Made available in DSpace on 2016-06-02T19:28:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseVC.pdf: 1088057 bytes, checksum: 9a67e9f55a435c2b6dc52f3f3da3b0cc (MD5) Previous issue date: 2006-06-14 / Release of extracellular polysaccharides can occur from healthy and active cells and has been demonstrated to be an important carbon source for bacteria. In eutrophic environments where large blooms are formed by efficient extracellular polysaccharide producers such as Microcystis aeruginosa and Anabaena spiroides, these organic materials (high molecular weight extracellular polysaccharides) may support planktonic bacterial growth. The aim of this study was to evaluate the extracellular glycolytic enzyme activity during a seasonal cycle and a possible regulation of the corresponding enzymes in response to variation of polysaccharides in Barra Bonita Reservoir. The majority of enzymes exhibited a significant decrease during the dry season (April to September). The content of total dissolved carbohydrates varied from 0.5 to 6.83 mg L-1 and was mainly (92%) constituted by polysaccharides. Phytoplanktonic community showed a marked succession with cyanobacteria typically dominating during the rainy season (Microcystis sp, Microcystis aeruginosa and Anabaena spiroides), whereas diatoms (mostly Aulacoseira granulata) and cryptophytes (Cryptomonas sp) were dominant through the dry season. Four algal blooms were observed during the experimental period, and after each bloom the release of combined carbohydrates was followed by high enzymatic activities, thus the production of extracellular enzymes for microheterotrophic microorganisms was related to the influx of polymeric organic substances. Even the monosaccharides composition of reservoir samples after each bloom roughly revealed the extracellular polysaccharide composition of dominant phytoplanktonic population. Experiments of polysaccharide degradation from Barra Bonita Reservoir and produced by dominant phytoplanktonic organisms (A. granulata e M. aeruginosa) assayed in laboratory conditions had confirmed the interpretation of data measured in field. / A liberação de polissacarídeos extracelulares pode ocorrer a partir de células saudáveis e ativas e tem sido demonstrado ser uma importante fonte de carbono para as bactérias. Em ambientes eutróficos onde grandes florações são formadas por eficientes produtores de polissacarídeos extracelulares como Microcystis aeruginosa e Anabaena spiroides estes substratos orgânicos podem, por exemplo, suportar o crescimento bacteriano planctônico. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade glicolítica extracelular durante o ciclo sazonal e os possíveis ajustes das enzimas correspondentes em resposta a variações dos polissacarídeos do Reservatório de Barra Bonita. A maioria das enzimas exibiu uma diminuição significativa durante a estação seca (abril a setembro). O conteúdo de carboidratos totais dissolvidos variou de 0,5 a 6,83 mg L-1 e foi composto principalmente de polissacarídeos (92%). A comunidade fitoplanctônica mostrou uma sucessão evidente com cianobactérias dominando durante a estação chuvosa (principalmente Microcystis sp, M. aeruginosa e Anabaena spiroides) enquanto que as diatomáceas (principalmente Aulacoseira granulata) e criptofíceas (Cryptomonas sp) estiveram presentes em maiores densidades durante a estação seca. Quatro florações foram verificadas durante o período experimental e, após cada floração a liberação de carboidratos combinados foi seguida por elevadas atividades enzimáticas, dessa forma a produção de enzimas extracelulares pelos microorganismos microheterotróficos esteve relacionada ao influxo de matéria orgânica polimérica. Mesmo a composição dos monossacarídeos das amostras do reservatório após cada floração aproxima-se da composição do polissacarídeo extracelular da população fitoplanctônica dominante. Também foram realizados experimentos de degradação do polissacarídeo proveniente de Barra Bonita e do polissacarídeo extracelular produzido por organismos dominantes do fitoplâncton (A. granulata e M. aeruginosa) em laboratório que confirmaram a interpretação dos dados obtidos em campo.

Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2016-09-19T12:26:32Z No. of bitstreams: 1 TeseFGA.pdf: 2851839 bytes, checksum: e4c958d9e4050def8714e03f741d0fff (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-21T18:18:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseFGA.pdf: 2851839 bytes, checksum: e4c958d9e4050def8714e03f741d0fff (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-21T18:18:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseFGA.pdf: 2851839 bytes, checksum: e4c958d9e4050def8714e03f741d0fff (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-21T18:18:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseFGA.pdf: 2851839 bytes, checksum: e4c958d9e4050def8714e03f741d0fff (MD5) Previous issue date: 2015-05-22 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Angiotensin converting enzyme 1 (ACE1) is a dipeptidyl carboxypeptidase that converts angiotensin I (decapeptide) to a vasoconstrictor octapeptide angiotensin II. Thus, ACE presents an important role in blood pressure regulation. There are many synthetic commercially available ACE inhibitors such as captopril, lisinopril and enalapril. Due to their side effects, naturally occurring inhibitors have been prospected. In order to endorse this research field we have developed a new tool for ACE ligand screening. To this end, ACE was extracted from bovine lung, purified and chemically immobilized in modified ferrite magnetic beads (ACEMBs). The ACE-MBs have shown a Michaelian kinetic behavior towards hippurylhistidyl- leucine (HHL) and was also able to catalyze the conversion of angiotensin I to angiotensin II. Moreover, as proof of concept, the ACE-MBs was inhibited by lisinopril with an IC50 of 10 nM. At the fishing assay, ACE-MBs were able not only to fish out the reference inhibitor, but also three peptides from a pool of tryptic digested BSA. ACE-MBs emerge as new straightforward tool for ACE kinetics determination, inhibition and binder screening. / Enzima conversora de angiotensina 1 (angiotensin converting enzyme 1, ACE1) é uma dipeptidil carboxipeptidase que catalisa a reação para conversão da angiotensina I, um decapeptídeo inativo, para angiotensina II, um octapeptídeo vasoconstritor. Assim, a ACE1 exerce um papel essencial na regulação da pressão arterial e tratamento de hipertensão. Existem diversos inibidores de ACE1 sintéticos disponíveis comercialmente, como captopril, lisinopril e enalapril. No