In der heutigen Zeit sind ca. 4000 Verbindungen bekannt, denen die Fähigkeit nachgesagt wird, eine Kontaktallergie auslösen zu können. Die Entscheidung, ob ein Stoff hautsensibilisierende Eigenschaften besitzt, wird dabei meist auf der Grundlage von Beobachtungen am Menschen und/oder von tierexperimentellen Befunden getroffen. Bedingt durch den vermehrten Einsatz exotischer Pflanzen und neu entwickelter synthetischer Substanzen im Bereich der Kosmetikindustrie besteht der Bedarf an einer einfachen Methode zur Vorhersage des kontaktallergenen Potentials einer Verbindung. Als zentraler Schritt bei der Manifestierung einer Kontaktallergie wird die Bildung eines Hapten-Carrier-Komplexes aus dem niedermolekularen Kontaktallergen (Hapten) und Hautproteinen (Carrier) angesehen. Zur Abschätzung der Sensibilisierungsfähigkeit kann daher auch die Reaktivität der Substanz oder ihrer Metaboliten gegenüber Proteinen herangezogen werden. Im Rahmen dieser Arbeit werden neben dem bedeutenden Phytoekzematogen Tulipalin A die bisher wenig untersuchten kontaktallergenen Duftstoffe Geraniol, 7-Hydroxycitronellal, Benzaldehyd, Salicylaldehyd, Vanillin, Zimtaldehyd, a-Amyl-zimtaldehyd und Benzylcinnamat hinsichtlich ihrer Reaktivität gegenüber peptidgebundenen Aminosäuren untersucht. Verwendet werden für diese Modellversuche Hippuryl-Derivate und Acetyl-Derivate der Aminosäuren Lysin, Histidin, Arginin bzw. Cystein sowie zusätzlich Glutathion. Die dabei gewählten Bedingungen sollen eine Adaption an physiologische Gegebenheiten erlauben. Ziel ist es, zu klären, ob die mit diesen Modellversuchen zu gewinnenden Ergebnisse mit dem bekannten kontaktallergenen Potential der eingesetzten Haptene korrelieren und somit geeignet sind, die Sensibilisierungsfähigkeit einer Substanz vorherzusagen. Über Konjugationsprodukte von Kontaktallergenen mit Peptiden oder Proteinen ist in der Literatur sehr wenig bekannt. Daher ist es ein weiteres Ziel dieser Arbeit, individuelle Produkte der Reaktionen der kontaktallergenen Substanzen mit den nukleophilen Aminosäureseitenketten zu isolieren und zu charakterisieren, um so definierte Hapten-Carrier-Konjugate, die unter physiologisch relevanten Bedingungen entstehen können, zu beschreiben. Aufbauend auf den gefundenen Strukturen sollte es auch möglich sein, Hinweise auf eventuelle Reaktionsmechanismen zu erhalten.

Peanut, a major allergenic food, has life-threatening potential and is difficult to be totally avoided due to its common use in processed foods. Thermal processing can influence the allergenic properties of peanuts. However, the kinetics of the reactions caused by thermal processing has not been characterized. In our study, kinetics of the commonly used thermal processing methods on a commercial peanut cultivar (Virginia) using five time intervals was conducted. Water-soluble and SDS-sample buffer soluble proteins were extracted sequentially, and analyzed by sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and western-blot using human plasma containing IgE antibodies. The relationships between thermal processing (time) and log transformed water-soluble/total extractable major allergen content could be explained by a simple linear regression kinetic model for most of the processing methods (except high-pressure steaming). Among all the methods with optimal processing point, frying for 6 min had relatively lower IgE binding (linear epitopes) ratio may be due to the fact that this processing condition causing break down, cross-linking and aggregation of Ara h 2, and relatively lower solubility. Besides thermal processing, enzymatic processing also is considered to be an effective method in the allergenicity of peanuts. Eleven peanut lines (Coded MS-1~MS-11, MS-9 is the check and a common cultivar namely Valencia) were pre-screened from 122 peanut lines harvested in 2015 for allergen levels. These pre-screened lines were re-planted in 2016 for further analysis. One line, MS-7, was selected for lower Ara h 1 (8.5-9.5% of total protein) and Ara h 2 (4.2-6.6% of total protein) content in 2015 and 2016. Roasted MS-9 (check) peanut powders were used for enzymatic treatment for enzyme selection. A first order kinetic reaction model was conducted to describe the relationship between enzyme concentration (0-400AzU/g) and IgE-binding property reduction. Among eight food-grade enzymes, bromelain, papain and ficin hydrolysates had lower IgE-binding properties in terms of high IgE-binding property reducing rate (K, ≥ 0.4) and were selected for the following study. MS-7 (selected) & MS-9 (at level of 200AzU/g) hydrolyzed by three selected enzymes (200AzU/g) were used for IgE binding property comparison, TGase crosslinking and functional properties study. After hydrolyzed by the selected enzymes (200 AzU/g), the emulsion and foaming stabilities were decreased. Emulsion and foaming stabilities were increased in TGase (5U/g protein) crosslinked hydrolysates, which were even higher than soy protein isolate (SPI). The IgE-binding properties of TGase treated hydrolysates were similar to the hydrolysates without TGase treatment. MS-7 hydrolysates (with/without TGase) possessed less IgE-binding properties and similar functionality as compared with MS-9 hydrolysates.

