Le cancer est une maladie très hétérogène avec une multitude de facettes différentes. Cependant, même les différents types de cancer partagent un ensemble de caractéristiques qui peuvent être exploitées à des fins thérapeutiques. Dans notre groupe, nous nous intéressons aux dommages et à la réparation de l'ADN, en particulier dans le contexte du cancer, car l'instabilité génomique est considérée comme l'une des "caractéristiques du cancer". La recombinaison homologue (RH) est un mécanisme utilisé par les cellules pour réparer les cassures double brin, le type de dommage le plus dangereux de l'ADN. Des déficiences dans cette voie de réparation de l'ADN entraînent une instabilité génomique accrue et ont été observées dans une grande variété de tumeurs, notamment dans les cancers de l'ovaire et du sein. Les événements les plus fréquemment associés aux défauts de la voie de réparation de l'ADN sont des altérations génétiques dans les gènes liés à la voie de réparation de l'ADN, tels que BRCA1, BRCA2 et PALB2, identifié plus récemment. Le concept de létalité synthétique décrit l'incompatibilité ou la létalité de deux événements simultanés qui sont individuellement tolérables. La recherche sur le cancer tire parti de cette idée pour développer de nouveaux traitements ciblés. Le succès le plus important du développement de thérapies basées sur la létalité synthétique est le cas des inhibiteurs de PARP. Il a été observé que l'inhibition de PARP-1, une protéine abondante impliquée dans de nombreux processus cellulaires, y compris la réparation de l'ADN, entraîne une létalité synthétique avec des défauts de recombinaison homologue. Par conséquent, les inhibiteurs de PARP ont été développés pour cibler spécifiquement les tumeurs déficientes en RH tout en épargnant les tissus normaux déficients en RH. Néanmoins, comme pour la plupart des médicaments, de nombreux patients développent une résistance aux inhibiteurs de la PARP, ce qui peut entraîner une récidive de la maladie, soulignant ainsi la nécessité de trouver d'autres options thérapeutiques. Les recherches récentes se sont concentrées non seulement sur la découverte de nouvelles interactions létales synthétiques, mais aussi sur le développement de nouvelles combinaisons de molécules pour potentialiser leur effet et prévenir et contrecarrer les résistances aux médicaments. Suivant cette idée, l'objectif principal de mon travail de doctorat était de trouver de nouveaux traitements potentiels pour les tumeurs déficientes en RH, seuls ou en combinaison avec des inhibiteurs de PARP. Dans le cadre de ce projet, nous avons également développé un nouveau système de criblage in cellulo, basé sur l'analyse des effets des composés étudiés sur des populations cellulaires ayant des capacités RH différentes. Nous avons transfecté de manière stable des lignées cellulaires déficientes et déficientes en RH pour qu'elles expriment respectivement des protéines fluorescentes rouges ou vertes, et nous les avons mises en co-culture avec plus de 1000 médicaments d'une bibliothèque de composés. Nous avons identifié le CB1954, précédemment étudié en tant que promédicament, pour cibler spécifiquement les cellules déficientes en RH. Il est intéressant de noter que le CB1954 agit en synergie avec les inhibiteurs de PARP à la fois dans les cellules déficientes en RH et dans les cellules compétentes, constituant ainsi une combinaison prometteuse avec un potentiel intéressant. De plus, nous avons identifié une synergie entre l'inhibition de la PARP (Talazoparib) et l'inhibition de la PRMT de type I (MS023) dans des cellules de CBNPC et de cancer ovarien MTAP-négatif, à la fois sensibles et résistantes aux PARPi. Les deux combinaisons doivent faire l'objet d'un examen plus approfondi afin de mieux caractériser leurs mécanismes d'action et d'identifier les biomarqueurs de sensibilité et de résistance aux traitements. Nous étudions actuellement les effets de CB1954+PARPi sur le destin cellulaire et, puisque nous avons confirmé les effets des médicaments et la synergie dans des cellules cultivées en 3D, nous testons la combinaison dans des modèles de souris xénogreffes pour le cancer de l'ovaire. En résumé, nous avons développé une nouvelle méthode basée sur la fluorescence pour cribler les composés ayant un effet létal synthétique, qui pourrait être adaptée à l'étude d'autres pathologies. Nous avons également identifié et testé deux nouvelles combinaisons de composés qui pourraient potentiellement être appliquées au traitement des tumeurs résistantes aux inhibiteurs de PARP. / Cancer is a very heterogeneous disease with a multitude of different facets. However, even different types of cancer share a set of characteristics that can be exploited for therapeutic purposes. In our group we are interested in DNA damage and repair, particularly in the context of cancer, since genomic instability is considered one of the "Hallmarks of Cancer". Homologous Recombination (HR) is a mechanism used by cells to repair Double-Strand Breaks, the most harmful type of DNA damage. Deficiencies in this pathway of DNA repair results in increased genomic instability and has been observed in a wide variety of tumours, notably in ovarian and breast cancer. The events most commonly associated with HR defects are genetic alterations in HR related genes such as BRCA1, BRCA2 and the more recently identified PALB2. The concept of synthetic lethality describes the incompatibility or lethality of two simultaneous events that are individually tolerable. Cancer research is taking advantage of this idea to develop new targeted treatments. The most important success of synthetic lethality-based therapy development is the case of PARP inhibitors. It was observed that inhibition of PARP-1, an abundant protein involved in many cellular processes, including DNA repair, is synthetically lethal with defects in Homologous Recombination. Therefore, PARP inhibitors were developed to specifically target HR-deficient tumours while sparing normal HR-proficient tissues. Nevertheless, as with most drugs, many patients develop resistance to PARP inhibitors, which can lead to disease recurrence, thus highlighting the need for alternative treatment options. Recent research has focused not only on finding new synthetic lethal interactions but also on developing new combinations of molecules to potentiate their effect and both prevent and counteract resistances to drugs. Following this idea, the main objective of my doctoral work was to find new potential treatments for HR-deficient tumours, alone or in combination with PARP inhibitors. Within this project, we also developed a new in cellulo screen system, based on analyzing the effects of the studied compounds on cell populations with different HR capacities. We stably transfected HR-proficient and deficient cell lines to express either red or green fluorescent proteins, respectively, and co-cultured them with more than 1000 drugs of a library of compounds. We identified CB1954, previously studied as a prodrug, to specifically target HR-deficient cells. Interestingly, CB1954 synergizes with PARP inhibitors in both HR-deficient and proficient cells, thus constituting a promising combination with interesting potential. Additionally, we identified synergy between PARP inhibition (Talazoparib) and type I PRMT inhibition (MS023) in MTAP-negative NSCLC and ovarian cancer cells, both PARPi sensitive and resistant. Both combinations need further examination to better characterize their mechanisms of action and identify the biomarkers for sensitivity and resistance to the treatments. We are currently studying the effects of CB1954+PARPi on cell fate and, since we have confirmed the effects of the drugs and the synergy in 3D cultured cells, we are testing the combination in ovarian cancer xenograft mouse models. In summary, we have developed a new fluorescence-based method to screen for compounds having a synthetic lethal effect, which could be adapted to the study of other pathologies. We have also identified and tested two new compound combinations that could potentially be applied to the treatment of tumours resistant to PARP inhibitors.