entanto, o uso contínuo desses fármacos pode causar diversos efeitos adversos como falência renal, hipotensão e hipercalemia. Devido a isso, inibidores de ACE1 de origem natural tem sido prospectados. Com o objetivo de contribuir para esse campo de pesquisa, neste trabalho foi desenvolvido uma ferramenta para a busca de ligantes de ACE1. Para isso, a ACE1 foi extraída de pulmão bovino e subsequentemente purificada com o auxílio de filtros de exclusão por tamanho e mais duas etapas de cromatografia de afinidade. Para acompanhar o processo de purificação, ensaios de atividade utilizando o substrato sintético hipuril-histidil-leucina (HHL) foram estabelecidos, e foi desenvolvido um método cromatográfico para suas análises, através do monitoramento do ácido hipúrico (HA), produto da reação catalisada. Após a sua purificação, a ACE foi quimicamente imobilizada em partículas nanomagnéticas (NMB-ACE), que permitiu a realização de ensaios enzimáticos para a sua caracterização, obtendose um comportamento michaeliano para o substrato HHL. Além disso, a especificidade do reator enzimático foi testado frente a seu substrato natural e testes de inibição com o lisinopril foram realizados, obtendo um valor de IC50 próximo ao encontrado para a enzima livre. Por fim, a seletividade do reator enzimático foi avaliada pelo ensaio de bioconjugação, resultando na pesca de 3 peptídeos presente em uma mistura de mais de 100 peptídeos. Sendo assim, os estudos apresentados nesse trabalho confirmam o estabelecimento do NMB-ACE como uma ferramenta para a busca de ligantes de ACE em misturas complexas.

The adoption of conservation practices can affect the physical, chemical and biological properties of the soil, resulting changes in the composition and activity of the microbial community. The aims of this research was to obtain information about the soil quality, diversity and biological activity, submitted to two types of soil management (scarified (PDE) and no-scarified tillage (PDNE)) and three types of cover management (Succession: soybean-wheat, Rotation I: Soybean-turnip+wheat/soybean-oats+vetch and Rotation II: soybean-oats+vetch+turnip/corn-crotalaria junceawheat/ soybeans).Analyzes of carbon and nitrogen from microbial biomass, soil enzymatic activity (urease, acid phosphatase and FDA), basal respiration rate and genetic diversity analysis were performed using the RAPD technique. Carbon and nitrogen from soil microbial biomass were higher in all treatments under no-scarified no-tillage in both collection periods. The same pattern can be observed for urease enzyme activity, which presented higher values in no-scarified no-tillage soil. All enzymes showed an increase in their activity in the summer period, which shows that they are influenced by temperature and soil moisture. For the basal respiration rate, in the winter period higher values were obtained when compared to the summer period. In addition, in the winter, the highest rate of accumulated CO2 release was observed in noscarified no-tillage, and the opposite was observed for the summer period, where the highest rate was obtained in scarified tillage. The RAPD technique was efficient in detecting the genetic variability among the treatments, grouping them into four groups and generated a profile of genetic markers that can be used in later works to evaluate the genetic diversity in agricultural soils. Based on these results, we concluded that noscarified no-tillage associated with good soil conservation practices, such as permanent coverage through plant residues, contribute to an increase in the values of microbial biomass, respiration rate and enzymatic activity of the soil. RAPD technique associated with other bioindicators become important tools for the monitoring and evaluation of soil quality, activity and biological diversity. / A adoção de práticas conservacionistas pode afetar as propriedades físicas, químicas e biológicas do solo, resultando em alteração na composição e a atividade da comunidade microbiana.O objetivo deste trabalho foi obter informações sobre a qualidade, diversidade e atividade biológica do solo, quando submetido aos sistemas de plantio direto escarificado e plantio direto não escarificado, com sucessão e rotação de culturas. O experimento é conduzido na Fundação Estadual de Pesquisa Agropecuária, Centro de Pesquisa de Sementes, em Júlio de Castilhos, RS, em um Nitossolo Vermelho. Os tratamentos foram constituídos de dois tipos de manejo do solo: (1) plantio direto com compactação natural e (2) plantio direto escarificado, e de uma sucessão de culturas (soja/trigo) e duas rotações, rotação I (soja-nabo + trigo/soja-aveia + ervilhaca/soja) e rotação II (soja-aveia + ervilhaca + nabo/milho-crotaláriajuncea-trigo/soja). Foram realizadas análises referentes ao carbono e nitrogênio da biomassa microbiana, atividade enzimática do solo (urease, fosfatase ácida e Hidrólise do Diacetato de Fluoresceína), taxa de respiração basal e na análise da diversidade genética por meio da técnica de RAPD. O carbono e o nitrogênio da biomassa microbiana do solo foram superiores em todos os tratamentos sob plantio direto com compactação natural em ambos os períodos de coleta. O mesmo padrão pode ser observado para a atividade da enzima urease, que apresentou valores superiores em solo com compactação natural. Todas as enzimas apresentaram um incremento na sua atividade no período do verão, o que demonstra que são influenciadas pela temperatura e umidade do solo. Para a taxa de respiração basal, no período do inverno foram obtidos valores superiores quando comparado ao período do verão. Além disso, no inverno a maior taxa de liberação de CO2 acumulada, foi observada no plantio direto com compactação natural, sendo que o contrário foi observado para o período do verão, onde a maior taxa foi obtida em solo escarificado. A técnica de RAPD mostrou-se eficiente na detecção da variabilidade genética entre os tratamentos, agrupando-os em quatro grupos e ainda, gerou um perfil de marcadores genéticos que podem ser utilizados em posteriores trabalhos para avaliar a diversidade genética em solos agrícolas. Com base nesses resultados pode-se concluir que o plantio direto não escarificadoassociado às boas práticas de conservação do solo, como a permanente cobertura por meio de resíduos vegetais, contribui para um aumento nos valores de biomassa microbiana, taxa de respiração e atividade enzimática do solo. Além dissoa técnica de RAPD associada a outros bioindicadores tornam-se importantes ferramentas para o monitoramento e avaliação da qualidade, atividade e diversidade biológica do solo.

