Titre de l'écran-titre (visionné le 5 septembre 2023) / L'instabilité génomique est considérée comme l'une des « caractéristiques du cancer ». Au cours des dernières décennies, divers processus de réparation de l'information génétique ont été découverts, nous permettant de mieux comprendre comment la dérégulation de ces processus peuvent conduire au développement du cancer. Notre groupe de recherche s'intéresse particulièrement au processus de réparation des cassures double-brin (DSBs) de l'ADN, la forme la plus nocive de dommages à l'ADN. La jonction d'extrémités non homologues canonique (c-NHEJ) et la recombinaison homologue (HR) sont les principales voies de réparation des DSBs. Afin d'enclencher la réparation des DSBs, les cellules régulent soigneusement le choix entre ces deux processus de réparation. Le processus de résection de l'ADN facilite le choix entre ces voies de réparation. La résection de l'ADN est caractérisée par la dégradation de l'ADN pour créer un long substrat d'ADNsb favorisant la réparation par HR. En revanche, l'inhibition de la résection de l'ADN favorise la réparation des DSB par la voie c-NHEJ. Les mutations de perte de fonction des protéines impliquées dans la facilitation de la résection de l'ADN conduisent souvent à des troubles génétiques et au développement de cancers. Le développement du cancer a souvent été associé à des mutations de BRCA1, une protéine impliquée dans la résection de l'ADN et le processus de réparation des RH. La létalité synthétique est devenue un concept important dans la réparation de l'ADN et la recherche sur le cancer. Il décrit le phénomène par lequel l'inactivation simultanée de deux événements conduit à la létalité cellulaire, même si chaque événement individuellement est toléré. Le traitement contre le cancer basé sur la létalité synthétique le plus efficace qui ait été développé jusqu'à présent utilise les inhibiteurs de PARP (PARPi). PARP-1 dans une protéine impliquée dans divers processus cellulaires, dont la régulation de la réparation de l'ADN. Il a été constaté que l'inhibition de PARP-1 est synthétiquement létale avec un déficit en HR. Les tumeurs déficientes en HR, sont sensibles aux PARPi alors que leurs homologues cellulaires normaux HR-compétents tolèrent le traitement. Cependant, bien qu'il s'agisse d'une option de traitement prometteuse, de nombreux patients développent encore une résistance aux PARPi. Une façon par laquelle les tumeurs déficientes en BRCA1 développent une résistance à PARPi est la réactivation de la résection de l'ADN. En l'absence de BRCA1 fonctionnel, les inhibiteurs de la résection de l'ADN empêchent l'utilisation de HR pour la réparation des DSBs. Des mutations de perte de fonction dans ces inhibiteurs de la résection de l'ADN entraînent la réactivation de la résection de l'ADN et de la HR. Par conséquent, il est important de comprendre la relation entre les protéines qui facilitent la résection de l'ADN et celles qui l'inhibent. Avec cette compréhension, de meilleures approches pour atténuer le développement de la résistance peuvent être développées. Dans cette thèse, nous approfondissons la relation entre l'inhibition de la résection de l'ADN et le développement de la résistance aux PARPi. Nous discutons du processus de résection de l'ADN et de la façon dont divers inhibiteurs de la résection de l'ADN fonctionnent pour inhiber la réparation par RH. Nous décrivons une méthode pour développer de nouveaux inhibiteurs chimiques qui peuvent être utilisés pour cibler MRE11, une composante importante de la machinerie de résection de l'ADN. De plus, nous avons identifié un nouvel inhibiteur de la résection de l'ADN, DYNLL1, et caractérisons son rôle dans l'inhibition de la résection de l'ADN. Enfin, nous contribuons davantage à la compréhension du mécanisme d'action d'un inhibiteur connu de la résection de l'ADN, RIF1. En outre, nous identifions une nouvelle interaction synthétique létale entre RIF1 et MRE11 qui pourrait être avantageuse dans le développement d'un nouveau traitement contre le cancer avec un défaut dans l'une ou l'autre des protéines. En résumé, nous décrivons de nouveaux mécanismes d'action pour la régulation négative de la résection de l'ADN impliquant DYNLL1 et RIF1. De plus, ces résultats placent MRE11 au cœur de la régulation de la résection de l'ADN, soulignant l'importance du développement de nouveaux inhibiteurs chimiques qui le ciblent. / Genomic instability is considered to be one of the "Hallmarks of Cancer". In recent decades, research on the topic has uncovered various DNA repair processes that cells use to maintain genome stability. This has also given us a better understanding of how errors from and dysregulation of these processes can lead to cancer development. Our research group is particularly interested in the repair process for DNA double-strand breaks (DSBs), the most harmful form of DNA damage. Canonical Non-Homologous End-Joining (c-NHEJ) and Homologous (HR) Recombination are the major DSB repair pathways. In order to facilitate proper DSB repair, cells carefully regulate the choice between these two repair processes. One manner in which cells facilitate the choice between these two pathways is through the process of DNA resection. DNA resection is the