Diplomová práce se zabývá jednak popisem stavu letecké dopravy a to zejména co se týče její bezpečnosti, plynulosti, propustnosti a kapacity. Výše uvedené je poté zhodnoceno v části věnující se aspektům nebezpečnosti vzdušného prostoru v jednotlivých fázích letu.

Este trabalho descreve um ataque que detecta as teclas pressionadas em teclados mecânicos pela análise das vibrações geradas quando as mesmas são pressionadas. Dois equipamentos foram experimentados no ataque: um teclado genérico de automação comercial e um terminal de ponto de venda (POS / PIN-pad). Acelerômetros são utilizados como sensores de vibração. Propositalmente, o equipamento necessário para a execução do ataque é de baixíssimo custo, de modo a ressaltar o risco das vulnerabilidades encontradas. Obtivemos taxas de sucesso médio de 69% no reconhecimento das teclas pressionadas para o terminal PIN-pad em repouso e 75% para o mesmo sendo segurado na mão. No caso de teclado de automação comercial, as taxas médias de acerto ficaram em torno de 99%. / This work describes an attack that identifies the sequence of keystrokes analyzing mechanical vibrations generated by the act of pressing keys. We use accelerometers as vibration sensors. The apparatus necessary for this attack is inexpensive and can be unobtrusively embedded within the target equipment. We tested the proposed attack on an ATM keypad and a PIN-pad. We achieved the key recognition rates of 99% in ATM keypad, 69% in PIN-pad resting on a hard surface and 75% in PIN-pad hold in hand.

O complexo Mre11 (Mre11/Rad50/Nbs1) é uma componente chave da resposta celular ao dano ao DNA em humanos e recentes observações sugerem que estas proteínas são em parte responsáveis pela interface ente o ensoreamento do dano ao DNA, seu reparo e as funções das proteínas envolvidas nos pontos de checagem do ciclo celular. Em Aspergillus nidulans, a partir de um screening para o isolamento de letais sintéticos na ausência de dineína, o gene sldIRAD50 foi clonado como um desses letais sintéticos através da complementação do fenótipo de deficiência de conidiação do mutante. Foi identificada uma transversão G-C na posição 2509 (Ala-692-Pro) no mutante sldI1444 a qual está presente na região de dobradiça da proteína. Essa mutação causa sensibilidade a vários agentes mutagênicos. Uma linhagem mutante sldIRAD50::pyrG foi construída a qual apresentou também vários defeitos na reposta celular ao dano ao DNA incluindo sensibilidade a várias drogas mutagênicas, defeito no ponto de checagem de replicação do DNA e na viabilidade dos ascosporos. Além disso, o gene sldIRAD50 interage geneticamente com bimEAPC1 para o controle do spindle pole checkpoint durante a segregação cromossômica sugerindo um novo papel para o complexo Mre11. Em atuação paralela com o complexo Mre11, duas proteínas quinases ditas apicais, ATM e ATR coordenam a transdução do sinal do dano ao DNA para proteínas efetoras do reparo. A proteína ATM está mutada na síndrome de instabilidade cromossômica herdada Ataxia Telangiectasia. Para a caracterização do homologo de ATM em A. nidulans AtmA, uma linhagem mutante atmAATM foi isolada. Esse mutante apresentou falha na reposta ao dano ao DNA, como seus homólogos em vários outros organismos mostrando defeitos no ponto de checagem intrafase S e G2/M, além de sensibilidade a camptothecin e bleomicina. Ainda, o extrato protéico bruto desse mutante não foi capaz de fosforilar o homologo de NBS1 em A. nidulans, ScaA. Além das conhecidas funções de ATM na resposta ao dano ao DNA, foi verificado que o mutante atmAATM apresentou uma acelerada cinética de divisão nuclear e severos defeitos no estabelecimento e manutenção do eixo de crescimento polarizado, evidenciando uma função ainda não descrita para ATM no crescimento polar. Provavelmente, AtmA regula a função e/ou localização de proteínas chaves para a formação do eixo de polarização. Diante disso, para investigar as vias metabólicas que são controladas por esse gene, o perfil transcricional do mutante atmAATM, em comparação com a linhagem selvagem foi verificado em diferentes condições de crescimento. Os resultados indicaram um importante papel da via das pentoses fosfato na proliferação celular monitorada pela AtmA. Além disso, foram identificados vários genes com a expressão do mRNA diminuída envolvidos no crescimento polarizado, na síntese de ácido fosfatídico e de ergosterol e no tráfico intracelular, secreção e transporte vesicular. Buscando identificar genes que participam da resposta celular ao dano ao DNA causado pela droga anti topoisomerase I, camptothecin, foram utilizados filtros de macroarray de A. nidulans contendo 2787 genes deste organismo para monitorar a expressão gênica da linhagem selvagem e do mutante uvsBATR, num experimento de indução com CPT por 30, 60 e 120 minutos. Os resultados revelaram um total de 1512 e 1700 genes modulados na linhagem selvagem e uvsBATR respectivamente, em pelo menos um ponto experimental. Seis desses genes que apresentaram aumento da expressão de mRNA na linhagem selvagem e diminuição da linhagem uvsBATR foram caracterizados: fhdA (que codifica para uma proteína com domínio fork-head associated), tprA (uma proteína hipotética que apresenta o domínio tetratrico