Submitted by MARA REGINA MOITINHO null (maramoitinho@gmail.com) on 2017-04-03T04:30:19Z No. of bitstreams: 1 Tese_Mara_Regina_Moitinho.pdf: 2751972 bytes, checksum: 5bdd069c3c0ef070c2adc12badeea314 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-04-11T19:26:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 moitinho_mr_dr_jabo.pdf: 2751972 bytes, checksum: 5bdd069c3c0ef070c2adc12badeea314 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-11T19:26:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 moitinho_mr_dr_jabo.pdf: 2751972 bytes, checksum: 5bdd069c3c0ef070c2adc12badeea314 (MD5) Previous issue date: 2017-03-02 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Embora a agricultura seja uma importante fonte emissora de CO2 para a atmosfera, o tipo de uso e manejo do solo que vai coordenar o potencial de emissão em áreas agrícolas. Neste contexto, o presente estudo foi realizado em áreas destinadas à produção de cana-de-açúcar e conduzido sob duas condições experimentais de campo. Na primeira condição, o objetivo foi caracterizar o processo de emissão de CO2 do solo (FCO2) em áreas de cana-de-açúcar, nos sistemas de colheita mecanizada crua e manual com queima, bem como investigar a relação entre a emissão de CO2 e os atributos do solo em ambos os sistemas. Foram utilizadas duas áreas adjacentes, apresentando diferentes sistemas de manejo de colheita da cana-de-açúcar: cana crua (CC) com grande quantidade de resíduos da cultura deixados sobre a superfície do solo após a colheita mecanizada, e cana queimada (CQ) com queima do canavial e colheita manual sem resíduo sob a superfície do solo. A FCO2, a temperatura e a umidade do solo foram avaliadas em 20 pontos amostrais em cada área, sendo determinadas em 9 dias de avaliações, compreendidos em um período total de 28 dias. Posteriormente, foram coletadas amostras de solo, na profundidade de 0-0,20 m para a determinação dos atributos físicos, químicos e microbiológicos do solo. A FCO2 na área de cana queimada (2,63 µmol m-2 s-1) foi, em média, 37% superior à emissão na área de cana crua (1,92 µmol m-2 s-1). As variações temporais da FCO2 e da umidade do solo foram correlacionadas nos manejos de cana crua (R2adj=0,64; p<0,05) e cana queimada (R2adj=0,66; p<0,05). O estoque de carbono, a temperatura, a umidade, a porosidade livre de água, a soma de bases e a abundância dos genes funcionais relacionados ao ciclo do carbono (pmoA) e nitrogênio (nifH) foram os atributos do solo mais representativos que ajudaram a caracterizar o processo de emissão de CO2 em solos manejados com cana-de-açúcar sob sistema de colheita da cana crua e queimada. Na segunda condição experimental, o objetivo foi caracterizar os padrões da variabilidade espacial da FCO2 e dos atributos físicos, químicos e microbiológicos do solo em área de cana-de-açúcar após as atividades de reforma. Foram conduzidas 10 avaliações da FCO2, temperatura e umidade do solo, em um gradeado regular de 90 × 90 m contendo 100 pontos amostrais inseridos na área após a reforma do canavial. Foram realizadas análises geoestatísticas para a avaliação da variação espacial e mapeamento dos atributos avaliados. Após o mapeamento da FCO2, foram identificadas duas regiões (R1 e R2) na área em estudo com diferentes valores de emissão, nas quais foram determinadas a abundância dos genes 16S rRNA de Bacteria, pmoA e nifH por PCR quantitativo em tempo real (qPCR), e demais análises da atividade enzimática do solo. Os padrões espaciais da FCO2 foram similares aos dos atributos: macroporos, porosidade livre de água, teor de silte, matéria orgânica e constante de decaimento do carbono do solo. Os resultados também indicaram que o padrão espacial da FCO2 nas regiões R1 e R2 pode não estar relacionado diretamente com a quantidade total da comunidade microbiana (16S rRNA) presente no solo, mas sim, com a função específica que esses microrganismos desempenham em relação a degradação do carbono no solo (pmoA). / Although agriculture is an important emission source of CO2 to the atmosphere, soil use and management will coordinate the emission potential in agricultural areas. In this context, this study was carried out in sugarcane production areas and under two experimental field conditions. In the first condition, the aim was to characterize soil CO2 emission (FCO2) process in areas under mechanized unburned and manual burned sugarcane harvesting systems, as well as investigate the relationship between emission and soil attributes in both systems. Two neighboring areas with different harvest management systems were used: an unburned sugarcane (US) area, with large amounts of crop residues left on the soil surface after mechanical harvest, and a burned sugarcane (BS) area, with manual harvest after burning the sugarcane field and without crop residue on the soil surface. FCO2, soil temperature (Ts), and soil moisture (Ms) were assessed at 20 sampling points in each area with nine assessments over a period of 28 days. Subsequently, soil samples were collected at each point at a depth of 0–0.20 m to determine soil physical, chemical, and microbiological attributes. FCO2 in BS area (2.63 µmol m−2 s −1) was, on average, 37% higher than the emission measured in US area (1.92 µmol m−2 s −1). Temporal variations of FCO2 and Ms was correlated in US (R2 adj = 0.64; p<0.05) and BS (R2 adj = 0.66; p<0.05). Carbon stock, temperature, moisture, air-filled pore space, sum of bases, and abundance of functional genes related to carbon (pmoA) and nitrogen (nifH) cycles are the most representative soil attributes that helped to characterize CO2 emission process in soils under US and BS systems. In the second experimental condition, the aim was to characterize the spatial variability patterns of FCO2 and soil physical, chemical, and microbiological attributes in a sugarcane area after field reform activities. In this area, 10 measurements of FCO2, Ts, and Ms were performed in a regular 90 × 90-m grid containing 100 sampling points inserted in the area after field reform. Geostatistical analyses were performed for assessing the spatial variation and mapping soil attributes. After FCO2 mapping, two regions (R1 and R2) with different emission values were identified in the study area, in which was determined the abundance of 16S rRNA genes of Bacteria, pmoA, and nifH by quantitative real-time PCR (qPCR), in addition to other soil enzymatic activity analyses. The spatial patterns of FCO2 were similar to those of macropores, air-filled pore space, silt content, organic matter, and soil carbon decay constant. The results also indicated that the spatial pattern of FCO2 in the regions R1 and R2 may not be directly related to the total amount of microbial community (16S rRNA) in the soil, but to the specific function that these microorganisms play in relation to soil carbon degradation (pmoA). / FAPESP: 2014/03634-3

