Orientador: Marcelo Menossi Teixeira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T15:57:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tavares_RafaelGarcia_M.pdf: 4032767 bytes, checksum: ffe11e896bea6da2737a9d3ce4dd94ff (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A cultura da cana-de-açúcar (Saccharum spp) está entre as mais importantes do Brasil, tendo o setor sucroalcooleiro grande importância econômica no país devido ao crescente consumo de álcool e açúcar. A fase de maturação no desenvolvimento da cana-de-açúcar é especialmente interessante, pois está diretamente relacionada com o teor de sacarose. O hormônio etileno está envolvido em muitos aspectos do ciclo de vida da planta, incluindo a maturação. Como primeira parte deste projeto, o objetivo foi avaliar a relação entre etileno e maturação de cana-de-açúcar pela caracterização da expressão dos genes que codificam as isoformas da enzima ACC sintase, responsável por uma das vias da biossíntese desse hormônio. Assim, dois genes (Scacs1 e Scacs2) que codificam para a enzima ACC sintase foram identificados no projeto SUCEST e caracterizados. Nossos resultados de localização subcelular confirmaram estudos anteriores sobre a localização citoplasmática das proteínas ACS. Todavia, nós identificamos por análise in silico a presença de um peptídeo sinal na região N-terminal da proteína ScACS2. Ensaios de duplo-híbrido com bibliotecas de cDNAs a partir de tecidos de folha +1 e entrenó 5, nos revelaram novas interações putativas com a proteína ScACS2, sendo uma delas, a proteína denominada sinaptotagmina envolvida no mecanismo de reparo da membrana celular. Ao contrário do que foi observado em Arabidopsis, nossos resultados de heterodimerização não identificaram uma interação entre as isoformas de cana-de-açúcar. Análise de expressão por PCR quantitativo em duas variedades contrastantes ao teor de sacarose, identificaram uma maior expressão nos entrenós madurados quando comparados aos entrenós jovens para os dois genes ACS. Em uma estudo in situ da expressão, o gene Scacs1 apresentou uma expressão nas células do parenquima e nas células da bainha do feixe vascular, entretanto, não mostrou expressão nos feixes vasculares. Por outro lado, o gene Scacs2 apresentou expressão constitutiva nos diferentes tipos celulares e, inclusive, nos feixes vasculares. Os resultados apresentados nesse trabalho, abrem novas perspectivas e perguntas para os diversos mecanismos fisiológicos e celulares realizados pelo hormônio etileno nas plantas. Todavia, uma prática comum antes da colheita da cana é a aplicação de precursores do hormônio etileno, como o etefon (ácido 2-cloroetil fosfônico) para acelerar o amadurecimento final das plantas, inibir o florescimento e consequentemente aumentar o teor de sacarose. Assim, a manipulação da biossíntese desse hormônio tem o potencial para aumentar a produtividade em cana. Desta forma, um segundo objetivo deste projeto foi desenvolver uma estratégia para promover o amadurecimento controlado da cana-de-açúcar no final da safra, usando o etanol em substituição aos análogos químicos do etileno. Para tal, foi avaliado o uso de um promotor ativado por etanol (sistema de expressão alc de Aspergillus nidulans) controlando a expressão do gene que codifica a ACC sintase, enzima chave na biossíntese de etileno. Nossos resultados foram condizentes com o esperado, mostrando claramente um aumento na produção do hormônio etileno quando plantas transgênicas de tabaco foram induzidas por spray foliar com 5% (v/v) de etanol. Esses resultados demonstram a possível utilização de ferramentas biotecnológicas no controle da expressão de genes envolvidos em características agrícolas interessantes, tais como na cultura de cana-de-açúcar. / Abstract: Sugarcane crop (Saccharum spp) is among the most important of Brazil, due to its economic importance in the country with the increasingly consume of its by-products such as the ethanol and sugar. Throughout development of the sugarcane, the maturation phase is especially interesting, whereas it is highly related to sucrose accumulate. The ethylene