Le virus du papillome humain (VPH) est l'agent étiologique du cancer du col de l'utérus, d'un certain nombre d'autres cancers anogénitaux et d'un sous-groupe de cancers de la tête et du cou. Les VPH à haut-risque sont nécessaires au développement de ces cancers, mais les cellules infectées doivent acquérir d'autres mutations pour devenir cancéreuses. Dans une cellule saine, l'apparition d'altérations génétiques est contrôlée par des voies de signalisation sophistiquées qui détectent, signalent et réparent les dommages à l'ADN. Parmi ces dommages, les cassures double brin de l'ADN (DSBs) sont particulièrement nocives pour la survie cellulaire, car si elles ne sont pas réparées, elles peuvent conduire à l'apparition de mutations et dans des cas extrêmes à la mort cellulaire. Notre objectif principal était de comprendre les mécanismes menant à la dérégulation des voies de réparation des DSBs dans les cellules VPH-positives. Notre hypothèse est que l'interférence du VPH avec certains facteurs perturbe la réparation des DSBs et donc la stabilité du génome de la cellule hôte, ce qui peut conduire au développement de cancers. Nos observations ainsi que celles d'autres groupes ont permis de montrer que les cellules cancéreuses VPH-positives accumulent de manière excessive de foyers nucléaires 53BP1 (53BP1-NBs, 53BP1 nuclear bodies), suggérant que les cellules sont soumises à des niveaux élevés de stress réplicatif et que le virus interfère avec la réparation des cassures d'ADN en phase S/G2. De plus, nous avons démontré que RNF168, une ubiquitine E3-ligase impliquée dans la réparation des DSBs, est essentielle à l'amplification du génome viral dans les kératinocytes en différenciation et que la protéine est ciblée directement par l'oncoprotéine E7 des VPHs à haut risque. Cette interaction a lieu via un domaine de 40 acides aminés conservé et jusqu'alors non caractérisé de RNF168, le E7BD (E7-binding domain). L'interaction avec E7 affecte la fonction de RNF168 au DSBs, révélant un mécanisme par lequel une protéine virale contribue directement à l'acquisition d'instabilité génomique. Comme la liaison de E7 au E7BD entrave la fonction de RNF168 aux DSBs, nous pensons que ce domaine joue un rôle clé dans la régulation des fonctions de RNF168. Afin de déterminer la fonction du E7BD, nous avons optimisé une méthode de « marquage de proximité » basée sur l'utilisation de la protéine TurboID, afin de déterminer l'interactome de RNF168 dépendant de ce domaine. La biotine ligase TurboID qui agit dans des intervalles de temps très courts nous a permis de visualiser les interactions lors du recrutement des facteurs de réparation aux dommages, un processus extrêmement rapide. Ainsi nous avons pu valider l'utilisation de TurboID pour établir l'interactome des protéines impliquées dans la réparation des DSBs telles que RNF168. De plus, nous avons identifié plusieurs nouveaux partenaires de l'E3-ligase qui sont perdus lorsque le E7BD est absent. Par la suite, l'impact de certains de ces interacteurs sur les fonctions de RNF168 a été évalué par une approche d'ARN interférence. Nous avons ainsi pu identifier un nouvel interacteur de RNF168, l'hexokinase HK1, qui régule les quantités de RNF168 disponible dans la cellule. Finalement, nous avons décidé de tirer profit de cette approche et développé un système permettant la détection de protéines faiblement exprimées ou de locus d'ADN spécifiques à l'aide de la protéine TurboID. Nous avons démontré que l'utilisation de TurboID-RNF168 permet de visualiser le recrutement de RNF168 à différents types de dommages sans affecter la dynamique de réparation des DSBs. De plus, l'utilisation de TurboID-dCas9 nous a permis de visualiser en immunofluorescence des loci répétés tel que les télomères, mais également l'ADN viral intégré dans le génome de cellules cancéreuses VPH-positives. Ainsi ce projet a contribué à l'amélioration des connaissances sur les processus de maintien de la stabilité génomique dans les cellules infectées par le VPH et nous pensons que les découvertes présentées dans ce travail contribuent à la compréhension de la régulation de protéines cellulaires comme RNF168. / The human papillomavirus (HPV) is the etiological agent of cervical cancer, a subset of anogenital cancers as well as head and neck cancers. High-risk HPV is necessary for the development of cancers, but infected cells must acquire additional mutations to become cancerous. In a normal cell, the acquisition of genetic alterations is controlled by numerous signaling pathways that detect, signal, and repair DNA damage. Among those, DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly dangerous. If left unrepaired, they can lead to the acquisition of mutations and ultimately to cell death. Our main objective was to understand the mechanisms leading to the deregulation of DSBs repair pathways in HPV-positive cells. We hypothesize