Grund der Studie: Landwirte tragen eines der höchsten Risiken an berufsbedingtem Asthma zu erkranken, wobei die Allergene vom Rind eine entscheidende Rolle spielen. Das Wissen bezüglich Risikoprofile und Prävention ist sehr gering. Es herrscht aber eine Diskrepanz zwischen klinischer und Labordiagnostik, d.h. eindeutige klinische Reaktionen finden keine Bestätigung durch Allergietestung mit kommerziellen Extrakten. Patienten berichten auch, unterschiedliche Reaktionen auf unterschiedliche Rassen zu zeigen. Noch gibt es aber keine Studien zu rassespezifischen Unterschieden.Ziel der vorliegenden Arbeit: Vergleich verschiedener Extrakte (kommerzielle und eigene) mittels SDS-Page und dem Vergleich der erhaltenen Proteinmuster. Die eigenen Extrakte berücksichtigen die verschiedenen Rinderrassen der betroffenen Landwirte in Süd- und Norddeutschland. Und Nachweis eines möglichen individuellen Sensibilisierungsmusters der betroffenen Landwirte unter Berücksichtigung dieser beschwerdeauslösenden Rinderrassen.Klinische Aspekte: Untersuchung mit den Seren von 42 symptomatischen Landwirten (16 weibliche und 26 männliche Landwirte im Alter zwischen 25 und 74 Jahren), aus dem norddeutschen (Niedersachsen) sowie dem süddeutschen (Bayern und Baden-Württemberg) Raum kommend. Alle hatten eindeutigen klinischen Symptomen der Rinderhaarallergie.Material und Methoden: Die verwendeten Rinderhaare für diese Untersuchungen stammen von eigenen Tieren der erkrankten Landwirte oder, wenn die Rinderhaltung bereits aufgegeben war, von Haaren reinrassiger Rinder aus Zuchthöfen verwendet. Insgesamt wurden Haare von 8 Rinderrassen verwendet.Durchführung: In durchgeführten Voruntersuchungen wurde die Spezifität dieser Immunblotexperimente durch Negativkontrollen nachgewiesen (Probanden mit RAST-Klasse 0, ohne keine klinische Allergiesymptomatik, immer in der Stadt gelebt, keine Tierhaltung) Die Proteine wurden von Rinderhaaren extrahiert, der Proteingehalt der Lösung bestimmt und anschließend erfolgte die Durchführung von SDS-Page und Immunblot. Die Reaktivität zwischen kommerziellen Extrakten und den selbst hergestellten Extrakten konnte so verglichen und mit auch dem Proteinangebot verglichen werden. Dieses Procedere für jeden Landwirt durchgeführt.Ergebnisse: Die Auswertung der SDS-Polyacrylamid-Gele ergab keine relevanten Unterschiede innerhalb der kommerziellen Extrakte und nur geringe Differenzen zwischen den einzelnen Extrakten I bis IV. Die Färbungen fanden sich eher im Nierdermolekularbereich und bei 20 kDa (Bos d2). Es konnten auch keine relevanten Unterschiede innerhalb der selbst hergestellten Extrakte dargestellt werden, aber zum Teil deutliche Differenzen zwischen den unterschiedlichen Rassen. Die am intensivsten gefärbten Banden für alle Extrakte waren auch bei 20 kDa (Bos d 2). Ebenfalls intensive Färbungen für alle Extrakte lagen im Molekulargewichtsbereich von 20 bis 28 kDa. Deutliche Unterschiede zwischen den einzelnen Rassen konnte im Molekulargewichtsbereich von << 14 und < 14 kDa und zwischen 30 und 67 kDa (also im niedrigen und mittleren MW) dargestellt werden. Ein wichtiges Ergebnis dieser Studie ist der Nachweis, dass 32 % der Landwirte mit eindeutigen Symptomen einer Rinderhaarallergie, aber negativer klinischer Diagnostik mittels kommerzieller Extrakte im Immunblot Reaktionen ihres Serums mit den selbst hergestellten Extrakten zeigen. Des Weiteren bestätigen die erlangten Ergebnisse auch die hohe allergologische Relevanz der in der Literatur beschriebenen Proteine bei 20 und 22 kDa, zeigen aber auch für die selbst hergestellten Extrakte eine immunologische Reaktion in anderen Molekulargewichtsbereichen. Die eingangs aufgestellte Hypothese eines möglicherweise rassespezifischen Sensibilisierungsmusters lässt sich dagegen nicht aufrechterhalten. Rassespezifische Unterschiede konnten sich keiner bestimmten Systematik zuordnen lassen, eher individuelle Sensibilisiereungsmuster ohne Bezug zur Rasse. Hypothese: In den kommerziellen Extrakten sind nicht mehr alle für eine Sensibilisierung relevanten Proteine repräsentiert oder haben durch eine mögliche Procezierung bei der Herstellung ihre immunologische Reagibilität eingebüßt.

