the effects that this compound produces in some components of the immune system in pigs. In vitro assays were made to determine the action of INMD and their components on the cytokine production or expression in alveolar macrophages and peripheral blood mononuclear cells, the activation of phagocytosis in polymorphonuclear neutrophiles, the activation of lymphocytes through the study of the IL- 2 receptor (CD25) and the expression of the major histocompatibility complex class-II (MHC-II) in alveolar macrophages. Regarding the cytokine expression, it could be observed that alveolar macrophages expressed IL-1, IL-6, IL-12 and produced TNF-a, but not IL-10, while the peripheral blood mononuclear cells expressed IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 and produced INF-g in response to INMD stimulation.When the effect of INMD on the phagocytosis exerted by PMN was studied, we observed that the phagocytosis capability of these cells increased. This phenomenon was attributable more to an increase in the number of activated cells than to an increase of individual phagocytic ability. This effect was correlated with P. granulosum. Likewise, we observed that INMD and its separated components induced the expression of MHC-II in alveolar macrophages. Thus as well in cells infected with Aujeszky's disease virus as in those that were not. Regarding CD25, we observed that INMD and its components by themselves alone were able to induce the expression of this molecule, a fact indicates the activation of the peripheral blood mononuclear cells. In this case, the maximum expression of CD25 was observed with INMD both in Aujeszky's disease virus infected cells as well as in uninfected ones.Two in vivo experiments were made. The first one of them the effect of the administration of INMD was evaluated using this product as a coadjuvant to the vaccination against the Aujeszky's disease virus. With this purpose, eighty-five 8-10-weeks-old crossbred conventional pigs were randomly distributed in two groups (group A = 43 and group B = 42), that were vaccinated two times against the Aujeszky's disease virus. Group B animals received simultaneously with the first vaccine dose, an intramuscular dose of INMD equal to 20 mg/ml of LPS and 250 mg/ml of P. granulosum. Blood was collected from all 85 animals before the first vaccination, before the booster and five weeks after the booster. Sera were analysed to determine the presence of Aujeszky's disease virus anti-gE and anti-gB antibodies, total immunoglobulin load (IgG1, IgG2) and Aujeszky's disease virus specific immunoglobulins (IgA, IgG1, IgG2). Lymphoproliferation assays and virus seroneutralization test for Aujeszky's disease virus were also done. Before the first vaccination, 97.6% of pigs in group A and 100% in group B presented anti-gB antibodies, while 11.6% and 19% were seropositive against gE respectively. At the end of the trial, 96.4 % of group A pigs and 87.1% of the animal in group B were gB+ and none of them had anti-gE antibodies. Regarding levels of total immnunoglobulins, after the first vaccination group B pigs had higher levels of IgG1 and IgG2 (p<0,01) but these differences disappeared after the second vaccination. When evaluated Aujeszky's disease virus specific antibodies, were not different between groups, except for IgA. In this case, we observed that after the revaccination, 38.48% of animals in group B presented titres £1:40, while in group A this was observed in the 14.81% of the pigs (p<0.01). In lymphoproliferation assays, significant differences between groups were not observed. Regarding the virus-neutralizing antibodies, we observed higher titres in the group B animals after de first vaccination (p<0.005), differences that disappeared after the booster. Thus after the first vaccination, 56.7% of pigs in group A had titres £1:4, while thus was observed only in 25.6% of the animals in group B (p<0.05). In a second in vivo assay, the adverse effects that could cause the application of INMD were evaluated. With this aim, eight pigs were distributed in three groups. Animals of group A were injected intramuscularly with a dose of INMD corresponding to 1.2 mg/kg of body weight of LPS and 16 mg/ml of body weight of P. granulosum, while those in group B received 2.6 mg/kg of body weight of LPS and 33 mg/kg of body weight of P. granulosum. Animals in group C received similar volume of sterile saline solution. All the animals were bled to determine the levels of TNF-a to the 0, 1, 2, 4, 6 and 24 hours, taking in each one of these times the body temperature. None of the animals had evident adverse effects for LPS or produced by high levels of cytokine. From those results it could conclude that INMD exerts its action on the immune system at least indicating cytokine expression, enhancing phagocytosis capabilities of PMNS and enhancing also the expression on MHC-II and CD25. These effects can contribute substantially improvement of the immune response of pigs in disease state or in vaccination.