O processamento da uva para produção de suco e vinho engloba diferentes processos tecnológicos, como por exemplo, o tratamento enzimático, onde usualmente são utilizadas preparações de enzimas comerciais, buscando-se aprimorar processos como clarificação e extração. Entretanto, esse é um tratamento que demanda elevado tempo de processamento, sendo relevante a busca por novas tecnologias a fim de apurar o processo. O ultrassom pode ser utilizado como uma alternativa para reduzir o tempo de processamento e acrescer qualidade ao produto, pois além de ser uma técnica sustentável, pode proporcionar benefícios no uso combinado com enzimas, favorecendo as reações em decorrência de seus efeitos. Neste trabalho, o uso em conjunto de tratamento enzimático (ET), ultrassom (US), e agitação mecânica (MS) foi avaliado na extração do mosto da uva Cabernet Sauvignon, a fim de compreender os efeitos das técnicas combinadas. Inicialmente, nove preparados enzimáticos comerciais foram caracterizados segundo suas atividades enzimáticas e aplicados para extração do mosto, avaliando a variação de temperatura (40, 50 e 60 °C), tempo (15 e 30 min), e concentração de enzima (0,01 a 2,0 U.g-1). Os melhores resultados foram obtidos com o preparado Zimopec PX5® nas condições de 1,0 U.g-1 de pectinase a 50 °C por 30 min. A extração do mosto apresentou aumento significativo nos parâmetros de qualidade avaliados (cor, sólidos solúveis totais, rendimento de extração, capacidade antioxidante, antocianinas totais) quando os três métodos de extração (US, MS e ET) foram combinados, principalmente na presença do ultrassom. Tendo em vista o efeito sinérgico obtido entre a aplicação enzimática e o ultrassom na extração do mosto, um novo estudo foi conduzido buscando investigar a influência da sonicação na eficiência catalítica das enzimas pectinase (PE), xilanase (XLN) e celulase (CE). Para isso, as atividades enzimáticas foram avaliadas em diferentes pHs e em amostras de enzima e substratos submetidas a um tratamento prévio de sonicação por tempos determinados (0 – 30 min). Os parâmetros cinéticos e termodinâmicos foram estimados, apresentando um efeito positivo do US na atividade das enzimas. A sonicação prévia do substrato contribuiu significativamente para o aumento da atividade de XLN, enquanto a sonicação prévia da enzima melhorou a atividade da CE e PE. Os resultados apresentaram um aumento na velocidade de hidrólise das enzimas com o uso do US, assim como um aumento da eficiência catalítica (Vmax/Km), mostrando o potencial da aplicação do US para ativação das enzimas. De acordo com os resultados obtidos, pode-se afirmar que o ultrassom proporcionou melhorias na extração do mosto, podendo ser utilizado como uma técnica alternativa de processo, bem como apresentou efeitos benéficos sobre as atividades enzimáticas. / Grape processing for juice and wine production encompasses different technological processes, such as enzymatic treatment, that usually uses commercial enzyme preparations to improve clarification and extraction processes. However, this is a treatment that demands high processing time, being relevant the search for new technologies in order to improve the whole process. Ultrasound (US) can be used as an alternative to reduce the processing time and improve the quality of the product, moreover, it can provide benefits in the combined use with enzymes, favoring the enzymatic reactions. In this work, the combined use of enzymatic treatment (ET), ultrasound (US), and mechanical agitation (MS) was studied in order to understand the effects of the techniques on Cabernet Sauvignon must extraction. Initially, nine commercial enzyme preparations were characterized according to their enzymatic activities and applied to must extraction, evaluating temperature (40, 50 and 60 °C), time (15 and 30 min), and enzyme concentration (0.01 to 2.0 Ug-1). The best results were obtained for the preparation Zimopec PX5® under conditions of 1.0 U.g-1 of pectinase at 50 °C for 30 min. A significant increase on quality parameters (color, °Brix, yield, antioxidant capacity, total anthocyanins) was obtained to extraction combining the three methods (US, MS and ET), mainly when US were applied. Based on these previous results, a new study was conducted to investigate the influence of sonication on the catalytic efficiency of the enzymes pectinase (PE), xylanase (XLN) and cellulase (CE). The enzymatic activities were evaluated at different pH and in samples of enzyme and substrates submitted to a previous treatment of sonication by determined times (0 - 30 min). The kinetic and thermodynamic parameters were estimated, showing a positive effect of the ultrasonic treatment on the enzymatic activity. Previous sonication of the substrate contributed significantly to the increase in XLN activity, whereas the previous sonication of the enzyme improved the activity of CE and PE. This research showed the potential benefits of ultrasound treatment on reaction rate and catalytic efficiency (Vmax/Km) improvement of enzymes, attesting that US can be used to increase the catalytic efficiency of pectinase, xylanase and cellulase enzymes. According to the obtained results, it can be affirmed that ultrasound improved the extraction process, and can be applied as an alternative technique, as well as provided beneficial effects on the enzymatic activity.