degradation of DNA following DSB induction to create a long ssDNA substrate that favours HR repair. In contrast, inhibition of DNA resection favours DSB repair through the c-NHEJ pathway. Loss-of-function mutations of proteins involved in facilitating DNA resection often lead to genetic disorders and cancer development. Cancer development has often been associated with mutations in BRCA1, a protein involved in the DNA resection and HR repair process. Synthetic lethality has become an important concept in DNA repair and cancer research. It describes the phenomenon wherein the simultaneous occurrence of two events leads to unviability or lethality, in this case of the cell, even though each event individually is tolerated. In cancer research, this has been taken advantage of when developing novel treatments particularly in cancer types with a frequently occurring mutation. The most successful synthetic lethality-based cancer treatment that has been developed thus far has been PARP inhibitors (PARPi). PARP-1 in a protein involved in various cellular processes, including the regulation of DNA repair. It was found that PARP-1 inhibition is synthetically lethal with a deficiency in HR. It was found that HR-deficient tumours, especially those with a loss-of-function mutations in BRCA1, are sensitive to PARPi treatment whereas their HR-proficient normal cell counterparts tolerated the treatment. In the clinic, this meant that patients with cancers that are BRCA1-deficient can be effectively treated with PARPi. However, although a promising treatment option, many of the patients still develop PARPi resistance requiring the need for other treatment options. It has been found that one manner in which BRCA1-deficient tumours develop PARPi-resistance is through the reactivation of DNA resection. In the absence of functional BRCA1, DNA resection inhibitors prevent the use of HR for the repair of DSBs. One of the ways these tumours develop PARPi-resistance is by developing loss-of-function mutations in these DNA resection inhibitors. These mutations lead to the reactivation of DNA resection and HR. Therefore, it is important to understand the relationship between proteins that facilitate DNA resection and those that inhibit it. With this understanding, better approaches for mitigating development of resistance can be developed. To further understand the relationship between DNA resection inhibition and PARPi-resistance development, we discuss what is known in the literature about the DNA resection process and how various DNA resection inhibitors work in order to inhibit HR repair. We describe a method for developing novel chemical inhibitors that can be used to target DNA repair proteins using MRE11--an important component of the DNA resection machinery--as an example. Furthermore, we identify a novel DNA resection inhibitor, DYNLL1, and characterize its role in DNA resection inhibition. Lastly, we contribute further to the understanding of the mechanism of action of a known DNA resection inhibitor, RIF1. Furthermore, we identify a novel synthetic lethal interaction between RIF1 and MRE11 that could be advantageous in the development of novel cancer treatment with defect in either protein. In summary, we describe novel mechanisms of action for the negative regulation of DNA resection involving DYNLL1 and RIF1. Furthermore, these results put MRE11 at the heart of DNA resection regulation highlighting the importance of development of novel chemical candidates that target it.

Le cancer est une maladie majeure ayant un taux de mortalité élevé dans le monde et au Canada. C'est pourquoi notre équipe de recherche développe de nouvelles classes d'agents anticancéreux, notamment les phényl 4-(2-oxoimidazolidin-1-yl)benzènesulfonates (PIB-SOs) et les N-phényl ureidobenzènesulfonates (PUB-SOs). Les PIB-SOs et les PUB-SOs sont constitués de deux cycles aromatiques identifiés A et B reliés entre eux par un pont sulfonate. Les PIB-SOs sont principalement caractérisés par un groupement imidazolidin-2-one sur le cycle aromatique A alors que les PUB-SOs possèdent un groupement 2-chloroéthylurée ou éthylurée sur ce cycle. D'un côté, les PIB-SOs montrent une activité antiproliférative sur des cellules cancéreuses de l'ordre du nanomolaire, arrêtent le cycle cellulaire en phase G2/M et ciblent les microtubules dans le site de liaison de la colchicine (C-BS). D'un autre côté, les PUB-SOs ont une activité antiproliférative de l'ordre du bas micromolaire sur des lignées cellulaires cancéreuses. Selon leur structure, ils peuvent soit arrêter le cycle cellulaire en phase G2/M et cibler le C-BS des microtubules lorsqu'ils sont substitués en position 3, 4 et/ou 5 sur le cycle aromatique B ou soit arrêter le cycle cellulaire en phase S et cibler les mécanismes de réparation et de réplication de l'ADN lorsque le cycle aromatique B est substitué en position 2 par des halogènes ou de courtes chaînes alkyles. Les travaux de mon doctorat avaient pour objectif général d'optimiser les propriétés physicochimiques, pharmacologiques et pharmacocinétiques des PIB-SOs et des PUB-SOs. À cet effet, 187 nouveaux dérivés et analogues des PIB-SOs et des PUB-SOs ont été préparés, purifiés, caractérisés et évalués biologiquement. Les nouveaux dérivés