Le plasma récupéré des dons de sang est utilisé pour produire annuellement plusieurs milliers de kg de préparations thérapeutiques d'immunoglobulines pour injection intraveineuse (IglV) qui sont utilisées pour le traitement de patients souffrant d'immunodéficiences primaires ou secondaires. Depuis quelques années, de très fortes doses d'IglV sont également utilisées pour traiter un nombre croissant de maladies autoimmunes, augmentant grandement les risques de pénurie de ce produit pour lequel il n'existe à l'heure actuelle aucun substitut. Il a été rapporté que le traitement in vitro des lymphocytes B humains aux IgPV induit une baisse de leur prolifération ainsi qu'une augmentation de la sécrétion d'IgG. Mes travaux de thèse ont porté sur l'étude des mécanismes par lesquels les IglV agissent sur les lymphocytes B. Dans un premier temps, nous avons utilisé une approche d'immunoprecipitation suivie d'analyses par spectrométrie de masse afin d'identifier les molécules ciblées par les IgPV à la surface des lymphocytes B. Comme prévu, nous avons identifié plusieurs protéines membranaires ou associées à la membrane plasmique telles que le CD91, les molécules du CMH I et II ainsi que les prohibitines 1 et 2. Cependant, des protéines strictement intracellulaires ont aussi été identifiées, telles que l'endoplasmine et le LYST (Lysosomal-trafficking regulator). Ces résultats nous ont permis de démontrer que les IglV étaient internalisées de manière spécifique et spontanée par les lymphocytes B activés in vitro et par les cellules myéloïdes dans le sang total. L'identification de molécules impliquées dans le processus de la présentation antigénique, comme les complexes majeurs d'histocompatibilité (CMH) I et II, nous a conduit à émettre l'hypothèse que les IgPV pouvaient interférer avec ce processus. À l'aide d'un système in vitro de présentation antigénique dépendant du CMH H, nous avons démontré que les IglV inhibaient la présentation d'antigène dépendante et indépendante du récepteur antigénique (BCR). Il a aussi pu être établi que cet effet n'était pas dû à une modulation du niveau de CMH II exprimé à la surface des lymphocytes B ni dépendant du récepteur inhibiteur pour la partie constante des IgG, le FcyRIIb. Nous avons donc proposé un mécanisme dépendant de l'interaction avec des protéines intracellulaires impliquées dans le processus de la présentation antigénique afin d'expliquer cet effet des IglV. Par la suite, à l'aide d'une lignée cellulaire déficiente pour l'expression du CD91, il nous a été possible de démontrer l'implication de ce récepteur dans l'internalisation spontanée des IglV. De plus, nous avons observé que le traitement aux IglV induit une phosphorylation de la partie intracellulaire du CD91 sur la tyrosine 4507. Nos résultats suggèrent aussi que le CD91 pourrait permettre la transcytose des IglV à travers la barrière hémato-encéphalique. En résumé, mes travaux de thèse ont identifié le CD91 comme étant impliqué dans le processus d'internalisation spontanée des IglV et suggèrent que cette internalisation est impliquée dans un nouvel effet des IglV sur les lymphocytes B : l'inhibition de la présentation antigénique.

Les anticorps, piliers de la réponse immunitaire humorale, sont fréquemment utilisés pour traiter certaines immunodéficiences et maladies autoimmunes. Des préparations d'anticorps spécifiques à un antigène sont également administrées à des individus, suite à un contact avec un pathogène. Cependant, nous sommes limités dans leur production ainsi que dans la variété des spécificités antigéniques puisque leur préparation dépend de la disponibilité d'individus hyperimmunisés. Ce projet a donc pour objectif de produire des anticorps spécifiques in vitro en cultivant les lymphocytes B humains isolés du sang de participants. En stimulant les lymphocytes B humains avec du LPS d'Escherichia coli, la sécrétion d'anticorps spécifiques et la sécrétion de cytokines ont augmenté. Nous pensons que ce mécanisme accélère la réponse secondaire lors d'une infection bactérienne. Nous avons également tenté de stimuler la prolifération des lymphocytes B humains en surexprimant le gène AgT, un gène stimulant la croissance cellulaire chez les cellules COS7. Cependant, nous n'avons pas été en mesure d'obtenir obtenir un effet biologique.