Desde su aparición en 1987, el Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS) ha provocado un enorme impacto en la producción porcina mundial. Estudios recientes estiman que sólo en Estados Unidos las pérdidas por costes directos ascienden a 560 millones de dólares anuales. Los resultados obtenidos con las vacunas que se comercializan arrojan ciertas dudas sobre su eficacia. Una de las razones por la que no se han podido desarrollar vacunas más eficientes es la falta de un conocimiento profundo de la respuesta inmune (RI) que ocurre tras la infección.El agente etiológico de esta enfermedad es conocido como virus del PRRS (PRRSV) o arterivirus porcino. Se han descrito dos genotipos, el americano y el europeo. Existe, además, una elevada variabilidad genética dentro de cada genotipo. Hasta la fecha, la mayoría de estudios sobre la RI tras la infección o tras la vacunación con este virus han sido realizados usando cepas americanas. El objetivo de esta tesis doctoral es caracterizar la RI del cerdo frente a cepas del PRRSV del genotipo europeo; primero, durante la infección de lechones con una cepa de campo español y, segundo tras la vacunación con cepas atenuadas (vacunas comerciales), evaluando su eficacia frente a un desafío homólogo o heterólogo. Primer estudio: Los hallazgos más significativos de la RI de los cerdos infectados experimentalmente con una cepa española son: ausencia de producción de IL-2 e IL-4, aparición temprana de anticuerpos no neutralizantes, respuesta neutralizante inconstante y tardía y un desarrollo lento e irregular de CP-IFN-gamma específicas de PRRSV que, sin embargo, podría estar relacionado con el fin de la viremia. Una de las hipótesis que planteamos para explicar la anómala respuesta celular observada es la producción de IL-10 y de haptoglobina en las primeras fases de la infección. Planteamos también la hipótesis que quizás la RI desempeña un papel secundario en la resolución de la infección, tal y como ya se ha demostrado con otros arterivirus como el virus elevador de la lactato-deshidrogenasa del ratón.Segundo estudio: Los cerdos vacunados presentan periodos de viremia muy largos (42 días). Las largas viremias descritas con ambas vacunas denotan una situación indeseable dónde se posibilita la excreción del virus y por tanto la transmisión y la hipotética reversión a virulencia. Sorprendentemente, tras el desafío, se detectó el virus en sangre sólo en los animales vacunados con la cepa homóloga (V1) (4/5). La respuesta humoral neutralizante no aparece antes de los 2 meses post-vacunación y por tanto este parámetro no puede relacionarse con la protección otorgada por las vacunas. Nuestros resultados sugieren que son las CP-IFN-gamma el parámetro inmune que debería considerarse como marcador de protección. Independientemente de la vacuna que les administra, los animales que alcanzan una magnitud mínima de CP-IFN-gamma en el momento del desafío quedan protegidos. De hecho, la vacuna que aporta un mayor grado de protección es la vacuna heteróloga (V3), ya que induce los mayores niveles de CP-IFN-gamma. La falta de protección homóloga (V1) podría explicarse por la capacidad intrínseca de esta cepa de inducir IL-10 incluso en las células de los animales control. Todo ello sugiere que la protección conferida por una vacuna contra el PRRSV no depende sólo de la homología entre el virus vacunal y la cepa del desafío, sino que también debe considerarse el tiempo transcurrido tras la vacunación y las propiedades inmunológicas inherentes de cada cepa.En definitiva, nuestros estudios demuestran que la RI de los lechones tras la infección con una cepa virulenta del PRRSV es prácticamente igual a la que se desarrolla tras la vacunación con cepas atenuadas, ya sean éstas del genotipo europeo o del americano. Además, nuestro segundo estudio demuestra que las CP-IFN-gamma específicas de PRRSV desempeñan un papel importante en la protección frente a la infección. / Since it was described in 1987, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) has become one of the most important diseases in the swine worldwide. A recent study estimates that the economic losses caused by PRRS in the US amount to more than US$ 560 millions annually.Regarding the commercialized vaccines, as of today, there is no convincing evidence indicating that they confer an acceptable and universal protection against the infection. One of the reasons for the lack of development of newer and more efficacious vaccines is the scarce knowledge on the immune response (IR) of pigs after infection by field strains.The etiologic agent for this disease is known as PRRS virus (PRRSV) or Porcine Arterivirus. Two genotypes are recognized (American and European). In addition, genetic diversity of strains within a given genotype is high. To date, the majority of the studies regarding the IR of pigs after the PRRSV infection or vaccination have been done using the American strains. The aim of this thesis is to characterize the IR against the European genotype. Firstly, during the infection of piglets with a wild-type