Les maladies allergiques sont de plus en plus fréquentent. Elles atteignent souvent l’enfant jeune chez qui l’allergie respiratoire et l’allergie alimentaire sont les principales pathologies. L’unique traitement curatif est l’immunothérapie spécifique d’antigène (ITA), largement développée dans l’allergie respiratoire et encore à ses débuts dans l’allergie alimentaire. Pour adapter au mieux la prise en charge du patient, le diagnostic précis de l’allergie est indispensable et il n’existe actuellement pas d’examen biologique totalement fiable. Seul, la présence d’IgE spécifiques permet de diagnostiquer une sensibilisation à un allergène mais pas une allergie cliniquement symptomatique. Dans une première partie, nous avons étudié l’intérêt d’un test fonctionnel, l’ELISpot (Enzyme-linked immunosorbent spot), dans le diagnostic de l’allergie aux acariens chez l’enfant asthmatique. Le nombre de lymphocytes T circulants spécifiques d’acariens sécréteur d’interleukine (IL)-4 ou d’IL-13 était associé à la présence d’une allergie symptomatique, indépendamment des IgE spécifiques. Il était plus élevé dans le cas d’une rhinite allergique sévère et plus faible dans le cas d’une rhinite allergique légère. De plus, il variait au cours de l’année en fonction des saisons avec un pic en automne et un pic en début de printemps. Dans une deuxième partie, nous avons étudié l’intérêt de l’ELISpot dans le diagnostic de l’allergie au lait de vache chez l’enfant, confirmée par un test de provocation orale en double aveugle. Nous avons décrit que le nombre de lymphocytes T spécifiques de la caséine et sécréteurs d’IL-4 et d’IL-13 était associé à l’allergie au lait de vache avec une sensibilité de 100%. Par ailleurs, le nombre de lymphocytes T spécifiques de la caséine était également associé à la dose maximale de lait tolérée par l’enfant.Enfin, dans une troisième partie, nous avons étudié la réponse lymphocytaire T au cours d’une ITA sub-linguale (SLIT) d’une part et sous-cutanée (SCIT) d’autre part, chez des enfants asthmatiques allergiques aux acariens suivis pendant une année. Nous avons décrit une diminution des lymphocytes Th2 (sécréteurs d’IL-4 et IL-13) spécifiques d’acariens après 12 mois de SLIT associée à une augmentation des cellules sécrétrices d’IL-10 (Tr1) spécifiques d’acariens après 6 mois de SLIT. De plus, les lymphocytes T régulateurs (CD4+CD25hiCD127loFoxp3+) étaient augmentés après 12 mois de SCIT. Nous n’avons pas retrouvé de production accrue d’interféron γ (IFNγ) par les lymphocytes T spécifiques d’acariens au cours de la désensibilisation.Au total, ce travail nous a permis de décrire qu’un test fonctionnel, l’ELISpot, permet de réaliser un diagnostic fiable de l’allergie aux acariens et de l’allergie au lait de vache chez l’enfant. Par ailleurs, l’ITA induit une diminution des cellules Th2 et une augmentation des cellules Tr1 par voie sub-linguale ainsi qu’une augmentation des Treg Foxp3+ par voie sous-cutanée sans immunodéviation Th2/Th1, chez l’enfant allergique aux acariens. / Allergic diseases are steadily increasing steadily and especially in children. Allergen specific immunotherapy (desensitization) is the only curative treatment for which accurate diagnosis of allergy is essential. Currently, the presence of specific IgE diagnoses a sensitization to an allergen but not a clinically symptomatic allergy. In a first part, we studied the value of a functional test, the ELISpot (Enzyme-linked immunosorbent spot) in the diagnosis of allergy to house dust mites (HDM). The number of circulating HDM-specific IL-4 and IL-13 secreting T cells was associated with the presence of symptoms, regardless of specific IgE and