Thesis (doctoral)--Lund University, 1998. / Added t.p. with thesis statement inserted. Includes bibliographical references.

Zhu, Lin. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2007. / Includes bibliographical references (leaves 103-118). / Abstracts in English and Chinese. / Contents --- p.I / List of Abbreviations --- p.IV / List of Tables and Figures --- p.V / Chapter Chapter One: --- Introduction --- p.1 / Chapter 1.1 --- Viral Hepatitis --- p.2 / Chapter 1.2 --- Global Epidemiology of HBV --- p.3 / Chapter 1.3 --- Modes of Transmission --- p.4 / Chapter 1.4 --- Diagnostic Tests --- p.5 / Chapter 1.4.1 --- HBeAg and Anti-HBe --- p.7 / Chapter 1.4.2 --- Serum Enzymes --- p.8 / Chapter 1.4.3 --- HBV DNA Assays --- p.9 / Chapter 1.4.3.1 --- HBV DNA Assays --- p.9 / Chapter 1.4.3.2 --- Clinical Applications of DNA Assays --- p.10 / Chapter 1.4.4 --- Histology --- p.13 / Chapter 1.5 --- Natural Course of Chronic Hepatitis infection --- p.18 / Chapter 1.5.1 --- Phases of chronic hepatitis B --- p.18 / Chapter 1.5.2 --- HBeAg-negative chronic hepatitis B --- p.21 / Chapter 1.6 --- Molecular biology of HBV --- p.23 / Chapter 1.6.1 --- Overview --- p.23 / Chapter 1.6.2 --- Genomic structure and organization --- p.24 / Chapter 1.6.2.1 --- Surface ORF --- p.24 / Chapter 1.6.2.2 --- Precore/Core ORF --- p.25 / Chapter 1.6.2.3 --- Polymerase ORF --- p.25 / Chapter 1.6.2.4 --- X ORF --- p.26 / Chapter 1.7 --- Genetic Variation of HBV --- p.31 / Chapter 1.7.1 --- HBV genotypes --- p.31 / Chapter 1.7.2 --- Predominant genotypes and their subgroups in Asia --- p.33 / Chapter 1.7.3 --- HBV mutations --- p.36 / Chapter 1.7.3.1 --- Precore mutations --- p.37 / Chapter 1.7.3.2 --- Core promoter mutations --- p.38 / Chapter 1.7.3.3 --- Other Mutations associated with clinical outcome --- p.40 / Chapter Chapter Two: --- Methodology --- p.44 / Chapter 2.1 --- Aims and Hypothesis --- p.45 / Chapter 2.1.1 --- Aims --- p.46 / Chapter 2.1.2 --- Hypothesis --- p.47 / Chapter 2.2 --- Patient Recruitment --- p.48 / Chapter 2.3 --- Laboratory Assays --- p.49 / Chapter 2.3.1 --- Preparation of serum HBV DNA --- p.49 / Chapter 2.3.2 --- Quantification of serum HBV DNA --- p.51 / Chapter 2.4 --- Full-genome Amplification of HBV DNA --- p.53 / Chapter 2.5 --- Full-genome Sequencing of HBV DNA --- p.55 / Chapter 2.6 --- Assembly of HBV Full-genome Sequence --- p.58 / Chapter 2.7 --- Phylogenetic Analysis --- p.59 / Chapter 2.7.1 --- Construction of phylogenetic tree --- p.59 / Chapter 2.7.2 --- Genotype and subgenotype determination --- p.60 / Chapter 2.8 --- HBV Mutations --- p.62 / Chapter 2.9 --- Info-gain program --- p.64 / Chapter 2.10 --- Statistical Analysis --- p.65 / Chapter Chapter Three: --- Results --- p.67 / Chapter 3.1 --- Patient Information --- p.68 / Chapter 3.2 --- Phylogenetic Analysis --- p.69 / Chapter 3.3 --- HBV genotypes/subgenotypes --- p.76 / Chapter 3.4 --- “Hot-spo´tح HBV Mutants --- p.79 / Chapter 3.5 --- HBV Mutation Associated with Liver Fibrosis --- p.82 / Chapter 3.5.1 --- Mutant selection --- p.82 / Chapter 3.5.2 --- Clinical significance of novel mutants --- p.84 / Chapter Chapter Four: --- Discussion --- p.88 / Chapter 4.1 --- Full-genome Sequencing Strategy --- p.89 / Chapter 4.2 --- HBV genotypes/subgenotypes Distribution and Disease Activity --- p.90 / Chapter 4.2.1 --- HBV genotypes/subgenotypes distribution --- p.90 / Chapter 4.2.2 --- Clinical significance of genotypes/subgenotypes --- p.91 / Chapter 4.3 --- HBV Hotspot Mutants and Disease Activity --- p.93 / Chapter 4.4 --- HBV Novel Mutants --- p.96 / Chapter 4.5 --- Limitation of the Study and Future Work --- p.97 / Chapter 4.5.1 --- Limitation --- p.97 / Chapter 4.5.2 --- Future Direction --- p.98 / Chapter Chapter Five: --- Conclusions --- p.99 / References --- p.102

Der induzierbare Kostimulator ICOS ist ein zu CD28 strukturell und funktionell verwandtes Molekül, das eine wichtige regulatorische Rolle bei der T-Zelleffektorfunktion spielt. Eine ICOS-Defizienz beim Mensch manifestiert sich in einer schweren Störung des humoralen Immunsystems. Eine murine ICOS-Defizienz führt ebenfalls zu einer Beeinträchtigung der T-Zell-abhängigen humoralen Immunantwort, bei der kleinere oder komplett fehlende Keimzentren zu beobachten sind. Vielfältige in vitro und in vivo Studien führten diese Phänomene auf die beeinträchtigte Regulation von Kommunikationsmolekülen der Zelloberfläche und der Zytokinexpression durch ICOS-defiziente T-Zellen zurück. Ein Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von ICOS KO Mäusen den Einfluss von ICOS auf die B-Zellentwicklung genauer zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass ICOS erst in der späten Phase der B-Zellentwicklung eine Rolle spielt, da der Interaktionspartner von ICOS erst auf transitionellen B-Zellen der Milz exprimiert wird. Durch die Etablierung eines in vivo adoptiven T-B Transfermodells konnte die Rolle von ICOS erstmalig bei der T-B Kooperation in den frühen Phasen der Immunantwort auf der Ebene Antigen-spezifischer T- und B-Zellen aufgeklärt werden. Dabei konnte beobachtet werden, dass eine ICOS-Defizienz einen dramatischen Einfluss auf die B-Zellexpansion und B-Zellproliferation hat. Zum ersten Mal konnte in vivo gezeigt werden, dass ICOS bei der T-B Kooperation eine entscheidende Rolle bei der Regulation diverser Oberflächenmarker der B-Zellen spielt, wodurch die B-Zellaktivierung, B-Zellproliferation und B-Zelldifferenzierung bei der Keimzentrums- und Plasmazellreaktion beeinflusst werden. Histologische Analysen zeigten, dass bei einer ICOS-Defizienz follikuläre T-Helferzellen nicht in die Keimzentrumsumgebung einwandern und daher keine T-Zellhilfe für die B-Zellen anbieten können. Dadurch kann die Keimzentrumsreaktion nicht weiter aufrechterhalten werden und eine Ausbildung von kleineren Keimzentren ist die Folge. Weiterhin konnte beobachtet werden, dass eine fehlende ICOS-Interaktion zwischen T- und B-Zellen zu einer Störung der Plasmazellgenerierung führt, wodurch auch die Mengen an messbaren Serumimmunglobulinen beeinflusst werden. Eine erhöhte Gabe von ICOS-defizienten T-Zellen kann diese Effekte nicht vollständig ausgleichen. Daher ist erkennbar, dass ICOS eine Vielzahl von zusätzlichen Faktoren beeinflusst, die für die ICOS-abhängigen B-Zelleffekte verantwortlich sind. / The inducible costimulator ICOS, structural and functional similar to CD28, plays an important regulatory role in T cell receptor