Iron/Manganese superoxide dismutases (Fe/Mn-SODs) are metalloenzymes with highly conserved protein folds, active sites, and dimer interfaces. They protect cells against oxidative stress by catalyzing the conversion of the cytotoxic free radical superoxide to molecular oxygen and hydrogen peroxide. The majority are highly specific for the type of metal (iron or manganese) present within the active site. However, there are many key aspects of metal specificity and catalytic activity that lack a structural explanation. Computational analyses suggested that several residues are important for fine-tuning the redox potential of the metal in the active site and thereby the catalytic activity. The main objective of this thesis is to evaluate the influence of several point mutations (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G and Q172D) and one double mutation (Q149G+G74Q)) in terms of metal specificity, catalytic activity and three-dimensional structure using the superoxide dismutase from Trichoderma reesei (TrSOD) as a model system. The corresponding genes were cloned, expressed and the resulting proteins characterized by X-ray crystallography, electron paramagnetic resonance (EPR), atomic absorption spectroscopy (AAS), dynamic light scattering (DLS) and their enzymatic activity determined. The native protein was shown to be able to use either Mn or Fe (5000 units/mg and 500 units/mg, respectively) for catalysis suggesting it to be properly classified as cambialistic. Structures for native TrSOD and the Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G and Fe-M27V, Mn-M27V mutants were solved at 2.3 &Aring;, 2.0 &Aring;, 2.03 &Aring;, 2.0 &Aring;, 1.85 &Aring;, 1.4 &Aring; and 1.6 &Aring; resolution, respectively. The H75I, L80F and M27V mutations are easily accommodated by small local structural changes to the three-dimensional structure. On the other hand, the G73A mutation destabilize one of the dimer-dimer interfaces of the tetramer making it possible for two distorted tetramers to interact forming an octamer. This enzyme also lost all catalytic activity probably due to resulting exposure of the active site consistent with the observation of a sixth ligand (solvent molecule) bound to the metal in one subunit. The D150G mutant remained tetrameric but with reduced symmetry related to the rearrangement of the last helix (H9). Our results show that a large impact on activity and oligomerization of TrSOD can be generated by a single amino acids substitution in some cases and provide some insights into our understanding of the structural details associated with the metal ion specificity and oligomerization in superoxide dismutases. / Superóxido dismutases de ferro e manganês (Fe/Mn-SODs) são metaloenzimas com enovelamentos, sítios ativos e interfaces diméricas altamente conservados. Estas enzimas protegem as células contra o estresse oxidativo pela conversão do ânion superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio. A maioria são altamente específicas pelo tipo de metal (ferro ou manganês) presente no sítio ativo. Entretanto, existem vários aspectos críticos sobre a especificidade pelo metal e da atividade catalítica que ainda não foram explicados em termos estruturais. Análises computacionais sugerem que vários resíduos são importantes para o ajuste do potencial redox do metal no sitio ativo e, portanto, a atividade catalítica. O objetivo principal deste trabalho é avaliar a influência de mutações simples (TrSOD) (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G e Q172D) e dupla (Q149G + G74Q) em superóxido dismutases de Trichoderma reesei em termos de especificidade pelo metal, atividade catalítica e estrutura. Os genes correspondentes foram clonados, expressos e as proteínas resultantes caracterizadas por cristalografia de raios-X, ressonância paramagnética electrónica (EPR), espectroscopia de absorção atómica (AAS), dispersão de luz dinâmica (DLS), e a atividade enzimática foi determinada. Foi mostrado que a proteína nativa é capaz de usar tanto Mn quanto Fe (5000units/mg e 500units/mg, respectivamente) para catálise sugerindo que deveria ser a classificada como enzima cambialistica. Estruturas da enzima nativa e mutantes (Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G, Fe-M27V e Mn-M27V) foram resolvidas a resoluções de 2.3 &Aring;, 2.0 &Aring;, 2.03 &Aring;, 2.0 &Aring;, 1.85 &Aring;, 1.4 &Aring; e 1.6 &Aring; respetivamente. As mutações H75I, L80F e M27V são acomodadas facilmente por reajustes locais na estrutura tridimensional. Por outro lado, a mutação G73A desestabiliza uma das interfaces dímero-dímero do tetrâmero levando à formação de um octâmero feito por dois tetrâmeros distorcidos. Esta enzima também perde atividade provavelmente devido a um aumento na acessibilidade do sítio ativo, coerente com a observação de um sexto ligante (molécula de solvente) coordenando o metal em uma das subunidades. O mutante D150G continuou tetramérica mas com simetria reduzida relacionado com o rearranjo da última hélice (H9). Estes resultados mostram que, em alguns casos, uma mutação simples pode ter um impacto significativo no estado oligomérico e atividade catalítica da proteína TrSOD e fornece conhecimentos para a nossa compreensão dos detalhes estruturais associados com a especificidade de íons metálicos e oligomerização em superóxido dismutases.

