Orientador: Paulo Eduardo Martins Ribolla / Resumo: A deficiência da enzima Glicose-6-Fosfato Desidrogenase (G6PD) é uma anormalidade genética de alta prevalência populacional que resulta em uma menor reatividade do sistema de óxido-redução eritrocitário, geralmente sem repercussões clínicas; estima-se que mais de 300 milhões de pessoas são portadoras dessa alteração. A enzima é expressa em todos os tecidos e catalisa a primeira etapa da Via das Pentoses. Nas hemácias, essa via é de fundamental importância na manutenção do equilíbrio de seu estado redox e a deficiência dessa enzima pode favorecer eventos hemolíticos agudos e crônicos; e em recém nascidos, pode contribuir para o agravamento da icterícia neonatal. O diagnóstico da deficiência baseia-se na atividade enzimática, identificada através de testes quantitativos e qualitativos. Os testes qualitativos limitam-se a agrupar indivíduos em “deficientes” e “não deficientes”, já os métodos quantitativos são mais precisos na inferência dessa atividade. Estas técnicas podem necessitar de repetições dos testes para confirmação de resultados incongruentes. Por outro lado, a variante genética responsável pela deficiência pode ser precisamente reconhecida através de testes de diagnóstico molecular. O presente projeto tem como objetivo desenvolver uma metodologia de identificação molecular da variante G202A, frequentemente encontrada na população brasileira, e realizar uma comparação do custo-benefício com a metodologia de sequenciamento de Sanger. Ao todo, foram analisadas 107 amost... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency is a metabolic enzymatic defect affecting 300 million people worldwide. The enzyme is present in all tissues and catalyses the first reaction in the Pentose Phosphate pathway responsible for maintaining the redox equilibrium in red blood cell. Deficient enzyme may lead to acute and chronic haemolytic anaemia and neonatal jaundice. Diagnosis for G6PD deficiency is based on biochemical quantitative or qualitative tests. Qualitative tests only classifies subjects as “deficient” or “non-deficient”, while quantitative tests are more precise, however both biochemical approches need a confirmative assay to confirm ambiguous results. On the other hand molecular identification for the molecular variants are more accurate and precise. We developed a new molecular assay to identify the G202A molecular variant present at high frequency on Brazilian population and comparer it to Sanger sequencing. One hundred and seven peripheral blood sample were collected on filter paper. DNA extraction were performed followed by G6PD exon 4 amplification and sequencing. On-line tool “Primer1” generated allele-specific primers for TETRA-ARMS genotyping. Twenty two subjects were deficient homozygote, eighty four wild homozygote and one heterozygote. All subjects genotype were confirmed by Sanger sequencing. TETRA-ARMS costs per reaction is three times lower than Sanger sequencing. We conclude that TETRA-ARMS is a suitable protocol to detect G202A mutation on h... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Introdução: Mucopolissacaridose IVA ou Síndrome de Morquio A é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima lisossomal Nacetilgalactosamina- 6-sulfatase (GALNS), que resulta no acúmulo lisossomal dos glicosaminoglicanos: Queratan sulfato e Condroitin-6-sulfato nos tecidos causando as manifestações clínicas. Os fenótipos variam da forma clássica à forma atenuada, ambas sem comprometimento cognitivo. A prevalência de MPS IVA varia de 1/76.000 a 1/640.000 nascidos vivos. Objetivos: Analisar e caracterizar o genótipo de pacientes brasileiros com MPS IVA através de estudos de mutações no gene da GALNS, possibilitando a estimativa de frequência de mutações recorrentes e o estabelecimento um protocolo de rotina para triagem dessas mutações. Métodos: Análise molecular do gene da GALNS foi realizada em 26 pacientes brasileiros inicialmente através de PCR-ARMS para detecção de seis mutações recorrentes (p.G116S/ p.G139S/ p.L307P/ p.N164T/ p.R386C e p.S341R) seguidas pela amplificação de regiões codificantes por PCR e sequenciamento. Resultados: Essas mutações foram encontradas em 61,5% da nossa amostra, com uma frequência alélica de 55,8%. Destas, a mutação mais frequente foi p.S341R (26,9%), seguida de p.R386C (21,1%) e p.G116S (7,7%). As mutações p.N164T, p.G139S, p.L307P não foram encontradas em nossa amostra. Além destas, foi encontrada por sequenciamento do éxon 5 uma mutação nova p.C165Y. Conclusão: O protocolo usado para detecção de mutações comuns mostrou-se adequado como um screening inicial de mutações no gene da GALNS, identificando mutações em 61,5% dos pacientes e permitiu a caracterização de 55,8% dos alelos. A mutação p.S341R foi encontrada apenas em pacientes do Nordeste. A identificação de indivíduos heterozigotos nessas famílias será importante para aconselhamento genético e para estimar a prevalência da doença nessa região. Estudos adicionais para identificação da origem dessa mutação, incluindo análises de segregação e haplótipo estão em andamento, e serão avaliadas em conjunto com dados epidemiológicos. / Background: Mucopolysaccharidosis IVA or Morquio A syndrome, is an autosomal recessive disorder caused by deficiency of lysosomal enzyme Nacetylgalactosamine- 6-sulfatase (GALNS), which results in lysosomal storage of glycosaminoglycans: Keratan sulfate and Chondroitin-6-sulfate in tissues causing clinical manifestations. The phenotypes vary from the classical to attenuated form, both without cognitive impairment. The prevalence of MPS IVA ranges from 1/76.000 