Bordetella pertussis, l’agent responsable de la coqueluche, provoque près de 200000 morts par an dans le monde. Malgré une forte couverture vaccinale, une réémergence de la maladie a été observée dans les pays développés, liée en partie à une adaptation à la pression vaccinale. Les souches capables d’échapper à la réponse immunitaire montrent des réarrangements génomiques importants, provoqués par des éléments génétiques mobiles (IS) présents en plus de 230 copies, qui pourraient impacter sur la transcription des gènes et ARN régulateurs du pathogène.Pour élucider l’impact des IS sur le transcriptome global de Bordetella pertussis, nous avons d’abord déterminé le transcriptome codant et non-codant du pathogène par des approches de séquençage d’ARN couplées à des prédictions bioinformatiques. Cette étude a permis d’identifier les structures codantes mono- et polycistroniques, incluant des structures régulatrices telles que des riboswitches, un excludon et de longs 5’ et 3’UTR chevauchants. Une cartographie de candidats ARN régulateurs non-codant a été édifiée à partir de nouveaux transcrits localisés en régions intergéniques (IGR) et de transcrits orientés en antisens de séquences codantes. Des prolongements de transcriptions des IS ont été observés, prenant leur origine de promoteurs internes à l’IS ou formés par insertion de celles-ci. Ces transcrits sont spécifiques d’une souche à l’autre du pathogène, et s’orientent en sens ou en antisens des gènes environnant, ou dans des IGR. Le potentiel caractère régulateur de ces transcrits a été étudié par la caractérisation et l’étude du mode d’action d’un ARN régulateur, BPnc264, orienté en antisens du gène de virulence fim2. / Bordetella pertussis, the causative agent of whooping cough, is responsible of more than 200000 deaths worldwide. Despite a high vaccine coverage in developed countries, a reemergence of the disease has been observed, which is in part linked to vaccine-pressure. Strains able to evade vaccine-induced immunity show high genome organization rearrangements, essentially due to mobile genetic elements (IS) present in more than 230 copies, which could impact on messenger and regulatory transcription of the pathogene.To assess the impact of IS on the global transcriptome of Bordetella pertussis, we first determined the coding and non-coding primary transcriptome by a combination of differents RNA-sequencing approaches and predictive bioinformatics analysis software packages. We identify mono- and polycistronic coding structures, including regulatories structures like riboswitches, excludon, and long overlapping 5’ and 3’UTR. A list of candidates regulating transcripts (small RNA) has been mapped from new transcripts located in intergenic regions (IGR) and transcripts oriented in antisense of annotated coding sequences. Extended transcriptions emerging from IS elements have been observed, originating from internal promoters or newly formed promoters by insertion in a specific genomic region. Those transcripts can extend in sense or in antisense of the flanking gene, or in IGR. The regulatory function of those transcripts has been studied from the characterization and the mode of action of an extended regulatory RNA, BPnc264, oriented in antisense of the virulence gene fim2.

Streptococcus agalactiae, appelé aussi Group B Streptococcus (GBS), est une bactérie commensale du tractus digestif et génital de diverses espèces animales dont l’espèce humaine. Elle représente la première cause d’infections néonatales et est aussi un pathogène émergent chez l’adulte immunodéprimé. L’objectif de ma thèse est la caractérisation fonctionnelle et mécanistique des ARNrég. J’ai étudié plus particulièrement l’ARNrég CetR (pour «cell-envelope-targeting RNA»). Il module la résistance au peptide antimicrobiens (PAM) et la virulence à travers la régulation post-transcriptionnelle de l’ARNm dltD codant une protéine de biosynthèse de l'acide D-alanyl-lipotéichoïque. La délétion de cetR induit des changements dans la morphologie cellulaire, une diminution de la formation du biofilm et de la résistance aux PAM. Une zone d’interaction, CetRdltD, de 27 nucléotides a été prédite in silico. Des mutations compensatoires chez GBS montrent que CetR interagit directement avec l’ARNm dltD et que la perturbation de la zone d’appariement est suffisante pour observer les phénotypes associés à CetR. La quantification des niveaux d’ARNm et de la protéine DltD nous a permis de montrer que CetR active la traduction de dltD et que la perturbation du duplex CetR-dltD induit une diminution spectaculaire de la protéine DltD. De plus, en utilisant un modèle murin d’infection et en quantifiant la survie des bactéries dans les macrophages, nous avons montré que CetR et DltD sont cruciaux pour la virulence de GBS. Enfin, une approche protéomique globale nous a permis de montrer que CetR joue un rôle important dans l’expression des protéines dites « moonlighting » et de certains facteurs de virulence potentiels. Cet ARNrég peut jouer un rôle important dans la capacité de S. agalactiae à s'établir dans son biotope et à exprimer ses facteurs de virulence. Enfin, les résultats de ces recherches sont des prérequis au développement de stratégies permettant de réduire le risque des infections néonatales dues à S. agalactiae. / The opportunistic pathogen group B Streptococcus (GBS) is the leading cause of neonatal infections. The aim of this work is the characterization of a 680 nt-long regulatory RNA, CetR (cell-envelope-targeting RNA). It modulates antimicrobial peptides (AMPs) resistance and virulence through posttranscriptional regulation of dltD mRNA which encodes a D-alanyl-lipoteichoic acid biosynthesis protein. Deletion of cetR leads to cell morphology changes, reduced biofilm formation and AMPs resistance. A 27 nt-long CetR-dltD interacting region is predicted in silico. Compensatory base pair exchanges in GBS demonstrate that CetR interacts directly with dltD mRNA and that disruption of this RNA pairing is sufficient to observe the CetR-associated phenotypes. By quantifying both mRNA and protein, we demonstrate that CetR enhances dltD translation and disruption of the CetR/dltD mRNA interaction results in a dramatic decrease in DltD protein. Moreover, using an infection murine model and quantifying bacterial survival in macrophages, we observe that both CetR and DltD are crucial for GBS virulence. Finally, we highlight CetR pleiotropic role in the expression of several moonlighting proteins and potential virulence factors. This regulatory RNA may play an important role in the ability of GBS to settle in its biotope and express its virulence factors.