et analogues des PIB-SOs sont divisés en neuf familles principales caractérisées par la substitution du groupement imidazolidin-2-one par un groupement lactame, imidazolidin-2,4-dione, imidazolidin-2,5-dione, éthyl 2-uréidoacétate, butyramide, éthylurée, 2-chloroéthylurée, éthylthiourée ou phénylurée. L'activité antiproliférative des familles peuvent être divisée en trois catégories : (1) très active (ordre du nanomolaire), (2) modérément active (ordre du micromolaire) et (3) peu ou non active (supérieure à 100 μM). Les familles de composés possédant le groupement lactame, imidazolidin-2,4-dione ou imidazolidin-2-one intègrent la catégorie très active. Les familles de composés ayant les groupements butyramide, éthylurée, 2-chloroéthylurée, éthylthiourée ou phénylurée sont dans la catégorie modérément active et finalement, ceux portant les groupements imidazolidin-2,5-dione ou éthyl 2-uréidoacétate sont dans la catégorie peu ou non active. Les composés les plus puissants des familles très actives et modérément actives arrêtent la progression du cycle cellulaire en phase G2/M, inhibent la polymérisation des microtubules et perturbent le cytosquelette en se liant au C-BS. Ils sont aussi actifs sur des lignées cellulaires résistantes au paclitaxel, à la vinblastine et sur une lignée cellulaire surexprimant la glycoprotéine P. Ils ne sont pas ou seulement faiblement toxiques sur le modèle d'embryons de poulet et ils montrent des propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques théoriques prometteuses en plus de respecter les filtres de biodisponibilité per os. Les dérivés et analogues des PUB-SOs sont divisés en deux familles principales en remplaçant le groupement 2-chloroéthylurée soit par différents groupements amides ou soit par différents groupements urées. L'activité antiproliférative de ces nouveaux dérivés et analogues des PUB-SOs est généralement plus puissante avec les groupements urées qu'avec les groupements amides et elle se situe entre la centaine de nanomolaire et le bas micromolaire. Les relations structure-activité des composés les plus puissants montrent que l'arrêt de la progression du cycle cellulaire en phase S survient seulement lorsque le cycle aromatique B est substitué en position 2 par des halogènes ou de courtes chaînes alkyles ; les composés ayant un autre patron de substitution sur le cycle aromatique B arrêtent la progression du cycle cellulaire en phase G2/M et perturbent les microtubules. Les composés les plus puissants arrêtant le cycle cellulaire en phase S induisent la phosphorylation de l'histone 2AX, un marqueur de stress réplicatifs. Des essais de cinétique d'alkylation démontrent que leur activité biologique n'est pas causée par leur potentiel alkylant. Les nouveaux analogues ne sont pas ou seulement faiblement toxiques sur le modèle d'embryons de poulet et ont également des propriétés physicochimiques et pharmacocinétiques théoriques prometteuses tout en respectant les filtres biodisponibilité per os. Les dérivés et analogues des PIB-SOs et des PUB-SOs composent donc de nouvelles familles d'agents anticancéreux prometteurs pour des études précliniques plus poussées. / Cancer is a major disease leading to a high mortality rate worldwide and in Canada. As a result, our research team develops new anticancer agent classes notably phenyl 4-(2-oxoimidazolidin-1-yl)benzenesulfonates (PIB-SOs) and phenyl ureidobenzenesulfonates (PUB-SOs). PIB-SOs and PUB-SOs consist of two aromatic rings named A and B connected together by a sulfonate bridge. PIB-SOs are mainly characterized by an imidazolidin-2-one moiety on the aromatic ring A while PUB-SOs bear a 2-chloroethylurea or an ethylurea on this ring. On the one hand, PIB-SOs show antiproliferative activity in the nanomolar range towards cancer cells, block cell cycle progression in G2/M phase and target microtubules in the colchicine-binding site (C-BS). On the other hand, PUB-SOs exhibit antiproliferative activity in the low micromolar on cancer cell lines. Depending on their structures, they either stop the cell cycle progression in the G2/M phase and target the C-BS of microtubules when they bear substituents at position 3, 4 and/or 5 on the aromatic ring B or they arrest the cell cycle progression in the S phase and target the DNA repair and replication mechanisms when they bear halogens or short alkyl chains at position 2 on the aromatic ring B. The general objective of my doctoral work was to optimize the physicochemical, pharmacological and pharmacokinetic properties of PIB-SOs and PUB-SOs. To this end, 187 new derivatives and analogues of PIB-SOs and PUB-SOs were prepared, purified, characterized and biologically evaluated. New PIB-SOs are divided into nine families of compounds characterized by the replacement of the imidazolidin-2-one moiety by lactam, imidazolidin-2,4-dione, imidazolidin-2,5-dione, ethyl 2-ureidoacetate, butyramide, ethylurea, 2-chloroethylurea, thioethylurea or phenylurea group. The antiproliferative activity of these families can be divided into 3 categories: (1) very active (nanomolar range), (2) moderately active (micromolar range) and (3) weakly or not active (over 100 μM). Families of compounds having a lactam, an imidazolidin-2,4-dione or an imidazolidin-2-one are