that HPV components can interfere with DSBs repair and therefore, with the stability of the host cell genome, which leads to cancer development. Our observations and those of other groups have shown that HPV-positive cancer cells present an abnormal accumulation of 53BP1-NBs, suggesting that the cells are subjected to high levels of replicative stress and that the virus interferes with the repair in the S / G2 phase of the cell cycle. In addition, we have demonstrated that RNF168, a ubiquitin E3-ligase involved in the repair of DSBs, is essential for the amplification of the viral genome in differentiating keratinocytes and that the protein is directly targeted by the oncoprotein E7. This interaction occurs via a conserved and uncharacterized 40 amino acid domain of RNF168, the E7BD (E7-binding domain). The interaction with E7 affects the function of RNF168 at DSBs, revealing a mechanism by which a viral protein directly contributes to the acquisition of genomic instability. Furthermore, the binding of E7 to the E7BD hinders the function of RNF168 at DSBs, suggesting that this domain plays a key role in the regulation of RNF168 functions. To determine the role of the E7BD, we optimized a method of proximity labeling using the TurboID protein to determine the RNF168 E7BD-dependent interactome. The TurboID biotin ligase biotinylated proximal proteins in very short time intervals allowed us to visualize the interactions during the recruitment of DNA damage repair factors. We were thus able to validate the use of TurboID to establish the interactome of proteins involved in DSBs repair such as RNF168. In addition, we have identified several new partners of the E3-ligase that are lost in the absence of the E7BD. Subsequently, the impacts of some of these interactors on the functions of RNF168 were evaluated by an RNA interference approach. This enabled us to identify the hexokinase HK1 as a new partner and regulator of RNF168. Finally, we decided to take advantage of this approach and developed a system for the detection of weakly expressed proteins or specific DNA loci using the TurboID protein. We demonstrated that TurboID-RNF168 allows the visualization of the protein recruitment to different types of DNA damage without affecting the dynamics of DSBs repair. In addition, we used TurboID-dCas9 to visualize repeated loci such as telomeres, and viral DNA integrated into the genome of HPV positive cancer cells by immunofluorescence. In conclusion, the results present in this thesis will contribute to our knowledge of genomic stability maintenance in HPV infected cells and our understanding of the regulation of cellular proteins such as RNF168.

La chromatine protège et organise la molécule d'ADN dans le noyau. Sa dynamique est essentielle afin de réguler l'accès direct à l'information génétique encodée dans la séquence de l'ADN durant les processus de la réplication, la transcription et la réparation. Le complexe acétyltransférase TIP60/NuA4 est un régulateur clé de la stabilité et de l'expression du génome, fréquemment dérégulé dans certains cancers. L'analyse de ce complexe multiprotéique a constitué le cœur de mes études doctorales. Mon projet portait sur l'étude de la fonction et de la régulation du complexe au cours de la réparation des dommages de l'ADN. Il s'est ainsi découpé en 3 axes: comprendre le recrutement du complexe TIP60 à la cassure double-brin, sa régulation durant la réparation et sa fonction exacte au cours de la réponse aux dommages. Mon objectif initial était de purifier le complexe TIP60 natif afin d'effectuer des analyses par spectrométrie de masse. Dans un premier temps, nous avons développé une méthode alliant édition du génome et étude protéomique afin d'améliorer et de faciliter l'exploration des interactions protéiques au sein de complexes à sous-unités multiples comme TIP60. Elle rend possible l'étude des activités biochimiques et des liens structure-fonction. De plus, nous avons étudié les modifications post-traductionnelles du complexe comme l'acétylation et la phosphorylation. Finalement, j'ai cherché à clarifier la fonction du complexe durant la réparation via l'identification de nouveaux substrats d'acétylation. Ainsi, nous avons identifié MBTD1 comme étant une nouvelle sous-unité stable du complexe, ce qui nous a permis de clarifier la fonction de TIP60. De façon intéressante, l'identification d'un nouveau substrat au sein de la chromatine a éclairci la fonction précoce de TIP60 lors du choix de voie de réparation. Finalement, une fonction plus tardive de TIP60 est suggérée par l'identification de nouveaux substrats non histone au sein de la voie de recombinaison homologue. L'ensemble de ces travaux a permis d'éclaircir la régulation et la fonction de TIP60 au cours de la réparation des cassures double-brin de l'ADN conduisant à une meilleure compréhension des mécanismes d'oncogenèse.