hormone is involved in several physiological processes of plants, including the maturation. As first part of this project, the goal was evaluated the correlation between ethylene hormone and sugarcane maturation through characterization of the genes expression encoded ACS enzymes, involved in biosynthesis pathway of this hormone. Thus, two genes (Scacs1 and Scacs2), which encoding the ACS enzyme, were identified in SUCEST project and characterized. Our results of subcellular localization confirmed previous studies regarding to cytoplasmic localization of ACS proteins. Nonetheless, we identify through in silico analyses the presence of a signal peptide in the N-terminal region of the ScACS2 protein. Yeast two-hybrid assay using cDNAs libraries from leaf +1 and internode 5 tissues, revealed putative interactions with the ScACS2 protein, being one of them, a protein called plant synaptotagmin involved in the mechanism of cell membrane repair. Different from Arabidopsis, our results about heterodimerization did not identify an interaction between sugarcane ACS isoenzymes. Expression analyses of quantitative PCR in two sugarcane varieties contrasting to Brix content presented a higher expression of ACS genes in mature internodes than young internodes. In situ analyses for Scacs1 gene showed an expression in parenchyma cells and bundles sheath, however, none expression was observed in vascular bundles. On the other hand, the Scacs2 gene presented an ubiquitous expression in the different cell types and, including in vascular bundles. Our results presented in this work, open further perspectives and issues about the underlying mechanisms by ethylene hormone in plants. Nevertheless, a common practice before harvest of sugarcane is the application of precursors of ethylene hormone, such as ethephon (2-chloroethyl- dioxido-oxophosphorane) to accelerate plants ripening, delay opening of the inflorescence and to increase sucrose accumulate. As a result, the manipulation of biosynthetic pathway of this hormone is a potential tool to increase the productivity in sugarcane. Thus, other goal of this work was develop a strategy to promote a controlled ripening of sugarcane at the end of harvest, using the inductor ethanol instead of ethylene precursor. To achieve this goal, an ethanol-inducible system based on alc switch of the ascomycete fungus Aspergillus nidulans were evaluated controlling gene expression of ACS and consequently the production of the ethylene hormone. Our results were consistent with the expected, showing clearly an increase in the production of ethylene hormone when transgenic tobacco plants were induced for the leaf spray with 5% (v/v) ethanol. This result shows the possible utilization of biotechnology tools in the control of gene expression involved in important agricultural traits, such as in the sugarcane culture. / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular

O mamão é um fruto climatérico, cujas transformações resultantes do amadurecimento ocorrem rapidamente após a colheita. O tratamento com 1- metilciclopropeno (1-MCP) tem sido testado para ampliar sua vida útil, entretanto, com resultados até então pouco consistentes. Pesquisas com peras, bananas e ameixas foram realizadas utilizando conjuntamente 1-MCP e etileno, com resultados relevantes. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar a fisiologia e a conservação pós-colheita do mamão Golden, submetido a diferentes combinações de 1-MCP e etileno, aplicados simultaneamente. Os frutos foram colhidos em pomares comerciais no estádio 1 de maturação, tratados e armazenados em câmaras frias a 11 e a 22ºC. O projeto foi dividido em três etapas. Na primeira etapa, observou-se que doses de 100 e 200 nL.L-1 de etileno combinados com iguais concentrações de 1-MCP, apresentaram resultados semelhantes aos do 1-MCP aplicado isoladamente. Na segunda etapa, o etileno nas concentrações entre 0 e 10 SL.L-1 foi combinado com 100 nL.L-1 de 1-MCP. Esse aumento na concentração de etileno diminuiu ou até mesmo anulou a ação do 1-MCP, nas concentrações mais elevadas. A mudança de cor e a perda da