Staphylococcus aureus est une bactérie pathogène portée par 30% de la population humaine. Cette bactérie agressive est responsable d'1/5ème des maladies acquises à l’hôpital (infections nosocomiales). Le passage d’un état commensal (portage) à un état infectieux implique le contrôle de l’expression de facteurs de virulence (toxines, adhésines…) ; ce qui nécessite un large arsenal de régulateurs bactériens comprenant des protéines (facteurs de transcription) et des ARN régulateurs (ARNrég). Parmi ces derniers, l’ARN Srn_3610_SprC est impliqué, entre autres, dans la prévention de la phagocytose et dans l’atténuation de la virulence de la bactérie. Or, cet ARN, dont l’expression est habituellement faible, se retrouve fortement exprimé durant les premières minutes de la phagocytose. Le but de cette thèse a été d’identifier les régulateurs transcriptionnels de srn_3610_sprC. SarA, un des facteurs de transcription majeur de S. aureus impliqué dans de nombreuses étapes clé de la virulence (antibiorésistance, formation de biofilm…), a été caractérisé comme le répresseur fort de l’expression de srn_3610_sprC. L’identification du site de fixation de SarA sur le promoteur de ce gène a permis de révéler un second ARNrég, Srn_9340, dont l’expression est également réprimée par SarA. Dans les 2 cas, SarA empêche la fixation de l’ARN polymérase sur leur promoteur, entrainant un faible niveau de transcription. La recherche du signal permettant l’induction de la transcription de ces gènes via le décrochage de SarA est en cours. En parallèle, les données de fixation de SarA sur ces 2 promoteurs ont permis d’identifier de nouvelles cibles de SarA. Nous poursuivrons cette recherche de cibles via une analyse à haut débit par RNASeq. / Staphylococcus aureus is a bacterial pathogen responsible for about 1/5 of health-care associated infections. Nevertheless, 30% of humans are healthy carriers of this bacterium. Switch from commensal to infectious mode requires that virulence factors (toxins, adhesins), involved in S. aureus pathogenicity, are regulated by transcription factors (TF) and small non-coding RNA (sRNA). One of these sRNA, Srn_3610_SprC, has a key-role in prevention of phagocytosis and in attenuation of S. aureus virulence. Whereas srn_3610_sprC is usually poorly expressed, its expression is up-regulated during the first minutes of phagocytosis process. The aim of this thesis was to identify TF regulating srn_3610_sprC expression. We characterized SarA, the main TF of S. aureus, as a repressor of srn_3610_sprC transcription. Following SarA binding site determination, we highlighted a second sRNA (Srn_9340) also transcriptionally repressed by SarA. For both sRNA, SarA prevents RNA polymerase binding on their promoters. The next challenge will be to determine SarA derepression signal allowing high level of sRNAs transcription. Meanwhile, researches on SarA binding sequences allowed us to identify new SarA targets. To better understand SarA functions in S. aureus (antibiotic resistance, biofilm formation), we are now initiating a global study for the determination of SarA targets.