Le génome eucaryote est contenu dans le noyau sous forme de chromatine, le nucléosome étant son unité de base. Le nucléosome est composé d'ADN enroulé autour d'un octamère d'histones. La chromatine permet l'empaquetage de l'ADN, mais module également diverses fonctions cellulaires telles que la transcription, la réplication et la réparation de l'ADN. Il existe différents types de dommages à l'ADN, les plus toxiques étant les cassures d'ADN double brins (DNA double-strand breaks, DSBs) qui si elles ne sont pas réparées, peuvent compromettre l'intégrité du génome. Les histones peuvent être l'objet de modifications post-traductionnelles qui sont essentielles pour réguler la chromatine. NuA4 est un complexe acétyltransférase qui a été bien décrit pour son rôle dans la transcription et la réparation de l'ADN. Au fil des années, diverses études ont montré que NuA4 acétyle les histones, cependant, de nouvelles études ont permis de mettre en évidence des cibles non-histones. Des précédentes études du laboratoire ont montrées comment NuA4 est recruté au site de dommages à l'ADN et comment il régule la réparation de l'ADN en acétylant les histones et les protéines de réparation. Dans ce travail, nous disséquons davantage le rôle de NuA4 dans la réparation des dommages à l'ADN. Ainsi, nous avons pu déterminer qu'il peut être recruté aux DSBs par un mécanisme alternatif reposant sur la protéine Lcd1ᴬᵀᴿᴵᴾ, indépendamment de Xrs2. Nous décrivons également deux nouvelles cibles acétylées par NuA4, Nej1 et Yku80, deux facteurs qui sont impliqués dans la réparation par jonctions d'extrémités non-homologue (non-homologous end-joining, NHEJ). De plus, nous avons établis qu'il existe une relation antagoniste entre NuA4 et les facteurs du NHEJ. L'acétylation de certains de ces facteurs favorise la réparation des DSBs par des voies de réparation qui reposent sur la résection des extrémités de la cassure. Cette régulation semble conservée au cours de l'évolution puisque le complexe mammifère TIP60 antagonise 53BP1 (levure Rad9) qui favorise la réparation par NHEJ et ainsi permet de réguler le choix de la voie de réparation. De plus, nous démontrons, que chez la levure, la queue N-terminale de l'histone H2A contient un site SQ qui est phosphorylé par Mec1ᴬᵀᴿ en présence de dommages à l'ADN. Nos données suggèrent que cette marque d'histone est nécessaire pour maintenir la fidélité de la résection de l'extrémité de l'ADN en modulant la liaison de Rad9⁵³ᴮᴾ¹. Nous supposons que cette phosphorylation agit de façon similaire à l'ubiquitination sur H2A chez les mammifères, mettant en évidence que des modifications d'histones différentes chez plusieurs organismes convergent pour effectuer une même fonction. Enfin, nous décrivons le rôle du domaine YEATS de la sous-unité Yaf9 partagée par les complexes SWR1 et NuA4. Nous montrons que ce domaine reconnaît la modification d'histone H3K27ac et est impliqué dans l'échange d'histone Htz1ᴴ²ᴬ·ᶻ. Ainsi cette modification est impliquée dans la régulation de la transcription et de la réparation des dommages à l'ADN. Dans l'ensemble, les résultats présentés dans cette thèse ajoutent des contributions importantes aux connaissances actuelles qui permettront de mieux comprendre le rôle de NuA4 et des modifications d'histones dans la réparation des dommages à l'ADN et dans le maintien de l'intégrité du génome. / The eukaryotic genome is packed in the nucleus in the form of chromatin, with the nucleosome being its basic unit. The nucleosome is composed of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Chromatin not only helps in the packing of DNA but also modulates various cellular functions such as transcription, replication and DNA repair. DNA damage manifests in various forms with DNA double-strand breaks (DSBs) being the most toxic which, if unrepaired, compromises genome integrity. Histones are decorated by various post-translational modifications that are essential for fine-tuning and regulation of chromatin. NuA4 is an acetyltransferase complex which has been well described for its role in transcription and DNA repair. Over the years, various studies have shown that NuA4 acts through acetylation of histones, however, new studies have highlighted non-histone targets. Our previous studies have shown how NuA4 is recruited to the site of DNA damage and how it regulates DNA repair by acetylating histones and repair proteins. Here we further dissect the role of NuA4 in DNA repair and found that it can be recruited to DSBs by an alternative mechanism relying on Lcd1ᴬᵀᴿᴵᴾ, independently of Xrs2. We also describe two new targets of NuA4 acetyltransferase activity, Nej1 and Yku80, both factors involved in repair by non-homologous end-joining (NHEJ). In fact, we observe an antagonistic relationship between NuA4 and NHEJ factors, with acetylation of the latter favouring repair of DSBs by resection-based pathways. This regulation seems evolutionary conserved with the mammalian TIP60complex antagonising pro-NHEJ factor 53BP1 (yeast Rad9) to govern the choice of repair pathway. In line with this, we further show that yeast histone H2A N-terminal tail harbours an SQ-site which is phosphorylated by Mec1ᴬᵀᴿ upon DNA damage. Our data suggests this histone mark is required to maintain the fidelity of DNA end resection by modulating the binding of Rad9⁵³ᴮᴾ¹. We speculate that this phosphorylation acts similarly to ubiquitination of mammalian H2A tail, highlighting different histone modifications across organisms converging to achieve a similar function. Lastly, we describe the role of the YEATS domain found in the Yaf9 subunit shared by SWR1 and NuA4 complexes. We show that this domain recognizes H3K27ac and is involved in histone Htz1ᴴ²ᴬ·ᶻ exchange, thus implicating it in transcription and DNA repair. Al together, the results presented in this thesis make important contributions to better understand the intricate roles played by NuA4 and histone modifications in the repair of DNA to maintain genome integrity.