firmeza foram mais lentas nos tratamentos com 1-MCP na dose de 100 nL.L-1, aplicado sozinho ou associado a menor dose de etileno (2,5 SL.L-1). Estes mesmos tratamentos apresentaram atividade respiratória e produção de etileno menores que o controle. Na terceira etapa, os frutos tratados apenas com 1-MCP e 1-MCP mais etileno nas doses de 1 e 2,5 SL.L-1, mostraram maior retenção da firmeza externa, firmeza interna e cor da casca. A aparência também foi melhor nestes tratamentos, com menor porcentagem de frutos podres. O teor de sólidos solúveis foi semelhante em todos os tratamentos e o de ácido ascórbico foi mais elevado nos frutos tratados apenas com 1-MCP. A produção de etileno e a concentração de etileno endógeno foram maiores nos frutos que receberam apenas 1-MCP. A atividade respiratória e a concentração de CO2 endógeno mostraram pouca variação entre os tratamentos, durante o armazenamento. O teor de carotenóides foi menor nos tratamentos que receberam as maiores doses de etileno. O teor de clorofila foi maior no tratamento que recebeu apenas 1-MCP o qual levou mais tempo para tornar-se amarelo. A atividade da enzima pectinametilesterase (PME) foi menor nos tratamentos com 1-MCP e 1-MCP mais etileno na dose de 1 SL.L-1. A atividade das enzimas 1-aminociclopropano-1- carboxílico sintase (ACS) e oxidase (ACO) alternaram períodos de elevada e de baixa atividade em todos os tratamentos, durante o armazenamento. A aplicação simultânea de 1-MCP e do etileno mostrou resultados promissores no controle do amadurecimento do mamão Golden. / Papaya is a climacteric fruit which ripening resulting transformations occur rapidly after harvest. Treatment with 1-methylcyclopropene (1-MCP) has been tested to extend its shelf life, however, with inconsistent results so far. Researches with pears, bananas and plums were carried out using 1-MCP and ethylene with relevant results. Therefore, the aim was to study the physiology and postharvest storage of \'Golden\' papaya subjected to different combinations of 1-MCP and ethylene applied in the same time. The fruits were harvested from commercial orchards in stage 1 of ripening, they were treated and stored in cold chambers. The study was divided into three stages. In the first step it was observed that doses of 100 and 200 nL.L-1 of ethylene combined with equal concentrations of 1-MCP showed similar results to the 1-MCP applied alone. In the second step, ethylene concentrations between 0 and 10 L.L-1 were combined with 100 nL.L-1 of 1-MCP. This increase in ethylene concentrations, decreased or even nullified the action of 1-MCP. The change in color and the firmness loss were slower in the treatments using 100 nL.L-1 of 1-MCP applied alone or associated with a lower dose (2.5 L.L-1) of ethylene. These same treatments showed less respiratory activity and ethylene production than the control. In the third step, the fruits treated only with 1-MCP and 1-MCP more ethylene at the doses of 1 and 2.5 L.L-1, showed higher retention of external and internal firmness and the green color of peel. The appearance was also better in these treatments, with a lower percentage of rotten fruit. The soluble solids content was similar for all treatments and the ascorbic acid was higher in the fruits treated only with 1-MCP. The ethylene production and endogenous ethylene concentration was higher in fruits treated only with 1-MCP. Respiratory activity and endogenous CO2 concentration showed few variation among the treatments during the storage. The carotenoid content was lower in the treatments that received the highest doses of ethylene. The chlorophyll content was higher in treatments with only 1-MCP, which took longer to become yellow. The pectinmethylesterase (PME) enzyme activity was lower in treatments only with 1-MCP and 1-MCP more ethylene at a dose of 1 L.L-1. The 1- aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase (ACS) and oxidase (ACO) enzyme activity, alternate periods of high and low activity in all treatments during storage. Simultaneous application of 1-MCP and ethylene showed promising results in the ripening of papaya \'Golden\'.