Spanish strain and secondly after the vaccination with two attenuated virus (commercialized vaccines), evaluating their efficacy after a challenge with a homologous or a heterologous strain.First study: The most significant results in the IR of the piglets experimental infected with a Spanish strain are: lack of IL-2 and IL-4 production, early production of non-neutralizing antibodies, inconstant and late humoral neutralizing response and slow and irregular development of PRRSV-specific IFN-gamma-secreting cells (IFN-gamma-SC) measured by ELISPOT. Nevertheless, this last parameter would be associated with the disappearance of the virus from the blood. The IL-10 and haptoglobin production in the first phases of the infection could explain the anomalous cell response observed. We postulate that the IR maybe plays a secondary role in the resolution of the infection, as it has already been demonstrated with other Arterivirus as lactate dehydrogenase-elevating virus of the mice.Second study: After vaccination, some pigs remain viremic as late as 42 days post-vaccination. This extended period of viremia could significantly contribute to the spread of vaccine virus and, potentially, this phenomenon could facilitate the reversion to virulence. Surprisingly, after the challenge, only pigs vaccinated with the homologous strain (V1) become viremic (4/5). Vaccinated pigs do not develop neutralizing antibodies before the challenge. Therefore, this parameter cannot be related to the protection conferred by the vaccines. Our results suggest that IFN-gamma-SC play an important role in protection against the PRRSV infection in piglets. Regardless of the vaccine used, the pigs are protected if IFN-gamma-SC reach a minimum frequency at time of the infection. In fact, heterologous vaccine (V3) confers the best protection because it induces the highest IFN-gamma-SC frequency. The lowest protection conferred by the homologous vaccine (V1) could be explained by its intrinsic ability to induce a high IL-10 production even in naïve cells. Our results suggest that the protection afforded by a vaccine against PRRSV cannot be forecasted only by a global view of the genetic similarity between the strains but, maybe, can be forecasted by the time passed after the vaccination and the inherent immune properties of each strain.In summary, our studies show that the IR of the piglets after the infection with a wild-type strain is similar to the IR developed after the immunization with attenuated strains, both in European and American genotypes, in spite of the genetic diversity. The second study proves that the frequency of PRRSV-specific IFN-gamma-SC plays a significant role in the protection of vaccinated pigs against a PRRSV infection.

El objetivo general de este trabajo fue estudiar la calidad de espermatozoides procedentes de epidídimo de caballo refrigerado (4ºC) durante varios días (hasta 96 horas) antes y después de la crioconservación. En la primera experiencia se estudió el efecto del tiempo de conservación del epidídimo, refrigerado a 4ºC hasta 96 horas, sobre la cantidad y calidad de los espermatozoides antes y después de la congelación. Para ello analizamos el volumen, la concentración, la viabilidad y la condensación de la cromatina en espermatozoides procedentes de epidídimo conservados a 4ºC durante 0, 24, 48, 72 y 96 horas. Además, se analizó la viabilidad y condensación de la cromatina de los espermatozoides a los 30 minutos de haber sido diluidos en el medio de congelación. Por último, de los espermatozoides congelados-descongeladas se evaluó: la viabilidad, la condensación de la cromatina, la integridad acrosomal, los ROS, la fosforilación de tirosina bajo condiciones capacitantes y la formación de pronúcleos tras la fecundación in vitro (FIV) y tras la inyección intracitoplasmática (ICSI) en un sistema heterólogo con ovocitos bovinos. Los resultados mostraron que el volumen medio (720±159 µl) y la concentración espermática (6’5±0’4 x 109 espermatozoides/ml) no se vieron modificadas a lo largo del tiempo. La viabilidad espermática no mostró descenso hasta transcurrido 72 h. En relación a la condensación de la cromatina no hubo diferencias entre los grupos experimentales. Al diluir los espermatozoides en el medio de congelación observamos un descenso en la viabilidad a partir de las 48 horas, una hipercondensación de cromatina en todos los grupos. Por último, al analizar los espermatozoides descongelados, observamos que la viabilidad, condensación de la cromatina, integridad acrosomal, la viabilidad y la generación de ROS tampoco se vio afectada por el tiempo de conservación. Además, se estudio la fosforilación de tirosina de proteínas de los espermatozoides descongelados tras ser incubados en un medio capacitante y en todos los tiempos de conservación estudiados se produjo fosforilación de tirosina pero no hubo diferencias entre ellos. En cuanto a la capacidad fecundante observamos que los espermatozoides procedentes de todos los grupos experimentales eran capaces de activar a los ovocitos y formar pronúcleos (masculino