in the very active category. Families bearing a butyramide, an ethylurea, a 2-chloroethylurea, a thioethylurea or a phenylurea group are in the moderately active category while those bearing an imidazolidin-2,5-dione or an ethyl 2-ureidoacetate are in the weakly or not active category. The most potent compounds of the most and moderately active families arrest the cell cycle progression in G2/M phase, inhibit microtubule polymerization and disrupt the cytoskeleton by binding to the C-BS. They are also active in paclitaxel- and vinblastine-resistant cell lines and on a cell line overexpressing the P-glycoprotein. Moreover, they are not or only weakly toxic on the chick embryos model and they exhibit promising theoretical physicochemical and pharmacokinetic properties in addition to respecting oral bioavailability filters. Derivatives and analogues of PUB-SOs are divided into two main families by replacing the 2-chloroethylurea moiety either by various amide groups or by different urea moieties. The antiproliferative activity of these new derivatives and analogues of PUB-SOs is generally more potent when they are substituted with a urea group than by an amide group and is between the hundred nanomolar to low micromolar. The structure-activity relationships with the most potent derivatives show that the arrest of the cell cycle progression in S phase occurs only when the aromatic ring B is substituted at position 2 by halogens or short alkyl chains; compounds bearing other substitution patterns on the aromatic ring B arrest the cell cycle progression in G2/M phase and disrupt microtubules. Moreover, the most potent compounds blocking the cell cycle progression in S phase induce the phosphorylation of the histone 2AX, a marker of the replicative stress. Alkylation kinetic assays show that their biological activity is not related to their alkylating potency. Moreover, they are not or only weakly toxic on the chick embryos model and they exhibit promising theoretical physicochemical and pharmacokinetic properties in addition to complying oral bioavailability filters. The derivatives and analogues of PIB-SOs and PUB-SO constitute new families of anticancer agents promising for further preclinical studies.

L'ADN, support de l'information génétique, subit chaque jour de nombreuses attaques pouvant induire différents types de lésions. Que ce soit d'origine environnementale (agents chimiques), rayonnements ionisants) ou d'origine endogène (métabolisme de L'ADN, radicaux libres), chacun de ces agents peut provoquer des cassures simple ou double-brin dans la molécule d'ADN. Ces lésions doivent être détectées rapidement et réparées fidèlement, afin d'éviter d'engendrer une mutation pouvant déclencher une maladie telle le cancer, ou encore éviter de se transmettre à la descendance. Au cours de l'évolution, la cellule eucaryote a développé différentes voies spécifiques pour répondre à un stress génotoxique. Ainsi il existe un véritable réseau de surveillance et d'évaluation des dommages permettant à la cellule lésée de réparer l'ADN ou d'entrer en apoptose si les dommages sont trop importants. La poly(ADP-ribosyl)ation des protéines est une modification post-traductionnelle qui intervient rapidement dès qu'une cassure dans la molécule d'ADN est détectée. Le polymère est synthétisé à partir du NAD+ par une famille d'enzymes appelées PARP (poly(ADP-ribose)polymérase), dont le rôle principal est la maintien de l'intégrité du génome. Cette modification affecte les propriétés physico-chimiques ainsi que la fonction des protéines cibles. Celle-ci permet, entre autre, le recrutement des enzymes de réparation de l'ADN. Ce signal demeure toutefois transitoire, le polymère formé étant rapidement dégradé par la PARG (poly(ADP-ribose)glycohydrolase. Ce travail présente une analyse structurale de la PARP-3, un membre peu caractérisé de la famille PARP, ainsi qu'une analyse fonctionnelle de mutants de phosphorylation de la PARP-1 (premier article) qui montre que la phosphorylation du premier doigt de zinc de cette protéine altère son recrutement et sa persistance aux sites de cassure de l'ADN. Par ailleurs, de nombreuses évidences montrent que que la poly(ADP-ribosyl)ation des protéines peut survenir dans un contexte autre que les dommages à l'ADN, le second article présente les métabolismes qui peuvent être associés aux PARP-1 et 2 ainsi qu'à la PARG et monte un possible nouveau rôle biologique pour la PARP-1.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / Divers évènements d’épissage alternatif ont été identifiés pour certains gènes de la famille FANC, notamment pour FANCE. La voie de réparation de l’ADN FANC-BRCA nécessite l’intégrité de l’ensemble des protéines Fanconi afin d’assurer l’efficacité de la réparation des pontages inter-brins. Nous avons alors étudié l’impact de l’expression du variant d’épissage alternatif FANCE∆4 au niveau de la voie FANC-BRCA. Son expression exclusive dans des cellules déficientes en FANCE (EUFA130) n’est pas suffisante pour restaurer l’activation de la voie de réparation. À la suite d’un traitement avec un agent pontant (mitomycine C), les cellules EUFA130 complémentées avec FANCE∆4 demeurent bloquées en phase G2/M du cycle cellulaire, la viabilité n’est pas augmentée et