L’intégrité des gènes de la famille FANC est essentielle au bon fonctionnement de la réparation des dommages à l’ADN. Récemment, différents variants d’épissage du gène FANCC ont été identifiés. Nous avons donc étudié l’impact du transcrit alternatif sur le processus de réparation des bris de l’ADN. Le transcrit FANCCΔ7 est présent dans toutes les lignées de cancer du sein analysées. L’analyse des fractions ribosomales confirma la traduction de FANCCΔ7 en protéine fonctionnelle. La protéine FANCCΔ7 semble séquestrée dans le cytoplasme des cellules HEK293T transfectées suite à un traitement à la MMC comparé à FANCC qui migre majoritairement au noyau. Nous avons démontré que les cellules déficientes infectées avec FANCCΔ7 sont bloquées en G2/M en présence de MMC. Finalement, FANCCΔ7 est incapable de mener à la monoubiquitination de FANCD2. Cette étude a permis de déterminer que le variant d’épissage FANCCΔ7 ne permet pas la réparation des pontages interbrins induits par la MMC.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2005-2006 / La cellule dispose de plusieurs mécanismes de réparation, nécessitant tous l'accès à l'ADN, afin de prévenir les perturbations occasionnées par l'instabilité génomique. La structure des chromosomes eucaryotes (chromatine) forme une barrière physique empêchant l'accessibilité à l'ADN et ainsi les processus biologiques nucléaires tels la transcription, réplication, recombinaison et réparation des dommages de l'ADN. Dans ce dernier processus clé, certaines activités reconfigurant la chromatine pourraient donc s'avérer essentiels en facilitant l'accès à la machinerie de réparation. / Nous avons démontré le recrutement spécifique du complexe histone acétyltransférase NuA4 par immunoprécipitation de chromatine à une cassure double brin de l'ADN, le type de dommage le plus dangereux pour la cellule. Des cinétiques ont permis de déterminer à quel moment NuA4 apparaît au site de cassure en relation avec les modifications de la chromatine environnante et de vérifier l'apparition subséquente de complexes de remodelage ATP dépendant. En parallèle, de nouveaux sites de phosphorylation d'histones qui pourraient être impliqués dans la réparation de dommages sur l'ADN ont été investigués. En conclusion, nos travaux permettent de lier fonctionnellement des complexes de modification/reconfiguration de la chromatine avec le processus de réparation de dommages à l'ADN.

Les mécanismes de réparation de l’ADN sont cruciaux pour la survie cellulaire. Cependant, ces mécanismes sont souvent altérés dans les processus cancéreux permettant l’accumulation de mutations et d’instabilité génétique. Plusieurs voies de réparation sont utilisées par les cellules pour réparer différents types de dommages à l’ADN. La réparation des cassures double-brin (CDB) par la Recombinaison Homologue (RH) permet de réparer fidèlement ces lésions. PALB2 est au coeur d’un réseau d’interactions protéiques comprenant BRCA1 et BRCA2. Tout comme ces dernières, PALB2 est un gène de prédisposition au cancer du sein. Ainsi, par ses fonctions dans la stabilité du génome et le cancer, l’étude fonctionnelle de PALB2 et la compréhension du rôle de ses domaines sont essentiels. En effet, PALB2 se lie à l’ADN, mais les mécanismes induisant sa liaison et la fonction de cette liaison sont toujours mal compris. En ce sens, nos collaborateurs ont identifié quatre principaux acides aminés dans ce domaine, comme étant importants car leurs mutations en alanine compromettent la liaison de PALB2 à l’ADN. De ce fait, mon premier objectif porte sur l’étude fonctionnelle de ce domaine de liaison à l’ADN dans la recombinaison homologue. En accord avec les essais biochimiques conduits par nos collaborateurs, notre étude in vivo a pu démontrer que la mutation de ces résidus en alanine réduit de 50% la formation de foyers RAD51 aux dommages, réduisant ainsi l’efficacité de la RH dans ces cellules. Mon deuxième objectif, vise l’établissement de modèles de létalité synthétique pour tuer les cellules déficientes en réparation de l’ADN. Le but est d’identifier de nouveaux interacteurs de PALB2 par la technique BioID et qui seraient synthétiquement létaux en combinaison avec d’autres mutations génétiques. Enfin, il a été démontré que les inhibiteurs de PARP amènent à une létalité synthétique dans les cellules déficientes en PALB2. Cependant, ces études ne prennent pas en compte l’aspect tridimensionnel de la tumeur cancéreuse. C’est pourquoi, dans mon projet j’ai initié le développement de modèles 3D qui pourraient possiblement aider à l’évaluation des stratégies de létalité synthétique, se rapprochant ainsi du contexte physiologique de la tumeur.