y femenino). La segunda experiencia se planteó para realizar un estudio sobre la incubación de los espermatozoides de epidídimo durante 30 minutos en plasma seminal como fase previa a la criopreservación. Los resultados obtenidos en cuanto a viabilidad posdescongelación fueron muy variables ya que ésta se incrementaba o disminuía dependiendo del macho del que procedía el plasma seminal. En cuanto a los parámetros condensación de la cromatina, integridad del acrosmal y generación de ROS, no se vieron afectados ni por la incubación con el plasma seminal ni por el animal del que procedía dicho plasma. En la tercera experiencia analizamos la composición del plasma seminal de los tres machos utilizados: los niveles de antioxidantes, concentración lipídica y concentración proteica. Los resultados mostraron que el plasma que mejoraba la viabilidad espermática tras la descongelación era el que presentaba mayor concentración de antioxidantes, mayor cantidad de ácidos grasos polinsaturados y mayor cantidad de proteína. Además se analizó la composición proteica del plasma seminal, mediante la técnica de 2D-DIGE, de los tres machos. Fueron identificados 34 spots en total y se identificaron aquellas proteínas que diferían entre ellos (dependiendo de su punto isoeléctrico y peso molecular). Se observó una gran variabilidad entre los tres animales. Podemos concluir que se mantiene la calidad de los espermatozoides procedentes de epidídimo conservados a 4ºC hasta 96 horas tras la descongelación y, dependiendo del animal, la incubación de los espermatozoides en el plasma seminal puede ser beneficioso durante el proceso de la crioconservación. / The main goal of this work was to study the effect of sperm storage, at 4ºC up to 96 h, in the epididymides obtained from castrated horses and its effect on different functional sperm parameters. Our first experiment were designed to study the effect of (1) sperm storage on viability and chromatin condensation; (2) pre-incubation of recovered epididymal sperm in the freezing extender, prior cryopreservation, on viability and chromatin condensation; (3) freezing–thawing on viability, chromatin condensation, ROS generation, protein tyrosine phosphorylation and heterologous fertilization rate (ICSI and IVF using bovine oocytes) of sperm recovered from the epididymis up to 96 h post castration. The average volume (720±159 µl and the concentration (6’5±0’4× 109 spermatozoa/ml) of sperm recovered from the epididymis were not affected by storage. Sperm viability after refrigeration at 4ºC for up to 72 h was similar. The effect of sperm dilution in the freezing media showed similar values up to 48 h, while viability was preserved up to 72 h. Cryopreserved spermatozoa show similar viability between different storage times. Chromatin condensation was not affected by storage time; however, incubation for 30 min in freezing medium and freezing–thawing process induced an increase in the chromatin condensation. ROS generation was not affected by storage up to 96 h. Epididymal storage did not affect sperm protein tyrosine phosphorylation patterns; although the pattern of phosphorylation changed to strong staining of the equatorial segment when the sperm where capacitated in sperm–TALP. Finally, successful and similar pronuclear formation (analyzed by ICSI) and in vitro penetration (evaluated with bovine zone free oocyte) was observed using cryopreserved sperm obtained from prolong epididymal storage at 4ºC. In conclusion, cryopreservation of epididymal stallion sperm stored for up to 72 h in the epididymis at 4ºC, maintain both viability and ability to fertilize in vitro. In the second experiment we studied the effect of sperm incubation with seminal plasma before cryopreservation on sperm viability, chromatin condensation, acrosomal integrity and ROS. Results showed that these parameters were not affected by sperm incubation with seminal plasma. However, we observed that viability was affected by male because it increased or decreased depending on plasma donor. The parameters chromatin condensation, acrosomal integrity and ROS generation, were not affected by either seminal plasma or by the animal. The third experiment was designed to evaluate seminal plasma composition, particularly antioxidant level, lipid and protein concentration. The seminal plasma which had the largest quantity antioxidant level, lipid and protein was the one which improved sperm viability after thawing. The seminal plasma composition was different depending on the animal. In addition, using the technique of 2D-DIGE, protein composition from the seminal plasma was analyzed. We identified which proteins were different between them (depending on their isoelectric point and their molecular weight). A total of 34 spot were identified and were different between animal. In conclusion, equine spermatozoa stored in the epididymis for up to 96 h at 4ºC can be successfully cryopreserved and maintain their fertilization capacity after thawing. Also, sperm incubation in seminal plasma would improve sperm quality depending on animal.