No Brasil, vários trabalhos com pinhão-manso (Jatropha curcas L.) têm estudado a avaliação do estado nutricional, porém são poucas as investigações objetivando caracterizar a marcha de absorção, bem como as respostas bioquímicas e fisiológicas desta espécie ao manejo nutricional. antecipadamente o estado nutricional das plantas. Desse modo, o objetivou-se com este estudo avaliar a marcha de absorção no desenvolvimento inicial do pinhão-manso (Jatropha curcas L.), bem como as omissões de N, P, K, Ca, Mg e de S no crescimento inicial e no comportamento bioquímico e fisiológico dessa espécie e, por fim, prever os quadros sintomatológicos das deficiências. Para alcançar os objetivos propostos foram realizados dois experimentos simultâneos, conduzidos em casa de vegetação, sendo que as plantas foram cultivadas individualmente em vasos contendo solução nutritiva. No primeiro experimento - referente à marcha de absorção - a plantas foram cultivadas em solução nutritiva completa, sendo que as plantas eram retiradas a cada 14 dias para a determinação do acúmulo de massa seca e macronutrientes. No segundo experimento as plantas foram cultivadas em solução completa (controle) e omissão individual de N, P, K, Ca, Mg e de S. Neste experimento foram realizados testes bioquímicos e fisiológicas para a previsão de desordens nutricionais aos 20, 30, 40 e 120 dias após o inicio dos tratamentos. As primeiras manifestações de deficiência foram observadas para o Ca e N, seguidas das de Mg e K, contudo não foram observados sintomas de carência de P e S. As atividades das enzimas redutase do nitrato, da fosfatase ácida e da peroxidase, bem como a avaliação das concentrações de poliaminas, efetuadas no início do desenvolvimento das plantas, demonstraram ser indicadores para previsão das desordens nutricionais de N, P e K, respectivamente. As omissões individuais dos macronutrientes limitaram o desenvolvimento inicial do pinhão-manso, reduziram os teores de clorofila e a taxa fotossintética de forma distinta. Porém, a omissão de Ca foi a que mais limitou o desenvolvimento dessa espécie para todas as variáveis avaliadas / In Brazil, several studies with physic nut (Jatropha curcas L.) have studied the assessment of nutritional status, but there are few investigations aiming to characterize the uptake and the biochemical and physiological responses to nutritional management of this species, for the purpose of prediction the nutritional status of plants. Thus, the objective with this study was to evaluate the uptake in the initial development of physic nut (Jatropha curcas L.), as well as the omission of N, P, K, Ca, Mg and S, to physiological and biochemical assessments, and finally, predicting symptomatology frames deficiencies. To achieve the proposed objectives two experiments were conducted in a greenhouse. The plants were grown individually in pots containing nutrient solution. In the first experiment - uptake of macronutrients - the plants were grown in complete nutrient solution, whereas plants were taken every 14 days for the determination of dry matter and macronutrients accumulation. In the second experiment, the plants were grown in complete solution (control) and the omission of N, P , K , Ca , Mg and S. In this experiment biochemical and physiological tests were performed for predicting nutritional disorders at 20, 30, 40 and 120 days after initiation of treatment. The first manifestations of deficiency were observed for Ca and N, followed by Mg and K, but don\'t were observed symptoms of P and S deficiency. The activities of nitrate reductase, acid phosphatase and peroxidase, as well as the assessment of concentrations of polyamines, made in the early development of the plant, proved to forecast indicators of nutritional disorders of N, P and K, respectively. The individual macronutrients omissions limited the initial development of physic nut, in addition, reduced chlorophyll content and photosynthetic rate differently. However, the omission of Ca was the most limited growth of this species for all variables

Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar o efeito de frações (em hexano, diclorometano, acetato de etila e hidroalcoólica) de extratos etanólicos de Trichilia pallida Swartz, Trichilia pallens C.DC. e Toona ciliata M. Roemer sobre Spodoptera frugiperda (J. E. Smith), e isolar, identificar e avaliar o efeito dos compostos dessas três meliáceas sobre o desenvolvimento e o metabolismo do inseto, com ênfase para o limonoide cedrelona. As frações causaram baixa mortalidade, mas houve grande redução de peso das lagartas com as frações em diclorometano de folhas e de ramos de T. pallida, de ramos de T. pallens e de folhas e de frutos de T. ciliata, além de maior duração da fase larval, redução do peso de pupas e alteração dos índices nutricionais, sendo a fração de ramos de T. pallida a de maior efeito tóxico e com fagodeterrência secundária, e a fração de folhas de T. ciliata sem efeito tóxico, mas apresentando fagodeterrência possivelmente primária. A partir da fração em diclorometano de frutos de T. ciliata obteve-se um triglicerídeo; da fração em acetato de etila de ramos de T. ciliata obteve-se o flavonoide (+/-)-catequina; da fração em hexano de folhas de T. pallida obteve-se o triterpeno damaradienol e da fração em diclorometano de ramos de T. pallens obteve-se a cumarina escopoletina. O triglicerídeo e a escopoletina causaram pequena mortalidade e redução de peso das lagartas por ingestão, enquanto a catequina causou apenas redução de peso. Por contato, a escopoletina também afetou a sobrevivência. O limonoide cedrelona, isolado do extrato bruto em hexano de caules de T. ciliata, apresentou o maior efeito, tanto por ingestão quanto por contato. Por ingestão, os valores estimados de CL50, CL90 e CE50 para a cedrelona aplicada sobre a dieta foram 365,33, 659,62 e 95,02 ppm, respectivamente, e após incorporação na dieta, os valores foram 119,05, 491,14 e 45,13 ppm, respectivamente. A cedrelona causou fagodeterrência em teste com chance de escolha e redução no consumo foliar no teste sem chance de escolha. A ingestão de cedrelona causou menor peso de lagartas e de pupas, aumento da duração da fase larval e da mortalidade de modo dose dependente, com efeitos subletais observados a partir de 24 ppm. Lagartas de quarto ínstar que ingeriram dieta contendo cedrelona a 300 ppm tiveram redução na eficiência de conversão do alimento ingerido (ECI) e digerido (ECD) e na taxa de crescimento relativo (RGR), enquanto o custo metabólico (MC), a taxa metabólica relativa (RMR) e a digestibilidade aproximada (AD) aumentaram, e a taxa de consumo relativo (RCR) não foi alterada, indicando efeitos tóxicos pós-ingestão e efeito fagodeterrente secundário, com a maior parte do alimento assimilado sendo utilizada no metabolismo. A atividade de proteases no mesêntero das lagartas que ingeriram dieta contendo cedrelona foi reduzida, assim como a quantidade de grupos heme, relacionados às monoxigenases do citocromo P450, enquanto a atividade de glutationa-S-transferases não foi alterada. A atividade de acetilcolinesterase