was higher in severe rhinitis than in mild rhinitis. In addition, it varied according to the season with a peak in autumn and a peak in early spring (wet periods with greater allergen exposure). In a second part, we studied the value of ELISpot for the diagnosis of cow's milk allergy in children, confirmed by double blind placebo control food challenge. We found that the number of casein-specific IL-4 and IL -13 secreting T-cells was associated with allergy to cow's milk. It was also inversely correlated to the cow’s milk tolerated cumulative dose. Receiver-operating characteristic (ROC) curve of combined IL-4 and IL-13 analysis was generated. AUC was 0,98 (95% CI 0.90-1.06). For a cut-off of 10 IL-4- and 12 IL-13 secreting T-cells, sensitivity and negative predictive value were 100%.Finally, in the third part, we monitored antigen specific T-cell response in HDM allergic children treated with sublingual ITA (SLIT) on the one hand and subcutaneous ITA (SCIT) on the other hand, during one year. We found a decrease in HDM specific Th2 cells after 12 months of SLIT associated with an increase in HDM specific IL-10 secreting T-cells after 6 months of SLIT. In addition, regulatory T cells (CD4 + CD25hiCD127loFoxp3+) were increased after 12 months of SCIT. In conclusion, this work has allowed us to describe a functional test, the ELISpot, as a reliable tool for the diagnosis of mite allergy and cow's milk allergy in children. In addition, in HDM allergic children, a decrease of Th2 cells and an increase of IL-10 secreting T-cells was found in children treated with SLIT to HDM as well as an increase in Foxp3+ Treg in children treated with SCIT.

L’allergie de contact est une pathologie de la peau particulièrement répandue dans les pays industrialisés. Aucune thérapie ne permet actuellement de la soigner et seule l’éviction de l’allergène permet de la prévenir. Historiquement, l’évaluation du potentiel sensibilisant des molécules mises sur le marché a toujours été réalisée au moyen de tests sur l’animal. Cependant, le champ d’action de ces tests est aujourd’hui limité en raison de la nouvelle législation européenne sur les cosmétiques. Dans ce contexte, le développement de méthodes alternatives ne reposant pas sur l’utilisation d’animaux devient capital. L’allergie de contact repose sur une étape chimique clé : la formation d’un complexe antigénique allergène-protéine capable d’activer le système immunitaire cutané. Le but de ce travail de thèse a été d’étudier le comportement in situ d’allergènes au sein d’épidermes reconstruits de type SkinEthic®. A l’aide d’une technique d’analyse non invasive, la spectroscopie RMN HRMAS, il a été possible de suivre le devenir de différents allergènes, de leur éventuelle activation par voie métabolique, jusqu’à leur fixation sur les protéines épidermiques. / Contact dermatitis is a skin pathology particularly prevalent in industrialized countries. No therapy currently exists and only complete avoidance of the particular allergen can prevent an allergic reaction. Historically, the assessment of skin sensitisation potential of molecules placed on the market was always carried out by animal testing. However, the scope of this testing method is now limited by the new European cosmetics legislation. In this way, the development of alternative methods, not based on animal experimentation, become an important issue. Contact dermatitis results of a chemical key step: the formation of an antigenic complex allergen-protein complexe able to activate the cutaneous immune system. The aim of this PhD work was to study the in situ behaviour of allergens in reconstructed human epidermis (SkinEthic® model). By using an appropriate non-invasive analysis technique, HR-MAS NMR spectroscopy, it has been possible to study the mode of action of different allergens, from their possible activation through the metabolic pathway to the binding with epidermal proteins.