Tesis por compendio de publicaciones / BJETIVOS 1. Evaluar de forma detallada la morfología del intestino delgado en el perro y su relación con las condiciones de seguridad necesarias para la aplicación de la EDB (artículo 1). 2. Contribuir a la caracterización de la histología normal del intestino del perro mediante la cuantificación sistemática del grosor de sus túnicas (artículo 2). 3. Evaluar la eficacia y seguridad de la técnica de EDB en el perro tanto vía oral (artículo 3) como vía anal (artículo 4). METODOLOGÍA El diseño de la tesis se fundamenta en 2 fases experimentales, la primera en cadáveres de perro, y la segunda in vivo. Un total de 55 cadáveres de perro fueron empleados para el estudio anatómico/morfométrico del intestino delgado (objetivo 1, artículo 1). De esos 55 animales, 41 también fueron utilizados para el estudio histológico/morfométrico del intestino delgado (objetivo 2, artículo 2). Para la fase experimental in vivo, se emplearon un total de 21 perros sin historial de enfermedad digestiva. Las exploraciones enteroscópicas se realizaron con un enteroscopio terapéutico de doble balón (EN-450T5, Fujinón®) tanto por vía oral (objetivo 3, artículo 3), como anal (objetivo 4, artículo 4). Los dos balones del equipo son inflados y desinflados alternativamente para permitir el progreso del endoscopio (maniobra de empuje) o plegamiento del intestino detrás de los balones (maniobra de rectificación). CONCLUSIONES 1. El estudio anatómico del intestino delgado ha permitido validar la especie canina como adecuada para la EDB siempre que se respeten las posibles limitaciones impuestas por el diámetro del lumen intestinal en animales de pequeño tamaño. La longitud del antebrazo fue el parámetro corporal con mayor asociación con el diámetro del intestino, y por ende el mejor estimador del tamaño mínimo requerido para la EDB en el perro. 2. Los resultados obtenidos sobre el rango de grosor normal de las diferentes túnicas a lo largo de todo el intestino delgado del perro constituyen la primera referencia publicada de estas características, con lo que ello puede suponer para el diagnóstico de patologías del intestino delgado a partir de de biopsias endoscópicas, ultrasonidos, muestras obtenidas por laparoscopia o postmortem. El sexo debe ser tenido en cuenta como fuente de variación del grosor de las túnicas intestinales. 3. Se ha demostrado que la EDB tanto por vía oral como anal es factible y segura en la especie canina. Los resultados aportados sobre la dinámica de exploración son importantes pues aportan valores de referencia para el empleo futuro de la EDB con fines diagnósticos o de tratamiento de enfermedades en porciones profundas del intestino delgado. 4. La exploración completa del intestino delgado del perro mediante EDB no ha sido posible ni por vía oral ni anal. Sin embargo, dado el interés que ello puede tener en el diagnóstico de algunas enfermedades del intestino delgado, serían necesarios nuevos estudios en los que se plantee la combinación de ambas vías. / OBJETIVES 1. To study in detail the morphology of the small intestine in the dog so as to evaluate whether it accomplishes the security conditions required for the double balloon enteroscopy. 2. To contribute to characterize the normal histology of the dog´s small intestine by quantifying the thickness of its layers. 3. To characterize the efficiency and safety of the double balloon enteroscopy in the dog by both the oral and anal approaches. METHODS This work was carried out in two experimental phases. The first one in cadavers and the second in vivo. 55 dog cadavers were used for anatomical (morphometric) study (objective 1, article 1), while 41 of them were used for histological (morphometric) study of the small intestine (objective 2, article 2). For the in vivo experimental phase (DBE), 21 dogs without history of digestive diseases were used. DBE were carried out with a therapeutic enteroscope (EN-450T5, Fujinon®) either by the oral (objective 3, article 3) and the anal approaches (objective 4, article 4). Two balloons are inflated and deflated in an alternating sequence to allow the endoscope to progress (pushing phase) or fold the explored intestine behind the balloons (pulling phase). CONCLUSIONS 1. Validation of the dog as a candidate for DBE has been obtained after a thorough anatomical study of the small intestine. However, when planning DBE caution should be taken in small dogs due to potential limitations imposed by the width of the intestine. The length of the forearm showed the highest association with the diameter of the intestine so that it is the best body parameter to define the minimum body size necessary for a secure DBE in the dog. 2. The results for the thicknesses of the different layers of the small intestine given in this study are a novelty and might serve to assist the diagnosis of enteropathies by endoscopic biopsies, ultrasounds, laparoscopy and postmortem sampling. The sex should be considered as a major source of variation in intestinal thickness in the dog. 3. It has been demonstrated that both the oral and anal DBE is feasible and safe in the dog. The results for the exploration dynamics of the procedure might serve as reference values for future diagnosis and treatment of diseases in deep portions of the small intestine. 4. The complete exploration of the small intestine by DBE has not been achieved yet in the dog. Further studies with a combination of the oral and anal approaches might facilitate this goal, which could be useful for a accurate diagnosis of some enteropathies.