no extrato enzimático de lagartas inteiras aumentou. A bioatividade da cedrelona e os possíveis modos de ação são discutidos. / This work was carried out to evaluate the effect of fractions (in hexane, dichloromethane, ethyl acetate and hydroalcoholic) of ethanolic extracts of Trichilia pallida Swartz, Trichilia pallens C.DC. and Toona ciliata M. Roemer to Spodoptera frugiperda (J.E. Smith ), and to isolate, identify and evaluate the effect of the compounds from the three Meliaceae on the larvae development and metabolism, with emphasis on the cedrelone limonoid. The fractions caused low mortality, but there was a great reduction in weight of larvae with dichloromethane leaves and stems fractions of T. pallida, stems of T. pallens and leaves and fruits of T. ciliata, in addition to longer duration of the larval stage, pupae weight reduction and changes on nutritional indices. The fraction of T. pallida stems caused the highest toxic effects and secondary phagodeterence, and the fraction of T. ciliata leaves showed probably primary phagodeterrence, but no toxic effect. From the dichloromethane fraction of T. ciliata fruits was obtained a triglyceride (unidentified), from the ethyl acetate fraction of T. ciliata stems was obtained the flavonoid (+/-)-catechin, from the hexane fraction of T. pallida leaves was obtained the triterpene dammaradienol and from the dichloromethane fraction of T. pallens stems was obtained the coumarin scopoletin. Scopoletin and triglyceride caused low mortality and larval weight reduction after ingestion, catechin caused only larval weight reduction. Scopoletin either affect survival by contact. The limonoid cedrelone, isolated from the crude hexane extract of stems of T. ciliata, was the most effective compound, either by ingestion or by contact. After ingestion, the estimated LC50, LC90 and EC50 values for cedrelone applied onto the diet were 365.33, 659.62 and 95,02 ppm, respectively, and after diet incorporation, the values were119.05, 491.14 and 45.13 ppm, respectively. Cedrelone caused feeding deterrence on choice test and reduced leaf consumption in the no-choice test. Cedrelone intake caused low weight gain by larvae and pupae, increased mortality and duration of larval stage in a dose-dependent manner, with sublethal effects observed at 24 ppm. Fourth instar larvae that ingested diet containing 300 ppm cedrelone showed reduced efficiency conversion of ingested (ECI) and digested food (ECD), reduced relative growth rate (RGR), increased metabolic cost (MC), relative metabolic rate (RMR) and approximatte digestibility (AD), but no change in relative consumption rate (RCR), suggesting toxic effects post ingestion and secondary phagodeterrence, in which most of the assimilated food was used in metabolism. The protease activity in the midgut of the larvae that ingested diet containing 300 ppm of cedrelone was reduced, as well the amount of heme groups related to cytochrome P450 monoxygenases in the midgut, but there was no change in the glutathione S-transferases activity. , There was an increase of acetylcholinesterase activity in the larvae bodies. Cedrelone bioactivity and the possible modes of action are discussed.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-12-14T16:21:21Z No. of bitstreams: 1 Andrezza Emanuella Oliveira Silva.pdf: 862075 bytes, checksum: 15d487fa5144ad472d4d4b80a22fe958 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-14T16:21:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrezza Emanuella Oliveira Silva.pdf: 862075 bytes, checksum: 15d487fa5144ad472d4d4b80a22fe958 (MD5) Previous issue date: 2014-01-13 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Biochemical attributes play a very important role in biogeochemical cycles of elements, which is essential for the survival of living beings. Thus, knowledge about the enzymatic activity contribute to assess the quality of the use or soil management. This study aimed to 1. determine the activity of the enzymes involved in phosphorus, sulfur and nitrogen cycle in the surface layers of soil in areas at different times of stages of forest regeneration in the city of Forest-PE and 2. evaluate the enzymatic activities in the Cambisol, Planosol and Oxisol profile, up to 1m deep, in areas under forest regeneration stages. In a homogeneous solo track, six areas were selected according to the cutting times of caatinga vegetation of forest management established for each area: C-18: vegetation regeneration for 18 years; P-13: 13 years ago; L-12: 12 years ago; 9- C: 9 years ago; C- 7: 7 years ago and L- 4: 4 years ago. In six areas, samples were taken at depths of 0-5, 5-15 and 15-30 cm for the evaluation of enzymes acid and alkaline phosphatase, arylsulfatase and urease. These six areas studied, three of these (P-13, C-9 and L-4) were open profiles and samples collected at depths 0-5, 5-10, 10-20, 20-40, 40-60, 60-80 and 80-100 cm for evaluation of the parameters described above. Biochemical parameters were sensitive in detecting changes in soil quality in tropical dry forest. The activities of enzymes acid and alkaline phosphatase, arylsulfatase and urease decreased with increasing soil depth. The Planosol was the profile that showed higher enzyme activities, at all depths, for acid and alkaline phosphatase enzymes. / Os atributos bioquímicos desempenham um papel muito importante nos ciclos biogeoquímicos dos elementos, sendo este fundamental para a sobrevivência dos seres vivos. Dessa maneira, o conhecimento sobre a atividade enzimática contribuem para avaliar a qualidade quanto ao uso e manejo do solo. Este estudo teve como objetivos 1. determinar a atividade enzimática das enzimas envolvidas no ciclo do fósforo, do enxofre e do nitrogênio nas camadas superficiais de solos em áreas sob diferentes tempos de estágios de regeneração florestal, no município de Floresta-PE e, 2. avaliar as atividades enzimáticas no perfil de um Cambissolo, Planossolo e Latossolo, até 1m de profundidade, em áreas sob estágios de regeneração florestal. Em uma faixa homogênea de solo, foram selecionadas seis áreas de acordo com as épocas de corte da vegetação de caatinga do manejo florestal estabelecido para cada área: C-18: vegetação em regeneração há 18 anos; P-13: há 13 anos; L-12: há 12 anos; C-9: há 9 anos; C-7: há 7 anos e L-4: há 4 anos. Nas seis áreas foram retiradas amostras nas profundidades de solo de 0-5, 5-15 e 15-30 cm, para a avaliação das enzimas fosfatase ácida e alcalina, arilsulfatase e urease. Dessas seis áreas estudadas, três destas (P-13, C-9 e L-4) foram abertos perfis e coletadas amostras nas profundidades 0-5, 5-10, 10-20, 20-40, 40-60, 60-80 e 80-100 cm para avaliação dos parâmetros descritos anteriormente. Os atributos bioquímicos foram sensíveis em detectar mudanças na qualidade do solo na floresta tropical seca. As atividades das enzimas fosfatase ácida e alcalina, arilsulfatase e urease diminuiram com o aumento da profundidade do solo. O planossolo foi o perfil que apresentou maiores atividades enzimáticas, em todas as profundidades, para as enzimas fosfatase ácida e alcalina.

Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-08-24T12:59:01Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3178737 bytes, checksum: 5041c62a2f0856a630f7f0f0865ee43b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-24T12:59:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3178737 bytes, checksum: 5041c62a2f0856a630f7f0f0865ee43b (MD5) Previous issue date: 2016-08-12 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de MInas Gerais / Para identificar regiões genômicas envolvidas na regulação de processos fisiológicos fundamentais, como fotossíntese, respiração e aqueles relacionados, uma população de ILs de Solanum pennellii em fundo genético de S. lycopersicum (M82) foi analisada. Foram estudados parâmetros fisiológicos, metabólicos e de crescimento, que vão desde troca gasosa (por exemplo, taxa de assimilação de CO 2 e condutância estomática), fluorescência da clorofila (por exemplo, taxa de transporte de elétrons e de extinção fotoquímica), bem como parâmetros de crescimento (por exemplo, taxa de crescimento relativo, matéria seca da raiz e parte aérea). Em paralelo, nós também analisamos, por meio de uma plataforma robotizada, os principais intermediários metabólicos (por exemplo, açúcares, amido, nitrato, aminoácidos e proteínas), e a atividade de nove enzimas representativas do metabolismo central do C e N. O objetivo do estudo foi: (1) combinar informações sobre as atividades enzimáticas e os níveis de metabólitos de caule, pecíolo e folha com a biomassa e rendimento de frutos; (2) através do estudo desses três órgãos interligados, examinar o quanto há de conectividade entre a atividade das enzimas e os níveis de metabólitos; (3) fornecer informações preditivas sobre as diferenças de particionamento do C e assimilação N inorgânico; (4) investigar a diversidade genética natural e identificar QTLs relacionados ao metabolimo central e a atividade enzimática no caule, pecíolo e folha. As análises dos dados permitiram a identificação de 67 QTL relacionados à parametros fisiológicos e metabólicos. Além disso, uma anotação abrangente e detalhada destas regiões permitiu apontar um total de 87 genes candidatos que possam controlar as características investigadas. Desses, 70 genes apresentou variantes alélicas relacionadas inserções de elementos transponíveis entre os dois genótipos parentais. As análises metabólicas e enzimática revelaram alta frequência de correlações positivas entre as enzymas, frequência moderada de correlações entre metabólitos relacionados, e baixa correlações entre a atividade das enzimas e os níveis de metabólitos. Tomados em conjunto, vapresentamos o maior estudo de parâmetros de fotossíntese e crescimento em plantas de tomate até à data. Os resultados permitiram a identificação de genes candidatos que podem estar envolvidos na regulação da fotossíntese, metabolismo primário e crescimento da planta, e fornece um recurso genético valioso para a compreensão dos mecanismos bioquímicos envolvidos na regulação do metabolismo primário em tomateiro. / To identify genomic regions involved in the regulation of fundamental physiological processes such as photosynthesis, respiration and underlying traits, a population of 71 Solanum pennellii introgression lines (ILs) in the genetic background of S. lycopersicum (M82) was analyzed. We determined IL phenotypes physiological, metabolic and growth related traits, ranging from gas- exchange parameters (e.g. CO 2 assimilation rates and stomatal conductance), chlorophyll fluorescence parameters (e.g. electron transport rate and photochemical quenching) as well as growth related traits (e.g. relative growth rate, shoot and root dry matter accumulation). In parallel, we also analyzed by robotized platform the major metabolic intermediates (e.g. sugars and starch), and the activities of nine representative enzymes from central C and N metabolism. We aimed: (1) combine information about enzyme activities and metabolite levels from stem, petiole and leaf with biomass and fruit yield; (2) by studying these three interconnected organs, examine how much connectivity exists between enzyme activities and metabolite levels; (3) provide predictive information about differences in C partitioning and inorganic N assimilation; (4) investigate the natural genetic diversity and identify QTL controlling variation of enzyme activities and metabolite levels in stem, petiole and leaf. Data analyses allowed identification of 67 physiological and metabolic QTL. Additionally, a comprehensive and detailed annotation of these regions allowed to point out a total of 87 candidate genes that might control the investigated traits. Out of those, 70 genes showed allelic variants related to differentially transposable element insertions pattern between both parental genotypes. Furthermore, the results revealed high frequency of positive correlations between enzyme activities, moderate frequency of correlations between related metabolites, and few correlations between enzyme activities and metabolite levels. Taken together, we present the largest study of photosynthetic and growth parameters in tomato plants to date. Our results allowed the identification of candidate genes that might be involved in the regulation of photosynthesis, primary metabolismo and plant growth, and provide an valuable genetic resource to understanding of the biochemical mechanisms involved in the regulation of primary metabolism in tomato plants.