L'intégrité de l'ADN génomique humain est maintenue par des systèmes de réparation de l'ADN qui protègent les cellules des dommages causés par des agents environnementaux ou des lésions spontanées de l'ADN. Chaque cellule peut subir jusqu'à 10⁵ lésions par jour, y compris les cassures double-brin de l'ADN (CDB). La poly(ADPribosyl)ation (PARylation) est l'un des premiers événements de signalisation moléculaire survenant aux CDBs. Il est catalysé par les poly(ADP-ribose)polymérases (PARP) qui sont directement activées par ces lésions d'ADN. Le fait de ne pas générer de poly(ADP)ribosyl (pADPr) en réponse à des dommages à l'ADN par une inhibition chimique ou par l'absence de PARP-1 augmente la sensibilité cellulaire au stress génotoxique, indiquant que la pADPr elle-même est une molécule clé de signalisation des dommages à l'ADN. L'inhibition de l'enzyme de signalisation des dommages à l'ADN, la poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) est l'une des nouvelles thérapies les plus prometteuses contre le cancer. Les inhibiteurs de PARP sensibilisent les cellules cancéreuses aux agents endommageant l'ADN et tuent efficacement les cellules cancéreuses du sein, des ovaires et du pancréas déficientes en BRCA1 (Breast Cancer gene 1) et BRCA2 (Breast Cancer gene 2), ce qui suggère que les cellules déficientes en réparation des CDBs sont extrêmement sensibles à l'inhibition de PARP. Pourtant, les mécanismes sous-jacents à cette létalité synthétique entre le déficit de réparation du CDB et l'inhibition de PARP restent mal définis. Il y a un débat considérable sur le mécanisme par lequel l'inhibition de PARP tue les cellules déficientes en réparation de l'ADN, et le plein potentiel des inhibiteurs de PARP dans le traitement du cancer ne peut être obtenu que par une compréhension claire des voies de réponse aux dommages de l'ADN (DDR) aux CDB et comment ils sont affectés par les inhibiteurs de PARP. L'objectif général de ma thèse est d'étudier le rôle de PARP-1 dans la réparation DSB et d'identifier les interacteurs de PARP-1 qui jouent également un rôle dans ce processus. Les cellules eucaryotes réparent les CDBs par deux voies principales, la jonction d'extrémité non homologue (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR). La HR est initiée par la liaison des CDBs par BRCA1 et le complexe MRE11-RAD50-NBS1 et des nucléases EXO1/DNA2 pour générer de l'ADN simple-brin, qui est ensuite utilisé par la recombinase RAD51 et le complexe BRCA1-PALB2-BRCA2. Une question clé dans notre domaine concerne les facteurs critiques pour réguler le choix de la voie CDB. HR est initiée à partir d'extrémités DSB hautement résectées, tandis que dans le NHEJ, la résection est empêchée par des facteurs de réparation clés incluant RIF1 et 53BP1. En utilisant des cellules déficientes en PARP-1, nous avons observé que deux inhibiteurs de la résection de l'ADN et des régulateurs de choix de voie, RIF1 et 53BP1, la formation de foyers induits par des dommages à l'ADN sont fortement altérés. Cela confirme notre hypothèse selon laquelle PARP-1 participe à la réparation du DSB en influençant la résection de l'ADN. Afin de mieux comprendre le mécanisme de résection et le rôle que PARP-1 y joue, nous avons identifié d'autres protéines qui interagissent avec PARP-1 et modulent ce processus. Pour ce faire, nous avons utilisé des données sur les protéines de liaison au pADPr générées à la fois dans notre laboratoire et celui de notre collaborateur Ted Dawson de Johns Hopkins. Les candidats sélectionnés à partir de ces listes ont été criblés pour identifier une seule cible qui démontrerait un phénotype similaire à la perte de PARP-1. Deux cibles initiales ont été explorées et finalement une seule protéine à doigt de zinc a été choisie comme cible principale. Nous devons relever la fonction de ce doigt de zinc en HR, dans l'espoir qu'il permettra de découvrir davantage les mécanismes de PARP-1 en résection. En résumé, cette thèse élucide le rôle de PARP-1 dans la résection de l'ADN et identifie une protéine à doigt de zinc non étudiée auparavant qui interagit avec PARP-1 et partage une fonction similaire à PARP-1 dans la résection de l'ADN. / The integrity of human genomic DNA is maintained by DNA repair systems that will protect cells from damage by environmental agents or spontaneous DNA lesions. Each cell can experience up to 10⁵ lesions daily, including DNA double-strand breaks (DSB)s. Poly(ADP-ribosyl)ation (PARylation) is one of the earliest molecular signalling events occurring at DNA DSBs. It is catalysed by poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) that are directly activated by those DNA lesions. Failure to generate pADPr in response to DNA damage by either chemical inhibition or absence of PARP-1 increases the cellular sensitivity to genotoxic stress, indicating that pADPr itself is a key DNA damage signalling molecule. Inhibition of the DNA damage signalling enzyme poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) is among the most promising new therapies in cancer. PARP inhibitors sensitize cancer cells to DNA damaging agents and efficiently kill BRCA1- and BRCA2-deficient breast, ovarian and pancreatic cancer cells, suggesting that cells deficient in DSB repair are exquisitely sensitive to PARP inhibition. Yet, the mechanisms underlying this synthetic lethality between DSB repair deficiency and PARP inhibition remain poorly defined. There is considerable debate about the mechanism through which PARP inhibition kills DNA repair-deficient cells, and the full benefit of PARP inhibitors in cancer therapy can only be achieved by a clear understanding of the DNA damage response (DDR) pathways to DSBs and how these are affected by PARP inhibitors. The overall aim of my PhD is to investigate the role of PARP-1 in DSB repair and identify interactors of PARP-1 which also play a role in this process. Eukaryotic cells repair DSBs by two major pathways, non-homologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). HR is initiated by the binding of DSB by BRCA1 and the end resection of the DSB by MRE11 (and the associated NBS1, RAD50, CtIP, and EXO1) to generate single-stranded DNA, which is further processed by RAD51 and BRCA1-PALB2-BRCA2. A key question in our field regards which factors are critical for regulating the DSB pathway choice. HR is initiated from highly resected DSB ends, whereas in NHEJ, resection is prevented by key repair factors that include RIF1 and 53BP1. Using PARP-1-deficient cells, we have observed that two inhibitors of DNA resection and regulators of pathway choice, RIF1 and 53BP1, are strongly impaired in forming DNA damage-induced foci. This supports our hypothesis that PARP-1 participates in DSB repair by influencing DNA resection. In order to further understand the mechanism of resection and the role that PARP-1 plays in it we also aim to identify other proteins which interact with PARP-1 and modulate this process. To accomplish this, we made use of data on PAR binding proteins generated both in our lab and that of our collaborator Ted Dawson. The candidates selected from these lists were screened to identify a single target that would demonstrate a similar phenotype to PARP-1 loss. Two initial targets were further explored and finally a single zinc finger protein was selected as our primary target. We aim to characterize the function of this zinc finger in HR, in the hopes that it will further uncover the mechanisms of PARP-1 in resection. In summary this thesis elucidates the role of PARP-1 in DNA resection and identifies a previously unstudied zinc finger protein which interacts with PARP-1 and shares a similar function to PARP-1 in DNA resection.