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Amb la fi de comprendre la dinàmica de la infecció pel VIA en aquestes tres espècies aviàries no convencionals, així com la funció epidemiològica que exercirien en un brot interespècie d’IA per tal de definir millors estratègies de vigilància, es van realitzar tres infeccions experimentals, les quals s’han descrit en aquesta tesi. La patogènia de la infecció tant pel VIAAP com pel VIABP es va determinar per a la perdiu roja (Estudi I), la guatlla europea (Estudi II) i el falcó híbrid sacre‐grifó (Estudi III), posant especial èmfasi en la descripció de la malaltia clínica, les lesions macroscòpiques i microscòpiques, i la presència de l’antigen víric als teixits. A més, en aquest treball s’ha descrit el patró d’excreció vírica de cada espècie aviària i cada VIA, i s’ha avaluat la probabilitat d’una eficaç transmissió vírica entre animals. L’Estudi II també representa un estudi comparatiu de la dinàmica d’infecció en dos subtipus diferents de VIABP (H7 i H5). En el cas dels Estudis I i II, es va prestar especial atenció en les plomes com a possible origen de propagació del VIA. A més, a l’Estudi II es va investigar l’aigua com a possible ruta de transmissió. Finalment, a l’Estudi III es va reproduir amb eficiència la infecció natural pel VIA en falcons (és a dir, mitjançant la ingestió de preses infectades) i es va dilucidar per primera vegada en aquesta espècie el patró dels receptors del virus de la grip. A l’Estudi I, les perdius roges infectades pel VIAAP van presentar els primers signes clínics a 3 dies post‐inoculació (dpi); a partir de 4 dpi van començar a morir i a 8 dpi ja no restava cap espècimen viu. Per mitjà d’immunohistoquímica (IHQ) i de PCR quantitativa a temps real (PCRq‐TR), es va confirmar la presència de l’antigen víric en teixits i l’excreció del virus, respectivament, tant en perdius inoculades amb el VIAAP com contactes. No es van observar ni signes clínics ni troballes histopatològiques a les perdius infectades pel VIABP. A més, a algunes perdius inoculades amb el VIABP, només es va detectar l’excreció del virus a curt termini, juntament amb seroconversió. L’Estudi I va posar de manifest que la perdiu roja presenta una elevada susceptibilitat a la soca del VIAAP H7N1 que es va utilitzar, la qual va causar greu malaltia clínica, alta mortalitat i excreció vírica abundant. Per consegüent, aquesta au podria contribuir a la propagació d’un possible brot local del virus. En canvi, els resultats que es van observar pel VIABP H7N9 indicarien que la perdiu roja no és un reservori d’aquest virus. A l’Estudi II, es van observar greus signes neurològics i una taxa de mortalitat del 67 % (H7N1/AP) i del 92 % (H5N1/AP) a les guatlles europees infectades pel VIAAP. Tot i que van aparèixer troballes histopatològiques en ambdós grups infectats pel VIAAP, les guatlles infectades amb VIAAP H5N1 van mostrar una distribució d’antigen víric més àmplia i lesions microscòpiques més intenses. No es va observar afectació clínica o patològica a les guatlles infectades pel VIABP. Pels tres VIA investigats es va demostrar una excreció vírica consistent i de llarg termini i una transmissió efectiva a les guatlles susceptibles. L’aigua va sorgir com a possible ruta de transmissió, i les plomes com a possible font de propagació de VIAAP. L’Estudi II posa en relleu que la guatlla europea pot tenir una funció important en l’epidemiologia de la IA, la qual cosa fa ressaltar la necessitat de conèixer amb més profunditat la seva possible funció com a hoste intermediari en el cas dels virus recombinants d’aus/mamífers. A l’Estudi III, els falcons van mostrar una dinàmica d’infecció similar tot i les diferents rutes d’exposició (és a dir, ruta nasocoanal o a partir de la ingestió de preses infectades), fet que va demostrar l’efectivitat de la ruta d’alimentació in vivo. Els falcons infectats pel VIAAP H5N1 mostraven greus signes neurològics aguts i van morir, o van ser sacrificats, entre 5 i 7 dpi. Mitjançant IHQ i RRT‐PCR es va confirmar la presència de l’antigen víric a diferents teixits. Aquest antigen s’associava normalment a lesions microscòpiques, sobretot a l’encèfal. No es van observar ni signes clínics ni lesions histopatològiques a cap dels falcons infectats pel VIABP H7N2, encara que tots els espècimens havien seroconvertit a 11 dpi. Es va detectar forta presència de receptors aviaris al tracte respiratori superior