function. The ICOS deficiency in humans is described as a severe dysfunction of the humoral immune response, resulting in dramatic reduced B cell numbers and impaired antibody response against pathogens. The murine ICOS-deficiency also leads to a disturbed T cell dependent immune response resulting in a reduced germinal center formation. Various in vitro and in vivo studies attributes this phenomenon to impaired upregulation of cell surface communication molecules and cytokine synthesis by ICOS-deficient T cells. In this work the investigations with ICOS KO mice should clarify the impact of ICOS in B cell development. As observed, ICOS can only play a role in the late phase B cell development, because the interaction partner is expressed on transitional B cells in the spleen. The establishment of an in vivo adoptive T-B transfer system could determine for the first time the role of ICOS in T-B cooperation in early immune response stages on antigen specific T and B cell levels. As shown, ICOS deficiency influences in a dramatic extend the B cell expansion and B cell proliferation. For the first time in vivo, we could demonstrate that ICOS plays a significant role by influencing the regulation of various B cell surface markers, which affects the B cell activation, B cell proliferation and B differentiation in germinal center or plasma cell reaction. Histological investigations revealed in the ICOS-deficiency that follicular T helper cells could not migrate into the germinal center microenvironment and therefore could not provide T cell help for B cells. As a result, the germinal center reaction could not maintained and therefore the formation of little germinal centers occurred. The missing interaction between T and B cells leads to a dysfunction in plasma cell generation and also influences the detectable amounts of serum immunglobulines. An administration of higher ICOS KO T cell numbers could not fully compensate these effects. Therefore, ICOS bias multitudes of additional factors, which are responsible for the ICOS dependent B cell effects.

In this thesis, novel corrections to B → X˦ and B → Xl+l- decays, where X is a pseudoscalar or vector meson, are presented. These are the chromomagnetic matrix element, weak annihilation in a general four-quark operator basis and a long-distance charm loop contribution. The calculation of the chromomagnetic matrix element completes the calculation of matrix elements for all relevant effective weak operators in B → V decays, removing an infrared divergence which previous computations had treated in a very approximate way. It also encounters an interesting technical obstacle not previously seen in sum rule calculations, which is likely to be encountered regularly in future once higher order loop diagrams are calculated. The potential for this term to contribute to the CP asymmetry in D → V˦ in the presence of new physics is discussed. The improved computation of weak annihilation diagrams is applied to the analysis of isospin asymmetries in radiative and semi-leptonic B → (p;K(*)) decays, and the computation of long distance charm bubble terms is applied to produce an improved prediction for time-dependent CP asymmetries in various B → V decays.