Les organismes bactériens sont en contact direct avec leur environnement et doivent donc constamment s’acclimater aux variations de celui-ci. Pour cela, plusieurs leviers de régulations peuvent être actionnés. Récemment, la régulation post-transcriptionnelle par les ARN régulateurs a été proposée comme un mécanisme de régulation rapide et peu coûteux pour la cellule. Chez le phytopathogène Dickeya dadantii, la régulation de la virulence a quasi exclusivement été étudiée au niveau transcriptionnel et l’implication des ARN régulateurs dans la virulence reste très peu connue. Pour cela, nous avons tout d’abord étudié le rôle des chaperons à ARN dans la pathogénie de D. dadantii et mis en évidence leur implication dans de nombreux facteurs de virulence comme la production d’enzyme de dégradation de la paroi végétale. Puis, nous avons développé une nouvelle méthode d’identification d’ARN à partir de données RNA-seq. Cette méthode a été développée pour tirer profit des séquençages réalisés en paired-end, permettant de séquencer les deux extrémités d’un transcrit. Son évaluation dans sa capacité à détecter de manière précise des ARN connus a montré une performance supérieure aux méthodes de détection existantes. Enfin, cette nouvelle méthode a été appliquée sur des données de séquençage de petits transcrits. Cette analyse nous a permis d’identifier plus d’un millier d’ARN régulateurs potentiels, dont plusieurs pourraient être impliqués dans la régulation de la virulence. Ces travaux ont donc permis de mettre en lumière l’existence d’une régulation post-transcriptionnelle chez D. dadantii et de proposer des pistes concernant les acteurs et mécanismes concernés / Bacterial organisms are directly exposed to environmental conditions and have to respond to environmental stress. To do so, several regulation network are known. Recently, post transcriptional regulation with small RNAs was suggested to be a fast and cheap in energy regulation mechanism. In the phytopathogen Dickeya dadantii, investigations on pathogenic process mostly focused on its control by transcriptional regulators. Knowledge of post-transcriptional regulation of the virulence factors is still in its infancy.To this end, we first studied the impact of RNA chaperones in the virulence of D. dadantii and showed that they were involved in the regulation of several virulence factors, like production of cell wall degrading enzyme. Then, we developed a new method to detect sRNAs from paired-end bacterial RNA-seq data. This method take paired end sequencing into account, which allow the sequencing of the both ends of each fragment. A comparative assessment showed that this method outperforms all the existing methods in terms of sRNA detection and boundary precision. Finally, this method was applied to sequencing data. With this analysis, more than one thousand sRNAs has been detected, with the identification of several candidates potentially involved in virulence.Thereby, this work highlight the existence of post-transcriptionnal regulation in D. dadantii and suggest candidates and mechanisms involved in this regulation

Staphylococcus aureus (S. aureus) est un pathogène humain majeur dont l’impact sur la santé publique est majoré par les phénomènes de résistance et de tolérance aux antibiotiques. Au cours de cette thèse, nous avons identifié deux nouveaux systèmes toxine-antitoxine (STA) de type I appartenant au core génome et exprimés par S. aureus nommés sprG2/SprF2, sprG3/SprF3. Ces nouveaux STA sont homologues au STA sprG1/SprF1 localisé dans un îlot de pathogénie. Nous avons montré que des interactions croisées influençant le niveau des ARN sprG et SprF pouvaient avoir lieu entre les STA homologues sprG/SprF, mais que celles-ci n’avaient pas d’impact sur la neutralisation spécifique de chaque toxine SprG par son antitoxine SprF. Nous avons démontré que les peptides encodés par sprG2 et sprG3 sont bactériostatiques, contrairement aux peptides encodés par sprG1 qui sont bactéricides. Nous avons démontré que l’expression des ARN sprG et SprF pouvait varier en réponse à des stress environnementaux comme un stress hyperosmotique ou un stress oxydatif. Pour le STA sprG1/SprF1, nous avons démontré que l’antitoxine SprF1 pourrait participer à l’entrée en persistance de S. aureus, en atténuant la traduction globale via son association aux ribosomes. Ainsi, SprF1 est le premier exemple d’une antitoxine ARN avec une double fonction de neutralisation de la toxine sprG1 via son extrémité 3’ et de fixation aux ribosomes pour atténuer la traduction de S. aureus via son extrémité 5’. Ensemble, ces travaux de thèse suggèrent que les STA sprG/SprF seraient impliqués dans l’adaptation de S. aureus au stress antibiotique ou dans l’échappement au système immunitaire. / Staphylococcus aureus (S. aureus) is a human pathogen that causes nosocomial and community-associated infections. The antibiotic resistance and tolerance of S. aureus increase its impact on public health. During my PhD thesis, we identified two novel type I toxin-antitoxin systems (TAS) located in the core genome and expressed in S. aureus named sprG2/SprF2 and sprG3/SprF3. These TAS are homologues of the sprG1/SprF1 TAS, encoded in a pathogenicity island. We showed that cross-interactions affecting sprG and SprF RNA level can occur between sprG/SprF homologous TAS, but without any impact on the specific neutralization of a sprG toxin by its SprF antitoxin. We demonstrated that overexpression of sprG2- and sprG3-encoded peptide induce bacteriostasis, as opposed to the sprG1-encoded peptides that induced S. aureus death. We showed that sprG and SprF RNA levels can be modulated by environmental triggers such as hyperosmotic and oxidative stresses. Concerning sprG1/SprF1, we demonstrated in S. aureus strain N315 that the SprF1 antitoxin could be involved in persister cells formation, by a translation attenuation mechanism via its association with the ribosomes. SprF1 is the first example of an untranslated RNA antitoxin with a dual function that neutralize sprG1 toxin and that bind to ribosome to attenuate S. aureus translation. Altogether, these thesis experiments suggest an involvement of the sprG/SprF TAS in S. aureus adaptation to antibiotic stress or in the escape of the immune system.