dels falcons, en concordança amb l’excreció vírica detectada per RRT‐PCR tant als falcons infectats per VIABP com per VIABP. L’Estudi III mostra que falcó híbrid sacre‐grifó presenta elevada susceptibilitat a la infecció pel VIAAP H5N1, tal com s’havia observat prèviament, i que podria jugar un paper rellevant en la propagació tant de VIAAP com de VIABP. Per primera vegada en el cas dels rapinyaries, es va reproduir amb èxit la infecció natural a partir de la ingestió de preses infectades. L’ús d’aus de presa a la falconeria i a centres de recuperació de fauna podria posar en risc rapinyaires de gran valor i humans i, per tant, seria convenient realitzar un seguiment intensiu d’aquesta pràctica. La present tesi posa en relleu la importància d’estudiar la susceptibilitat, la dinàmica d’infecció i la probabilitat de transmissió del VIA en hostes aviaris de la interfície domèstic‐salvatge. Adquirir aquest coneixement és vital per realitzar tasques de vigilància eficaces, desenvolupar mesures preventives adequades i gestionar amb èxit els brots d’IA quan es veuen afectades diferents espècies aviàries. / Avian influenza (AI) has become one of the most important challenges that ever emerged from animal reservoirs. The constant outbreaks detected worldwide in domestic and wild bird species are of concern to the economics of the poultry industry, wildlife conservation, and animal and public health. Susceptibility to AI viruses (AIVs) varies deeply among avian species, as well as their possible role as sentinels, intermediate hosts or reservoirs. To date, several experimental studies and natural infections have assessed the susceptibility of numerous major and minor avian species to diverse highly (HPAIV) and low (LPAIV) pathogenic AIVs. Gallinaceous poultry are considered to be highly susceptible, whereas waterfowl have long been recognized as natural reservoirs. However, scarce information concerning the infection dynamics of AIV in the red‐legged partridge (Alectoris rufa), European quail (Coturnix c. coturnix), and gyr‐saker hybrid falcon (Falco rusticolus x F. cherrug) exist so far. Such non‐conventional avian species may be of great interest in particular geographical regions, including the Iberian Peninsula. These species not only belong to the autochthonous wildlife, but they are also raised (normally within extensive farming systems) for various human benefits, which leads to close contact with both humans and local wildlife. With the aim to understand the dynamics of AIV infection in these three non‐conventional avian species, and their epidemiological role in an interspecies AI outbreak to better define surveillance strategies, three experimental infections were undertaken which have been presented in this dissertation. The pathogenesis of the infection with both LPAIV and HPAIV was determined in the red‐legged partridge (Study I), European quail (Study II), and gyr‐saker hybrid falcon (Study III), with special emphasis on describing the clinical disease, gross and microscopic lesions, together with the presence of viral antigen in tissues. In addition, viral shedding pattern for each avian species and each AIV was defined, and the likelihood of effective viral transmission among birds was assessed. Study II also represents a comparative study of infection dynamics of two different HPAIV subtypes (H7 and H5). In Studies I and II, special attention was paid on feathers as a potential origin of AIV dissemination. Besides, in Study II drinking water was investigated as for being a possible transmission route. Finally, in Study III, the natural AIV infection route in falcons (i.e., by ingestion of infected prey) was efficiently reproduced, and the influenza virus receptors’ pattern in this species was elucidated for the first time. In Study I, HPAIV‐infected red‐legged partridges displayed the first clinical signs at 3 days post‐inoculation (dpi), and mortality started at 4 dpi, reaching 100% at 8 dpi. The presence of viral antigen in tissues and viral shedding were confirmed by immunohistochemistry (IHC) and quantitative real time RT‐PCR (qRRT‐PCR), respectively, in both HPAIV‐inoculated and ‐contact partridges. Neither clinical signs nor histopathological findings were observed in LPAIV‐infected partridges. In addition, only short‐term viral shedding together with seroconversion was detected in some LPAIV‐inoculated partridges. Study I demonstrates that the red‐legged