O mamão é um fruto climatérico, cujas transformações resultantes do amadurecimento ocorrem rapidamente após a colheita. O tratamento com 1- metilciclopropeno (1-MCP) tem sido testado para ampliar sua vida útil, entretanto, com resultados até então pouco consistentes. Pesquisas com peras, bananas e ameixas foram realizadas utilizando conjuntamente 1-MCP e etileno, com resultados relevantes. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar a fisiologia e a conservação pós-colheita do mamão Golden, submetido a diferentes combinações de 1-MCP e etileno, aplicados simultaneamente. Os frutos foram colhidos em pomares comerciais no estádio 1 de maturação, tratados e armazenados em câmaras frias a 11 e a 22ºC. O projeto foi dividido em três etapas. Na primeira etapa, observou-se que doses de 100 e 200 nL.L-1 de etileno combinados com iguais concentrações de 1-MCP, apresentaram resultados semelhantes aos do 1-MCP aplicado isoladamente. Na segunda etapa, o etileno nas concentrações entre 0 e 10 SL.L-1 foi combinado com 100 nL.L-1 de 1-MCP. Esse aumento na concentração de etileno diminuiu ou até mesmo anulou a ação do 1-MCP, nas concentrações mais elevadas. A mudança de cor e a perda da firmeza foram mais lentas nos tratamentos com 1-MCP na dose de 100 nL.L-1, aplicado sozinho ou associado a menor dose de etileno (2,5 SL.L-1). Estes mesmos tratamentos apresentaram atividade respiratória e produção de etileno menores que o controle. Na terceira etapa, os frutos tratados apenas com 1-MCP e 1-MCP mais etileno nas doses de 1 e 2,5 SL.L-1, mostraram maior retenção da firmeza externa, firmeza interna e cor da casca. A aparência também foi melhor nestes tratamentos, com menor porcentagem de frutos podres. O teor de sólidos solúveis foi semelhante em todos os tratamentos e o de ácido ascórbico foi mais elevado nos frutos tratados apenas com 1-MCP. A produção de etileno e a concentração de etileno endógeno foram maiores nos frutos que receberam apenas 1-MCP. A atividade respiratória e a concentração de CO2 endógeno mostraram pouca variação entre os tratamentos, durante o armazenamento. O teor de carotenóides foi menor nos tratamentos que receberam as maiores doses de etileno. O teor de clorofila foi maior no tratamento que recebeu apenas 1-MCP o qual levou mais tempo para tornar-se amarelo. A atividade da enzima pectinametilesterase (PME) foi menor nos tratamentos com 1-MCP e 1-MCP mais etileno na dose de 1 SL.L-1. A atividade das enzimas 1-aminociclopropano-1- carboxílico sintase (ACS) e oxidase (ACO) alternaram períodos de elevada e de baixa atividade em todos os tratamentos, durante o armazenamento. A aplicação simultânea de 1-MCP e do etileno mostrou resultados promissores no controle do amadurecimento do mamão Golden. / Papaya is a climacteric fruit which ripening resulting transformations occur rapidly after harvest. Treatment with 1-methylcyclopropene (1-MCP) has been tested to extend its shelf life, however, with inconsistent results so far. Researches with pears, bananas and plums were carried out using 1-MCP and ethylene with relevant results. Therefore, the aim was to study the physiology and postharvest storage of \'Golden\' papaya subjected to different combinations of 1-MCP and ethylene applied in the same time. The fruits were harvested from commercial orchards in stage 1 of ripening, they were treated and stored in cold chambers. The study was divided into three stages. In the first step it was observed that doses of 100 and 200 nL.L-1 of ethylene combined with equal concentrations of 1-MCP showed similar results to the 1-MCP applied alone. In the second step, ethylene concentrations between 0 and 10 L.L-1 were combined with 100 nL.L-1 of 1-MCP. This increase in ethylene concentrations, decreased or even nullified the action of 1-MCP. The change in color and the firmness loss were slower in the treatments using 100 nL.L-1 of 1-MCP applied alone or associated with a lower dose (2.5 L.L-1) of ethylene. These same treatments showed less respiratory activity and ethylene production than the control. In the third step, the fruits treated only with 1-MCP and 1-MCP more ethylene at the doses of 1 and 2.5 L.L-1, showed higher retention of external and internal firmness and the green color of peel. The appearance was also better in these treatments, with a lower percentage of rotten fruit. The soluble solids content was similar for all treatments and the ascorbic acid was higher in the fruits treated only with 1-MCP. The ethylene production and endogenous ethylene concentration was higher in fruits treated only with 1-MCP. Respiratory activity and endogenous CO2 concentration showed few variation among the treatments during the storage. The carotenoid content was lower in the treatments that received the highest doses of ethylene. The chlorophyll content was higher in treatments with only 1-MCP, which took longer to become yellow. The pectinmethylesterase (PME) enzyme activity was lower in treatments only with 1-MCP and 1-MCP more ethylene at a dose of 1 L.L-1. The 1- aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase (ACS) and oxidase (ACO) enzyme activity, alternate periods of high and low activity in all treatments during storage. Simultaneous application of 1-MCP and ethylene showed promising results in the ripening of papaya \'Golden\'.