to 1/640.000 live births. Objective: To analyze and characterize the genotype of Brazilian patients with MPS IVA, through molecular study of mutations in the GALNS gene, enabling the estimative of frequency of recurrent mutations and the establishment of a protocol for routine screening of these mutations. Methods: Molecular analysis of GALNS gene was performed in 26 Brazilian patients initially by ARMS-PCR to detect six recurrent mutations (p.G116S/ p.G139S/ p.L307P/ p.N164T/ p.R386C and p.S341R) followed by amplification of coding regions by PCR and sequencing. Results: These mutations were found in 61.5% of our sample, which were present in 55.8% of the alleles. The most frequent mutation was p.RS341R (26.9%), followed by p.R386C (21.1%) and p.G116S (7.7%). Mutations p.N164T, p.G139S, p.L307P were not found in our sample. A novel mutation p.C165Y was found after sequencing of exon 5. Conclusion: The protocol used for detection of common mutations was shown to be adequate for a first screening of mutations at the GALNS gene, once it identified the genotype in 61.5% of patients and allowed the characterization of 55.8% of alleles. The p.S341R was found only in patients from the Northeast. The identification of heterozygous individuals within these families will be important for genetic counseling and for estimating the disease prevalence in this region. Further studies to identify the origin of this mutation, including haplotype and segregation analyses are in progress, and will be evaluated in conjunction with epidemiological data.

Introdução: Mucopolissacaridose IVA ou Síndrome de Morquio A é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima lisossomal Nacetilgalactosamina- 6-sulfatase (GALNS), que resulta no acúmulo lisossomal dos glicosaminoglicanos: Queratan sulfato e Condroitin-6-sulfato nos tecidos causando as manifestações clínicas. Os fenótipos variam da forma clássica à forma atenuada, ambas sem comprometimento cognitivo. A prevalência de MPS IVA varia de 1/76.000 a 1/640.000 nascidos vivos. Objetivos: Analisar e caracterizar o genótipo de pacientes brasileiros com MPS IVA através de estudos de mutações no gene da GALNS, possibilitando a estimativa de frequência de mutações recorrentes e o estabelecimento um protocolo de rotina para triagem dessas mutações. Métodos: Análise molecular do gene da GALNS foi realizada em 26 pacientes brasileiros inicialmente através de PCR-ARMS para detecção de seis mutações recorrentes (p.G116S/ p.G139S/ p.L307P/ p.N164T/ p.R386C e p.S341R) seguidas pela amplificação de regiões codificantes por PCR e sequenciamento. Resultados: Essas mutações foram encontradas em 61,5% da nossa amostra, com uma frequência alélica de 55,8%. Destas, a mutação mais frequente foi p.S341R (26,9%), seguida de p.R386C (21,1%) e p.G116S (7,7%). As mutações p.N164T, p.G139S, p.L307P não foram encontradas em nossa amostra. Além destas, foi encontrada por sequenciamento do éxon 5 uma mutação nova p.C165Y. Conclusão: O protocolo usado para detecção de mutações comuns mostrou-se adequado como um screening inicial de mutações no gene da GALNS, identificando mutações em 61,5% dos pacientes e permitiu a caracterização de 55,8% dos alelos. A mutação p.S341R foi encontrada apenas em pacientes do Nordeste. A identificação de indivíduos heterozigotos nessas famílias será importante para aconselhamento genético e para estimar a prevalência da doença nessa região. Estudos adicionais para identificação da origem dessa mutação, incluindo análises de segregação e haplótipo estão em andamento, e serão avaliadas em conjunto com dados epidemiológicos. / Background: Mucopolysaccharidosis IVA or Morquio A syndrome, is an autosomal recessive disorder caused by deficiency of lysosomal enzyme Nacetylgalactosamine- 6-sulfatase (GALNS), which results in lysosomal storage of glycosaminoglycans: Keratan sulfate and Chondroitin-6-sulfate in tissues causing clinical manifestations. The phenotypes vary from the classical to attenuated form, both without cognitive impairment. The prevalence of MPS IVA ranges from 1/76.000 to 1/640.000 live births. Objective: To analyze and characterize the genotype of Brazilian patients with MPS IVA, through molecular study of mutations in the GALNS gene, enabling the estimative of frequency of recurrent mutations and the establishment of a protocol for routine screening of these mutations. Methods: Molecular analysis of GALNS gene was performed in 26 Brazilian patients initially by ARMS-PCR to detect six recurrent mutations (p.G116S/ p.G139S/ p.L307P/ p.N164T/ p.R386C and p.S341R) followed by amplification of coding regions by PCR and sequencing. Results: These mutations were found in 61.5% of our sample, which were present in 55.8% of the alleles. The most frequent mutation was p.RS341R (26.9%), followed by p.R386C (21.1%) and p.G116S (7.7%). Mutations p.N164T, p.G139S, p.L307P were not found in our sample. A novel mutation p.C165Y was found after sequencing of exon 5. Conclusion: The protocol used for detection of common mutations was shown to be adequate for a first screening of mutations at the GALNS gene, once it identified the genotype in 61.5% of patients and allowed the characterization of 55.8% of alleles. The p.S341R was found only in patients from the Northeast. The identification of heterozygous individuals within these families will be important for genetic counseling and for estimating the disease prevalence in this region. Further studies to identify the origin of this mutation, including haplotype and segregation analyses are in progress, and will be evaluated in conjunction with epidemiological data.