partridge is highly susceptible to the H7N1 HPAIV strain used, causing severe disease, mortality, and abundant viral shedding, and thus, contributing to the spread of a potential local outbreak of this virus. In contrast, our results concerning H7N9 LPAIV suggest that the red‐legged partridge is not a reservoir species for this virus. In Study II, severe neurological signs and mortality rates of 67% (H7N1/HP) and 92% (H5N1/HP) were observed in HPAIV‐infected European quail. Although histopathological findings were present in both HPAIV‐infected groups, H5N1/HP‐quail displayed a broader viral antigen distribution and extent of microscopic lesions. Neither clinical nor pathological involvement was observed in LPAIV‐infected quail. Consistent long‐term viral shedding and effective transmission to naïve quail was demonstrated for the three studied AIVs. Drinking water arose as a possible transmission route and feathers as a potential origin of HPAIV dissemination. Study II demonstrates that European quail may play a major role in AI epidemiology, highlighting the need to further understand its putative role as an intermediate host for avian/mammalian reassortant viruses. In Study III, falcons exhibited similar infection dynamics regardless the different routes of exposure (i.e., nasochoanal route or by ingestion of infected prey), demonstrating the effectiveness of in vivo feeding route. H5N1/HP‐infected falcons died, or were euthanized, between 5–7 dpi after showing acute severe neurological signs. Presence of viral antigen in several tissues was confirmed by IHC and RRT‐PCR, which was generally associated with significant microscopical lesions, mostly in the brain. Neither clinical signs, nor histopathological findings were observed in any of the H7N2/LP­infected falcons, although all of them had seroconverted by 11 dpi. Avian receptors were strongly present in the upper respiratory tract of the falcons, in accordance with the consistent oral viral shedding detected by RRT‐PCR in both H5N1/HP‐and H7N2/LP‐infected falcons. Study III demonstrates that gyr‐saker hybrid falcons are highly susceptible to H5N1/HP virus infection, as previously observed, and that they may play a major role in the spreading of both HPAIV and LPAIV. For the first time in raptors, natural infection by feeding on infected prey was successfully reproduced. The use of avian prey species in falconry husbandry and wildlife rehabilitation facilities could put valuable birds of prey and humans at risk and, therefore, this practice should be closely monitored. The present dissertation highlights the importance of studying the susceptibility, infection dynamics, and transmission likelihood of AIVs in host avian species at the domestic‐wild interface. Such knowledge is crucial to effectively perform surveillance efforts, develop appropriate preventive measures, and successfully manage AI outbreaks when different avian species are involved. La influença aviària (IA) s’ha convertit en un dels reptes més importants que mai hagi sorgit del reservori animal. Els constants brots que s’han detectat arreu del món en aus domèstiques i aus salvatges afecten en gran mesura a l’economia de la indústria avícola, a la conservació de les aus salvatges i a la sanitat animal i pública. El grau de susceptibilitat als virus d’IA (VIA) és extremadament diferent entre les espècies aviàries, igual que succeeix amb la seva possible funció com a sentinelles, hostes intermediaris o reservoris. Fins ara, diversos estudis experimentals i infeccions naturals han avaluat la susceptibilitat de nombroses espècies aviàries menors i majors a diferents VIA d’alta patogenicitat (VIAAP) o de baixa patogenicitat (VIABP). Es considera que els gal∙liformes són altament susceptibles, mentre que les aus aquàtiques es consideren reservoris naturals. Tanmateix, existeix molt poca informació sobre la dinàmica d’infecció de la IA en la perdiu roja (Alectoris rufa), en la guatlla europea (Coturnix c. coturnix) i en el falcó híbrid sacre‐grifó (Falco rusticolus x F. cherrug). Aquestes espècies aviàries no convencionals poden suscitar un gran interès a regions geogràfiques determinades, com ara la península Ibèrica. Les espècies esmentades no només pertanyen a la fauna autòctona, sinó que també es crien (normalment en sistemes agrícoles extensius) en benefici dels humans, la qual cosa comporta un estret contacte tant amb humans com amb la fauna local.