la monoubiquitination de FANCD2 et FANCI est absente, contrairement aux cellules EUFA130 complémentées avec FANCE. Ce projet a particulièrement permis de déterminer que FANCE∆4 n’est pas en mesure de se substituer lors de la perte de FANCE. / Several alternative splicing events were identified for some genes of the FANC family, such as FANCE. The integrity of the proteins of the FANC-BRCA DNA repair pathway is necessary to maintain efficient ICL repair. We studied the impact of the expression of an alternative splicing isoform, FANCE∆4. Its exclusive expression in FANCE-deficient cells (EUFA130) is not sufficient to restore the activation of the pathway. Following treatment with crosslink agent (mitomycin C), EUFA130 cells complemented with FANCE∆4 are blocked in G2/M phase of the cell cycle, the viability is not increased and the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI is absent, in contrast to EUFA130 cells complemented with FANCE. This project highlights FANCE∆4 that cannot replace FANCE in regard to DNA repair.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / Une personne sur trois au Canada sera affectée par une forme de cancer durant son existence. Aujourd’hui, il a été clairement démontré que les mutations dans l'information génétique sont l'événement initiateur du cancer. Les cassures double-brin de l'ADN font partie des lésions les plus dangereuses retrouvées dans les cellules puisqu'elles peuvent induire des mutations menant au cancer. La cellule possède plusieurs mécanismes pour réparer les cassures double-brin de l’ADN. La réparation par recombinaison homologue est le seul de ces mécanismes permettant aux cellules de réparer les cassures double-brin de l’ADN de manière fidèle sans créer d’autres mutations. Ce mécanisme dépend en majeure partie de la protéine RAD51 qui en catalyse les étapes essentielles. RAD51 a besoin d’autres cofacteurs appelés médiateurs, comme la protéine BRCA2, pour son fonctionnement. Récemment, PALB2 a été identifiée comme un régulateur clé de RAD51 et BRCA2, et donc de la réparation par recombinaison homologue. Les individus, avec des mutations de PALB2, possèdent une prédisposition au cancer du sein et à l’anémie de Fanconi. Le projet de mon doctorat consiste en la caractérisation biochimique de la protéine PALB2 afin de comprendre son rôle dans le contrôle et le fonctionnement de la réparation par recombinaison homologue. Nous avons montré que la protéine PALB2, comme BRCA2, est un médiateur de la recombinaison homologue. Dans les cellules, l’activité de PALB2 est contrôlée par sa dimérisation. En présence de dommages à l’ADN, la monomérisation de PALB2 provoque son activation et la stimulation de la formation du filament de RAD51. Finalement, nous avons découvert un nouveau partenaire des médiateurs PALB2 et BRCA2 : la polymérase r

L'intégrité de l'ADN génomique humain est maintenue par des systèmes de réparation de l'ADN qui protègent les cellules des dommages causés par des agents environnementaux ou des lésions spontanées de l'ADN. Chaque cellule peut subir jusqu'à 10⁵ lésions par jour, y compris les cassures double-brin de l'ADN (CDB). La poly(ADPribosyl)ation (PARylation) est l'un des premiers événements de signalisation moléculaire survenant aux CDBs. Il est catalysé par les poly(ADP-ribose)polymérases (PARP) qui sont directement activées par ces lésions d'ADN. Le fait de ne pas générer de poly(ADP)ribosyl (pADPr) en réponse à des dommages à l'ADN par une inhibition chimique ou par l'absence de PARP-1 augmente la sensibilité cellulaire au stress génotoxique, indiquant que la pADPr elle-même est une molécule clé de signalisation des dommages à l'ADN. L'inhibition de l'enzyme de signalisation des dommages à l'ADN, la poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) est l'une des nouvelles thérapies les plus prometteuses contre le cancer. Les inhibiteurs de PARP sensibilisent les cellules cancéreuses aux agents endommageant l'ADN et tuent efficacement les cellules cancéreuses du sein, des ovaires et du pancréas déficientes en BRCA1 (Breast Cancer gene 1) et BRCA2 (Breast Cancer gene 2), ce qui suggère que les cellules déficientes en réparation des CDBs sont extrêmement sensibles à l'inhibition de PARP. Pourtant, les mécanismes sous-jacents à cette létalité synthétique entre le déficit de réparation du CDB et l'inhibition de PARP restent mal définis. Il y a un débat considérable sur le mécanisme par lequel l'inhibition de PARP tue les cellules déficientes en réparation de l'ADN, et le plein potentiel des inhibiteurs de PARP dans le traitement du cancer ne peut être obtenu que par une compréhension claire des voies de réponse aux dommages de l'ADN (DDR) aux CDB et comment ils sont affectés par les inhibiteurs de PARP. L'objectif général de ma thèse est d'étudier le rôle de PARP-1 dans la réparation DSB et d'identifier les interacteurs de PARP-1 qui jouent également un rôle dans ce processus. Les cellules eucaryotes réparent les CDBs par deux voies principales, la jonction d'extrémité non homologue (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR). La HR est initiée par la liaison des CDBs par BRCA1 et le complexe MRE11-RAD50-NBS1 et des nucléases EXO1/DNA2 pour générer de l'ADN simple-brin, qui est ensuite utilisé