Introdução: Mucopolissacaridose IVA ou Síndrome de Morquio A é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima lisossomal Nacetilgalactosamina- 6-sulfatase (GALNS), que resulta no acúmulo lisossomal dos glicosaminoglicanos: Queratan sulfato e Condroitin-6-sulfato nos tecidos causando as manifestações clínicas. Os fenótipos variam da forma clássica à forma atenuada, ambas sem comprometimento cognitivo. A prevalência de MPS IVA varia de 1/76.000 a 1/640.000 nascidos vivos. Objetivos: Analisar e caracterizar o genótipo de pacientes brasileiros com MPS IVA através de estudos de mutações no gene da GALNS, possibilitando a estimativa de frequência de mutações recorrentes e o estabelecimento um protocolo de rotina para triagem dessas mutações. Métodos: Análise molecular do gene da GALNS foi realizada em 26 pacientes brasileiros inicialmente através de PCR-ARMS para detecção de seis mutações recorrentes (p.G116S/ p.G139S/ p.L307P/ p.N164T/ p.R386C e p.S341R) seguidas pela amplificação de regiões codificantes por PCR e sequenciamento. Resultados: Essas mutações foram encontradas em 61,5% da nossa amostra, com uma frequência alélica de 55,8%. Destas, a mutação mais frequente foi p.S341R (26,9%), seguida de p.R386C (21,1%) e p.G116S (7,7%). As mutações p.N164T, p.G139S, p.L307P não foram encontradas em nossa amostra. Além destas, foi encontrada por sequenciamento do éxon 5 uma mutação nova p.C165Y. Conclusão: O protocolo usado para detecção de mutações comuns mostrou-se adequado como um screening inicial de mutações no gene da GALNS, identificando mutações em 61,5% dos pacientes e permitiu a caracterização de 55,8% dos alelos. A mutação p.S341R foi encontrada apenas em pacientes do Nordeste. A identificação de indivíduos heterozigotos nessas famílias será importante para aconselhamento genético e para estimar a prevalência da doença nessa região. Estudos adicionais para identificação da origem dessa mutação, incluindo análises de segregação e haplótipo estão em andamento, e serão avaliadas em conjunto com dados epidemiológicos. / Background: Mucopolysaccharidosis IVA or Morquio A syndrome, is an autosomal recessive disorder caused by deficiency of lysosomal enzyme Nacetylgalactosamine- 6-sulfatase (GALNS), which results in lysosomal storage of glycosaminoglycans: Keratan sulfate and Chondroitin-6-sulfate in tissues causing clinical manifestations. The phenotypes vary from the classical to attenuated form, both without cognitive impairment. The prevalence of MPS IVA ranges from 1/76.000 to 1/640.000 live births. Objective: To analyze and characterize the genotype of Brazilian patients with MPS IVA, through molecular study of mutations in the GALNS gene, enabling the estimative of frequency of recurrent mutations and the establishment of a protocol for routine screening of these mutations. Methods: Molecular analysis of GALNS gene was performed in 26 Brazilian patients initially by ARMS-PCR to detect six recurrent mutations (p.G116S/ p.G139S/ p.L307P/ p.N164T/ p.R386C and p.S341R) followed by amplification of coding regions by PCR and sequencing. Results: These mutations were found in 61.5% of our sample, which were present in 55.8% of the alleles. The most frequent mutation was p.RS341R (26.9%), followed by p.R386C (21.1%) and p.G116S (7.7%). Mutations p.N164T, p.G139S, p.L307P were not found in our sample. A novel mutation p.C165Y was found after sequencing of exon 5. Conclusion: The protocol used for detection of common mutations was shown to be adequate for a first screening of mutations at the GALNS gene, once it identified the genotype in 61.5% of patients and allowed the characterization of 55.8% of alleles. The p.S341R was found only in patients from the Northeast. The identification of heterozygous individuals within these families will be important for genetic counseling and for estimating the disease prevalence in this region. Further studies to identify the origin of this mutation, including haplotype and segregation analyses are in progress, and will be evaluated in conjunction with epidemiological data.