Le cancer est une maladie majeure ayant un taux de mortalité élevé dans le monde et au Canada. C'est pourquoi notre équipe de recherche développe de nouvelles classes d'agents anticancéreux, notamment les phényl 4-(2-oxoimidazolidin-1-yl)benzènesulfonates (PIB-SOs) et les N-phényl ureidobenzènesulfonates (PUB-SOs). Les PIB-SOs et les PUB-SOs sont constitués de deux cycles aromatiques identifiés A et B reliés entre eux par un pont sulfonate. Les PIB-SOs sont principalement caractérisés par un groupement imidazolidin-2-one sur le cycle aromatique A alors que les PUB-SOs possèdent un groupement 2-chloroéthylurée ou éthylurée sur ce cycle. D'un côté, les PIB-SOs montrent une activité antiproliférative sur des cellules cancéreuses de l'ordre du nanomolaire, arrêtent le cycle cellulaire en phase G2/M et ciblent les microtubules dans le site de liaison de la colchicine (C-BS). D'un autre côté, les PUB-SOs ont une activité antiproliférative de l'ordre du bas micromolaire sur des lignées cellulaires cancéreuses. Selon leur structure, ils peuvent soit arrêter le cycle cellulaire en phase G2/M et cibler le C-BS des microtubules lorsqu'ils sont substitués en position 3, 4 et/ou 5 sur le cycle aromatique B ou soit arrêter le cycle cellulaire en phase S et cibler les mécanismes de réparation et de réplication de l'ADN lorsque le cycle aromatique B est substitué en position 2 par des halogènes ou de courtes chaînes alkyles. Les travaux de mon doctorat avaient pour objectif général d'optimiser les propriétés physicochimiques, pharmacologiques et pharmacocinétiques des PIB-SOs et des PUB-SOs. À cet effet, 187 nouveaux dérivés et analogues des PIB-SOs et des PUB-SOs ont été préparés, purifiés, caractérisés et évalués biologiquement. Les nouveaux dérivés et analogues des PIB-SOs sont divisés en neuf familles principales caractérisées par la substitution du groupement imidazolidin-2-one par un groupement lactame, imidazolidin-2,4-dione, imidazolidin-2,5-dione, éthyl 2-uréidoacétate, butyramide, éthylurée, 2-chloroéthylurée, éthylthiourée ou phénylurée. L'activité antiproliférative des familles peuvent être divisée en trois catégories : (1) très active (ordre du nanomolaire), (2) modérément active (ordre du micromolaire) et (3) peu ou non active (supérieure à 100 μM). Les familles de composés possédant le groupement lactame, imidazolidin-2,4-dione ou imidazolidin-2-one intègrent la catégorie très active. Les familles de composés ayant les groupements butyramide, éthylurée, 2-chloroéthylurée, éthylthiourée ou phénylurée sont dans la catégorie modérément active et finalement, ceux portant les groupements imidazolidin-2,5-dione ou éthyl 2-uréidoacétate sont dans la catégorie peu ou non active. Les composés les plus puissants des familles très actives et modérément actives arrêtent la progression du cycle cellulaire en phase G2/M, inhibent la polymérisation des microtubules et perturbent le cytosquelette en se liant au C-BS. Ils sont aussi actifs sur des lignées cellulaires résistantes au paclitaxel, à la vinblastine et sur une lignée cellulaire surexprimant la glycoprotéine P. Ils ne sont pas ou seulement faiblement toxiques sur le modèle d'embryons de poulet et ils montrent des propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques théoriques prometteuses en plus de respecter les filtres de biodisponibilité per os. Les dérivés et analogues des PUB-SOs sont divisés en deux familles principales en remplaçant le groupement 2-chloroéthylurée soit par différents groupements amides ou soit par différents groupements urées. L'activité antiproliférative de ces nouveaux dérivés et analogues des PUB-SOs est généralement plus puissante avec les groupements urées qu'avec les groupements amides et elle se situe entre la centaine de nanomolaire et le bas micromolaire. Les relations structure-activité des composés les plus puissants montrent que l'arrêt de la progression du cycle cellulaire en phase S survient seulement lorsque le cycle aromatique B est substitué en position 2 par des halogènes ou de courtes chaînes alkyles ; les composés ayant un autre patron de substitution sur le cycle aromatique B arrêtent la progression du cycle cellulaire en phase G2/M et perturbent les microtubules. Les composés les plus puissants arrêtant le cycle cellulaire en phase S induisent la phosphorylation de l'histone 2AX, un marqueur de stress réplicatifs. Des essais de cinétique d'alkylation démontrent que leur activité biologique n'est pas causée par leur potentiel alkylant. Les nouveaux analogues ne sont pas ou seulement faiblement toxiques sur le modèle d'embryons de poulet et ont également des propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques théoriques prometteuses tout en respectant les filtres biodisponibilité per os. Les dérivés et analogues des PIB-SOs et des PUB-SOs composent donc de nouvelles familles d'agents anticancéreux prometteurs pour des études précliniques plus poussées. / Cancer is a major disease leading to a high mortality rate worldwide and in Canada. As a result, our research team develops new anticancer agent classes notably phenyl 4-(2-oxoimidazolidin-1-yl)benzenesulfonates (PIB-SOs) and phenyl ureidobenzenesulfonates (PUB-SOs). PIB-SOs and PUB-SOs consist of two aromatic rings named A and B connected together by a sulfonate bridge. PIB-SOs are mainly characterized by an imidazolidin-2-one moiety on the aromatic ring A while PUB-SOs bear a 2-chloroethylurea or an ethylurea on this ring. On the one hand, PIB-SOs show antiproliferative activity in the