par la recombinase RAD51 et le complexe BRCA1-PALB2-BRCA2. Une question clé dans notre domaine concerne les facteurs critiques pour réguler le choix de la voie CDB. HR est initiée à partir d'extrémités DSB hautement résectées, tandis que dans le NHEJ, la résection est empêchée par des facteurs de réparation clés incluant RIF1 et 53BP1. En utilisant des cellules déficientes en PARP-1, nous avons observé que deux inhibiteurs de la résection de l'ADN et des régulateurs de choix de voie, RIF1 et 53BP1, la formation de foyers induits par des dommages à l'ADN sont fortement altérés. Cela confirme notre hypothèse selon laquelle PARP-1 participe à la réparation du DSB en influençant la résection de l'ADN. Afin de mieux comprendre le mécanisme de résection et le rôle que PARP-1 y joue, nous avons identifié d'autres protéines qui interagissent avec PARP-1 et modulent ce processus. Pour ce faire, nous avons utilisé des données sur les protéines de liaison au pADPr générées à la fois dans notre laboratoire et celui de notre collaborateur Ted Dawson de Johns Hopkins. Les candidats sélectionnés à partir de ces listes ont été criblés pour identifier une seule cible qui démontrerait un phénotype similaire à la perte de PARP-1. Deux cibles initiales ont été explorées et finalement une seule protéine à doigt de zinc a été choisie comme cible principale. Nous devons relever la fonction de ce doigt de zinc en HR, dans l'espoir qu'il permettra de découvrir davantage les mécanismes de PARP-1 en résection. En résumé, cette thèse élucide le rôle de PARP-1 dans la résection de l'ADN et identifie une protéine à doigt de zinc non étudiée auparavant qui interagit avec PARP-1 et partage une fonction similaire à PARP-1 dans la résection de l'ADN. / The integrity of human genomic DNA is maintained by DNA repair systems that will protect cells from damage by environmental agents or spontaneous DNA lesions. Each cell can experience up to 10⁵ lesions daily, including DNA double-strand breaks (DSB)s. Poly(ADP-ribosyl)ation (PARylation) is one of the earliest molecular signalling events occurring at DNA DSBs. It is catalysed by poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) that are directly activated by those DNA lesions. Failure to generate pADPr in response to DNA damage by either chemical inhibition or absence of PARP-1 increases the cellular sensitivity to genotoxic stress, indicating that pADPr itself is a key DNA damage signalling molecule. Inhibition of the DNA damage signalling enzyme poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) is among the most promising new therapies in cancer. PARP inhibitors sensitize cancer cells to DNA damaging agents and efficiently kill BRCA1- and BRCA2-deficient breast, ovarian and pancreatic cancer cells, suggesting that cells deficient in DSB repair are exquisitely sensitive to PARP inhibition. Yet, the mechanisms underlying this synthetic lethality between DSB repair deficiency and PARP inhibition remain poorly defined. There is considerable debate about the mechanism through which PARP inhibition kills DNA repair-deficient cells, and the full benefit of PARP inhibitors in cancer therapy can only be achieved by a clear understanding of the DNA damage response (DDR) pathways to DSBs and how these are affected by PARP inhibitors. The overall aim of my PhD is to investigate the role of PARP-1 in DSB repair and identify interactors of PARP-1 which also play a role in this process. Eukaryotic cells repair DSBs by two major pathways, non-homologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). HR is initiated by the binding of DSB by BRCA1 and the end resection of the DSB by MRE11 (and the associated NBS1, RAD50, CtIP, and EXO1) to generate single-stranded DNA, which is further processed by RAD51 and BRCA1-PALB2-BRCA2. A key question in our field regards which factors are critical for regulating the DSB pathway choice. HR is initiated from highly resected DSB ends, whereas in NHEJ, resection is prevented by key repair factors that include RIF1 and 53BP1. Using PARP-1-deficient cells, we have observed that two inhibitors of DNA resection and regulators of pathway choice, RIF1 and 53BP1, are strongly impaired in forming DNA damage-induced foci. This supports our hypothesis that PARP-1 participates in DSB repair by influencing DNA resection. In order to further understand the mechanism of resection and the role that PARP-1 plays in it we also aim to identify other proteins which interact with PARP-1 and modulate this process. To accomplish this, we made use of data on PAR binding proteins generated both in our lab and that of our collaborator Ted Dawson. The candidates selected from these lists were screened to identify a single target that would demonstrate a similar phenotype to PARP-1 loss. Two initial targets were further explored and finally a single zinc finger protein was selected as our primary target. We aim to characterize the function of this zinc finger in HR, in the hopes that it will further uncover the mechanisms of PARP-1 in resection. In summary this thesis elucidates the role of PARP-1 in DNA resection and identifies a previously unstudied zinc finger protein which interacts with PARP-1 and shares a similar function to PARP-1 in DNA resection.