Dissertation (PhD)--University of Stellenbosch, 2002. / ENGLISH ABSTRACT: Since the advent of recombinant DNA technology in the 1970s, various microbial hosts have been employed for the efficient high-level heterologous production of a variety of proteins, ranging from enzymes and reagents to therapeutics and vaccines. More recent microbial hosts to be employed for these purposes are filamentous fungi, and particularly the genus Aspergillus. Aspergilli have been associated with industrial processes for many years and are used in the production of antibiotics, enzymes, citric acid and Oriental foods and beverages, and thus strains such as Aspergillus niger and Aspergillus oryzae have been afforded GRAS (Generally Regarded 8s ~afe) status. They also secrete copious amounts of homologous and heterologous proteins and are able to perform post-translational modifications effectively. Various proteins of pharmaceutical interest have been successfully expressed in Aspergillus, but the potential of these fungi to produce heterologous viral proteins has not been explored extensively. In this study, we evaluated the potential of the filamentous fungi A. niger and Aspergillus awamori as alternative hosts for the heterologous production of hepatitis B viral proteins. Hepatitis B is a serious, potentially lethal liver disease that affects 2000 million people world-wide and has a high endemicity in Southern Africa. Currently there is no effective treatment for viral hepatitis and thus a mass vaccination strategy is the only solution to curb the spread of the disease. This kind of vaccination strategy requires a cheap, safe and effective vaccine and these objectives have been achieved in the development of recombinant subunit vaccines from yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha and Pichia pastoris that are commercially available. The hepatitis B virus envelope consists of a membrane fraction and three proteins, namely the major (S) protein (encoded by the S gene), the middle (M) protein (encoded by the preS2S gene) and the large (L) protein (encoded by the preS1preS2S gene). When produced in the above-mentioned yeasts, the S protein was shown to spontaneously assemble into pseudoviral particles devoid of viral DNA, which were then purified and used as vaccine. In the present study the Sand preS1preS2S genes from a local isolate of hepatitis B subtype adw2 were placed under transcriptional control of the constitutive Aspergillus nidulans glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gpdA) promoter and the inducible A. niger glucoamylase (glaA) promoter. The respective viral genes were also fused to the region encoding the catalytic domain of the highly expressed and secreted A. niger glucoamylase, which served as a carrier moiety to possibly facilitate viral protein secretion. The various gene constructs were subsequently transformed to laboratory strains of A. niger and A. awamori and numerous transformants were obtained. One A. niger transformant carrying the S gene under control of the gpdA promoter contained approximately 7 integrated copies of the expression cassette and produced hepatitis B pseudoviral particles intracellularly at levels of 0.4 mg/I culture. These levels are approximately ten-fold higher than those initially obtained from the yeast S.cerevisiae, which showed yields of 0.01 to 0.025 mg/I. None of the other transformants could be shown to produce recombinant S or L protein and no secretion of viral protein could be demonstrated. This could be attributed to numerous factors, including vector copy number, site of integration or proteolytic activity. The most important insight emerging from this work regarding secretion of heterologous viral protein was that the addition of a carrier protein hampered, rather than enhanced secretion of the viral envelope protein, due to the inherent properties of viral protein assembly. This work also serves as a "proof of principle", showing that Aspergillus is indeed a viable alternative host for the production of hepatitis B pseudoviral particles, and could be investigated further for its potential as host for the heterologous expression of other viral proteins. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Sedert die ontwikkeling van rekombinante DNA tegnologie in die sewentigerjare is verskeie mikroorganismes reeds gebruik vir die doeltreffende produksie van 'n verskeidenheid proteïne teen hoë vlakke; onder andere ensieme, reagense, terapeutiese middels en vaksiene. Onlangs is filamentagtige swamme, veral van die genus Aspergillus, ontwikkel vir heteroloë proteïenproduksie. Aspergilli word al vir baie jare in nywerheidsprosesse gebruik, onder andere in die vervaardiging van antibiotika, ensieme, sitroensuur en sekere Oosterse voedsel- en drankprodukte. As gevolg van hierdie jarelange gebruik van rasse soos Aspergillus niger en Aspergillus oryzae, word hulle algemeen aanvaar as veilig vir menslike gebruik. Hierdie swamme besit veral die vermoë om hoë vlakke van homoloë en heteroloë proteïene uit te skei en die na-translasiemodifisering van proteïene korrek uit te voer. Verskeie proteïene van farmaseutiese belang is al suksesvol in Aspergillus uitgedruk, maar die potensiaal van hierdie swamme om virale proteïene te vervaardig is nog nie deeglik ondersoek nie. Hierdie studie ondersoek die geskiktheid van die filamentagtige swamme A. niger en Aspergillus awamori om as alternatiewe gashere vir die heteroloë produksie van hepatitis B proteïene te dien. Hepatitis B is 'n ernstige en selfs dodelike lewersiekte. Omtrent 2000 miljoen mense wêreld-wyd is met die virus geïnfekteer en dit is veral endemies in Suiderlike Afrika. Daar is tans geen doeltreffende behandeling vir virale hepatitis en dus is wêreld-wye inentingsprogramme die enigste oplossing om die verspreiding van die siekte te bekamp. Hierdie inentingsstrategie vereis die beskikbaarheid van 'n bekostigbare, veilige en doeltreffende vaksien. Die rekombinante subeenheidvaksiene wat ontwikkel is deur van gashere soos Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha en Pichia pastoris gebruik te maak, voldoen aan hierdie vereistes en is kommersieel beskikbaar. Die omhulsel van die hepatitis B virus bestaan uit 'n membraangedeelte en drie proteïene, naamlik die hoofproteïen (S) (gekodeer deur die S-geen), die middelproteïen (M) (gekodeer deur die preS2S-geen) en die grootproteïen (L) (gekodeer deur die preS1preS2S-geen). Wanneer die S-proteïen in bo-genoemde giste uitgedruk word, vorm dit spontaan pseudovirale partikels wat nie virale DNA bevat nie. Hierdie partikels word dan gesuiwer en as vaksien gebruik. In hierdie studie is die S- en preS1preS2S-gene, vanaf 'n plaaslike isolaat van hepatitis B subtipe adw2, onder transkripsionele beheer van die konstitutiewe Aspergillus nidulans gliseraldehied-3-fosfaat-dehidrogenasepromoter (gpdA) en die induseerbare A. niger glukoamilasepromoter (glaA) geplaas. Die onderskeie virale gene is ook aan die koderende gedeelte vir die katalitiese domein van A. niger glukoamilase gelas om fusieproteïene te vorm. Glukoamilase word teen hoë vlakke deur Aspergillus vervaardig en uitgeskei en kan dus moontlik dien as draerproteïen om sekresie van die proteïne te bevorder. Transformasie van die geenkonstrukte na laboratoriumrasse van A. niger en A. awamori het verskeie transformante gelewer. Een A. niger transformant bevattende die S-geen onder transkripsionele beheer van die gpdA promoter het minstens sewe kopieë van die uitdrukkingskaset in sy genoom geïntegreer en het hepatitis B pseudovirale partikels intrasellulêr teen vlakke van 0.4 mg/I swamkultuur vervaardig. Hierdie vlakke is omtrent tienvoudig hoër as die vlakke van 0.01 - 0.025 mg/I wat S.cerevisiae oorspronklik opgelewer het. Nie een van die ander transformante het rekombinante S of L proteïene vervaardig nie en sekresie van virale proteïen kon nie getoon word nie. Hierdie verskynsel mag te wyte wees aan verskeie faktore insluitende vektor-kopiegetal, setel van integrasie en proteolitiese aktiwiteit. Die belangrikste insig uit hierdie studie aangaande sekresie van heteroloë virale proteïene is dat die koppeling van die virale omhulsel-proteïen aan 'n draerproteïen sekresie benadeel het, eerder as om dit te bevorder. Hierdie verskynsel is te wyte aan die inherente geneigdheid van virale omhulselproteïene om 'n kompleks te vorm. Die studie dien ook as "bewys van beginsel" dat Aspergillus wel 'n werkbare alternatiewe gasheer vir die produksie van hepatitis B pseudovirale partikels is, en dat dit verder ondersoek sou kon word as potensiële gasheer vir die heteroloë uitdrukking van ander virale proteïene.

published_or_final_version / Surgery / Master / Master of Philosophy

This study was conducted to investigate the impact of restaurant facilities, belonging to a B&B and leased to a professional restaurateur, upon the revenue of the B&B. This study assessed the physical demands placed on the B&B operator by an on-premises restaurant. Lack of sufficient data precluded proving the premise that an on-premises restaurant leased to a restaurateur would increase the income of the B&B without placing undue physical demands on the B&B operator. However, many contributing factors support the importance of a B&B having an on-premises restaurant that is leased to a professional restaurateur.

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