nanomolar range towards cancer cells, block cell cycle progression in G2/M phase and target microtubules in the colchicine-binding site (C-BS). On the other hand, PUB-SOs exhibit antiproliferative activity in the low micromolar on cancer cell lines. Depending on their structures, they either stop the cell cycle progression in the G2/M phase and target the C-BS of microtubules when they bear substituents at position 3, 4 and/or 5 on the aromatic ring B or they arrest the cell cycle progression in the S phase and target the DNA repair and replication mechanisms when they bear halogens or short alkyl chains at position 2 on the aromatic ring B. The general objective of my doctoral work was to optimize the physicochemical, pharmacological and pharmacokinetic properties of PIB-SOs and PUB-SOs. To this end, 187 new derivatives and analogues of PIB-SOs and PUB-SOs were prepared, purified, characterized and biologically evaluated. New PIB-SOs are divided into nine families of compounds characterized by the replacement of the imidazolidin-2-one moiety by lactam, imidazolidin-2,4-dione, imidazolidin-2,5-dione, ethyl 2-ureidoacetate, butyramide, ethylurea, 2-chloroethylurea, thioethylurea or phenylurea group. The antiproliferative activity of these families can be divided into 3 categories: (1) very active (nanomolar range), (2) moderately active (micromolar range) and (3) weakly or not active (over 100 μM). Families of compounds having a lactam, an imidazolidin-2,4-dione or an imidazolidin-2-one are in the very active category. Families bearing a butyramide, an ethylurea, a 2-chloroethylurea, a thioethylurea or a phenylurea group are in the moderately active category while those bearing an imidazolidin-2,5-dione or an ethyl 2-ureidoacetate are in the weakly or not active category. The most potent compounds of the most and moderately active families arrest the cell cycle progression in G2/M phase, inhibit microtubule polymerization and disrupt the cytoskeleton by binding to the C-BS. They are also active in paclitaxel- and vinblastine-resistant cell lines and on a cell line overexpressing the P-glycoprotein. Moreover, they are not or only weakly toxic on the chick embryos model and they exhibit promising theoretical physicochemical and pharmacokinetic properties in addition to respecting oral bioavailability filters. Derivatives and analogues of PUB-SOs are divided into two main families by replacing the 2-chloroethylurea moiety either by various amide groups or by different urea moieties. The antiproliferative activity of these new derivatives and analogues of PUB-SOs is generally more potent when they are substituted with a urea group than by an amide group and is between the hundred nanomolar to low micromolar. The structure-activity relationships with the most potent derivatives show that the arrest of the cell cycle progression in S phase occurs only when the aromatic ring B is substituted at position 2 by halogens or short alkyl chains; compounds bearing other substitution patterns on the aromatic ring B arrest the cell cycle progression in G2/M phase and disrupt microtubules. Moreover, the most potent compounds blocking the cell cycle progression in S phase induce the phosphorylation of the histone 2AX, a marker of the replicative stress. Alkylation kinetic assays show that their biological activity is not related to their alkylating potency. Moreover, they are not or only weakly toxic on the chick embryos model and they exhibit promising theoretical physicochemical and pharmacokinetic properties in addition to complying oral bioavailability filters. The derivatives and analogues of PIB-SOs and PUB-SO constitute new families of anticancer agents promising for further preclinical studies.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / Une personne sur trois au Canada sera affectée par une forme de cancer durant son existence. Aujourd’hui, il a été clairement démontré que les mutations dans l'information génétique sont l'événement initiateur du cancer. Les cassures double-brin de l'ADN font partie des lésions les plus dangereuses retrouvées dans les cellules puisqu'elles peuvent induire des mutations menant au cancer. La cellule possède plusieurs mécanismes pour réparer les cassures double-brin de l’ADN. La réparation par recombinaison homologue est le seul de ces mécanismes permettant aux cellules de réparer les cassures double-brin de l’ADN de manière fidèle sans créer d’autres mutations. Ce mécanisme dépend en majeure partie de la protéine RAD51 qui en catalyse les étapes essentielles. RAD51 a besoin d’autres cofacteurs appelés médiateurs, comme la protéine BRCA2, pour son fonctionnement. Récemment, PALB2 a été identifiée comme un régulateur clé de RAD51 et BRCA2, et donc de la réparation par recombinaison homologue. Les individus, avec des mutations de PALB2, possèdent une prédisposition au cancer du sein et à l’anémie de Fanconi. Le projet de mon doctorat consiste en la caractérisation biochimique de la protéine PALB2 afin de comprendre son rôle dans le contrôle et le fonctionnement de la réparation par recombinaison homologue. Nous avons montré que la protéine PALB2, comme BRCA2, est un médiateur de la recombinaison homologue. Dans les cellules, l’activité de PALB2 est contrôlée par sa dimérisation. En présence de dommages à l’ADN, la monomérisation de PALB2 provoque son activation et la stimulation de la formation du filament de RAD51. Finalement, nous avons découvert un nouveau partenaire des médiateurs PALB2 et BRCA2 : la polymérase r