HHV-6B, l'agent étiologique de la roséole infantile, infecte près de 90% de la population mondiale avant l'âge de 2 ans. Comme d'autres herpèsvirus, HHV-6B établit une latence à long terme dans la cellule hôte. Cette latence est toutefois distinguée des autres herpèsvirus par l'intégration du génome viral dans les télomères des cellules infectées. HHV-6B peut être hérité lorsque son génome est intégré dans des cellules germinales et a été identifié comme un agent prédisposant à l'angine de poitrine et à la prééclampsie chez la femme enceinte. Des séquences homologues aux télomères situées dans le génome de HHV-6B sont essentielles à l'intégration, cependant les mécanismes moléculaires sous-jacents sont inconnus. Puisque l'intégration du génome viral requiert la présence de séquences homologues, nous avons étudié la relation entre HHV-6B et la machinerie de réparation de l'ADN. Nos travaux démontrent que le virus inhibe la signalisation de réparation des cassures double brin de l'ADN dans les cellules infectées. Plus précisément la protéine immédiate précoce 1 (IE1) de HHV-6B récapitule à elle seule les effets inhibiteurs observés en termes d'infection. Nous avons pu démontrer que les fonctions de la protéine cellulaire NBS1, un acteur initial de la signalisation des dommages à l'ADN, sont inhibées par IE1, ce qui empêche ainsi l'activation de la kinase ATM et la phosphorylation du marqueur de dommage d'ADN H2AX. Nous avons aussi constaté une interaction entre IE1 et NBS1 et caractérisé leur domaine d'interaction. Nos résultats démontrent donc que HHV-6B affecte la machinerie de réparation de l'ADN, mais la raison est toutefois encore inconnue et nécessite davantage d'étude.

Les cassures double-brin de l'ADN, lorsque incorrectement réparées, peuvent avoir des conséquences fatales telles que des délétions et des réarrangements chromosomiques, favorisant la carcinogenèse. La poly(ADP-ribosyl)ation réalisée par la protéine poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) est l'une des premières modifications post-traductionnelles qui se produisent en réponse aux dommages à l'ADN. La PARP-1 utilise la nicotinamide pour générer un polymère chargé négativement, nommé poly(ADP-ribose) polymère (PAR), lequel est attaché en majorité à la PARP-1 elle-même ainsi qu'à d'autres protéines cibles. Le PAR a récemment été reconnu comme un signal de recrutement pour certaines protéines de réparation aux sites de dommages à l'ADN, mais un débat est en cours quant au rôle précis de la PARP-1 et du PAR dans la réponse aux dommages de l'ADN. Au cours de mon projet de doctorat, nous avons pu confirmer que les protéines qui se retrouvent en complexe avec le PAR immédiatement après les dommages à l'ADN sont principalement des facteurs de réparation. Étonnamment, les complexes protéiques associés au PAR pendant la période de récupération suite aux dommages sont enrichis en facteurs de liaison à l'ARN. Toutefois, la protéine liant l'ARN la plus abondante que nous avons détectée dans l'interactome du PAR, soit NONO, ne suit pas cette dernière cinétique puisqu'elle est fortement enrichie immédiatement après les dommages à l'ADN. Notre étude subséquente de NONO dans la réponse aux cassures double-brin de l'ADN a étonnamment révélé une implication directe de celle-ci par le mécanismede réparation de jonction des extrémités non-homologues. En plus, nous avons constaté que NONO se lie fortement et spécifiquement au PAR via son motif 1 de la reconnaissance de l'ARN, soulignant la compétition entre les PAR et l'ARN pour le même site de liaison. Fait intéressant, le recrutement in vivo de NONO aux sites de dommages de l'ADN dépend entièrement du PAR et nécessite le motif 1 de la reconnaissance de l'ARN. En conclusion, nos résultats établissent NONO comme une nouvelle protéine impliquée dans la réponse aux cassures double-brin de l'ADN et plus généralement démontrent un autre niveau de complexité supplémentaire dans l'interdépendance de la biologie de l'ARN et la réparation de l'ADN. / DNA double-strand breaks are potentially lethal lesions, which if not repaired correctly, can have harmful consequences such as carcinogenesis promoted by chromosome deletions and rearrangements. Poly(ADP-ribosyl)ation carried out by poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) is one of the first posttranslational modifications occurring in response to DNA damage. In brief, PARP-1 uses nicotinamide to generate a negatively charged polymer called poly(ADP-ribose) polymer (PAR), that can be attached to acceptor proteins, which is to a large extent PARP-1 itself. PAR has recently been recognized as a recruitment signal for key DNA repair proteins to sites of DNA damage but the precise role of PARP-1 and its catalytic product PAR in the DNA damage response are still a matter of ongoing debate. Throughout my doctoral work, we confirmed that the proteins in complex with PAR promptly after DNA damage are mostly DNA repair proteins, whereas during the period of recovery from DNA damage, the PAR interactome is highly enriched with RNA processing factors. Interestingly, one of the most abundant RNA-binding proteins detected in the PAR interactome, namely NONO, did not follow these kinetics as it was highly enriched immediately after DNA damage in the DNA repair protein complexes centered on PAR. Our subsequent investigation of NONO in the DNA damage response to double-strand breaks strikingly revealed a direct implication for NONO in repair by nonhomologous end joining (NHEJ). Moreover, we found that NONO strongly and specifically binds to PAR through its RNA-recognition motif 1 (RRM1), highlighting competition between PAR and RNA for the same binding site. Remarkably, the in vivo recruitment of NONO to DNA damage sites completely depends on PAR and requires the RRM1 motif. In conclusion, our results establish NONO as a new protein implicated in the DNA damage response to double-strand break and in broader terms add another layer of complexity to the cross-talk between RNA-biology and DNA repair.

L’anémie de Fanconi (FA) est une maladie congénitale rare résultant d’une mutation sur chaque allèle parental d’un gène FANC. Nous avons récemment identifié un variant d'épissage de FANCL contenant une exclusion de l'exon 4. Une analyse par minigène nous a permis de démontrer que le polymorphisme de séquence (SNP) rs7958831 augmente substantiellement le saut de l'exon 4 de FANCL, et que les porteurs de ce SNP ont une quantité significativement plus élevée de transcrits FANCL∆4. L'étude de fractions ribosomales nous a permis de confirmer que le transcrit alternatif est bel et bien traduit en protéine. Toutefois, une protéine de fusion FANCL∆4-GFP ne migre pas au noyau comme le fait FANCLwt-GFP. L'isoforme FANCL∆4 n'est pas en mesure d'accomplir la fonction principale de FANCL, soit de monoubiquitiner FANCD2. De plus, des cellules EUFA868 déficientes en FANCL complémentées avec FANCL∆4 ne retrouvent pas leur phénotype normal en test de survie et ont une proportion plus importante bloquée en phase G2/M. Ces résultats nous permettent de penser que le SNP rs7958831 pourrait moduler le risque de cancer du sein puisque l'isoforme FANCL∆4 ne semble pas fonctionnelle.

L'exposition via l'eau potable à des concentrations élevées d'arsenic (>10 ug/L), est mondialement répandue et s'associe à de sévères pathologies dont certains cancers. Un mécanisme sous-jacent implique l'altération de la capacité de réparation de l'ADN (CRA), un important modulateur de la susceptibilité au cancer. Notre but était d'élaborer une méthode d'évaluation de la CRA et d'estimer son applicabilité à l'étude de la CRA de 102 résidents de Chaudière-Appalaches (Québec, Canada) chroniquement exposés à différentes concentrations d'arsenic dans l'eau (0.01-140 ug/L). Deux tests in vitro ont été développés, pour évaluer la réparation par excision/resynthèse d'ADN, de lymphocytes congelés et non-stimulés. Les mesures dans notre échantillon indiquent 42% des individus montrant une activité de réparation in vitro ralentie; l'absorption d'As3+ était négativement corrélée avec la proportion d'individus à l'activité ralentie (p = 0.0155). Nos résultats suggèrent que ces tests permettraient d'évaluer la CRA dans le cadre d'études épidémiologiques de carcinogénèse environnementale.