peptide repeat), mshA (um homólogo MutS6 envolvido em mismatch repair), phbA (um homólogo da prohibitina), uvsCRAD51 e cshA (homólogo da proteína CSB envolvida no reparo por excisão de nucleotídeos e ligada a Síndrome de Cockayne). A indução transcricional desses genes na presença de CPT requer a função de uvsBATR. Estes genes foram deletados e surpreendentemente apenas uvsCRAD51 apresentou sensibilidade a CPT, enquanto os outros mostraram sensibilidade a outros agentes que causam dano ao DNA e estresse oxidativo. Além disso, com exceção de uvsCRAD51, a deleção desses genes leva a supressão parcial da sensibilidade a menadiona e paraquat do mutante uvsBATR. Esses resultados indicaram um comportamento heterogêneo de sensibilidade durante o crescimento na presença de agentes que causam dano direto ou indireto ao DNA, evidenciando que o perfil transcricional não é determinante para predizer a função de um gene na proteção da célula a determinada droga que causa dano ao DNA. / The Mre11 protein complex (Mre11/Rad50/Nbs1) has emerged as a central component in the human cellular DNA damage response, and recent observations suggest that these proteins are at least partially responsible for the linking of DNA damage detection to DNA repair and cell cycle checkpoint functions. In Aspergillus nidulans, the sldI1444D mutant was isolated in a screen for dynein synthetic lethals. The sldIRAD50 gene was cloned by complementation of the sporulation deficiency phenotype of this mutant. A transversion G-C at the position 2509 (Ala-692-Proamino acid change) in the sldI1444D mutant causes sensitivity to several DNAdamaging agents. The mutation sldI1 occurs at the CXXC hinge domain of Rad50. An inactivation strain sldIRAD50::pyrG was constructed. Besides sensitivity to a number of DNA-damaging agents, this deletion strain was also impaired in the DNA replication checkpoint response and in ascospore viability. Also, sldIRAD50::pyrG geneticaly interacted with bimEAPC1, acting in the spindle pole checkpoint control during segregation, suggesting a new possible role of Mre11 complex. In parallel to the Mre11 complex, two apical quinases ATM and ATR respond to DNA damage and transduce the signal to effector proteins. In humans, mutations in ATM cause the devastating neurodegenerative disease Ataxia Telangiectasia. Here we characterized the homolog of ATM (AtmA) in the filamentous fungus A. nidulans. The deletion strain atmA presented defects in the DNA damage response as previously shown in other model organisms including intra S-phase and G2/M checkpoint defects, sensitivity to camptothecin and bleomycin. Also, the crude extract from the mutant strain did not phosphorylate the NBS1 homologue ScaA. In addition to its expected role in the DNA damage response, the atmA mutant showed increased nuclear division kinetics and severe defects in polarized hyphal growth, indicating a novel feature for the ATM gene. Probably, AtmA regulates the function and/or localization of landmark proteins required for the formation of a polarity axis. We extended these studies by investigating which pathways are controlled by AtmA during proliferation and polar growth by comparatively determining the transcriptional profile of A. nidulans wild type and atmA mutant strains in different growth conditions. Our results indicated an important role of the pentose phosphate pathway in the fungal proliferation during endogenous DNA damage and polar growth monitored by the AtmA kinase. Furthermore, we identified several genes that have decreased mRNA expression in the atmA mutant that are involved in the formation of polarized hyphae and control of polar growth; in the biosynthesis of phosphatidic acid and ergosterol; and intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport. In order to identify genes that responded to the DNA damage mediated by the anti- toposomerase I drug, camptothecin, we used an A. nidulans macroarray carrying sequences of 2,787 genes from this fungus to monitor gene expression of both wild-type and uvsBATR in a time-point experiment where mycelium was exposed to 60, 90 and 120 minutes to the drug. The results revealed a total of 1,512 and 1,700 genes in the wild-type and uvsBATR deletion mutant strain that displayed statistically significant difference in at least one experimental time-point. We characterized six genes that have increased mRNA expression in the presence of CPT in the wild-type strain relative to the uvsBATR mutant strain: fhdA (encoding a fork head associated domain protein), tprA (encoding a hypothetical protein that contains a tetratrico peptide repeat), mshA (encoding a MutS homologue involved in mismatch repair), phbA (encoding a prohibitin homologue), uvsCRAD51 (the homologue of the RAD51 gene), and cshA (encoding a homologue of the excision repair protein ERCC-6 [Cockaynes syndrome protein]). The induced transcript levels of these genes in the presence of CPT required uvsBATR. These genes were deleted, and surprisingly, only the uvsCRAD51 mutant strain was sensitive to CPT; however, the others displayed sensitivity to a range of DNA-damaging and oxidative stress agents. Moreover, with the exception of UvsC, deletion of each of these genes partially suppressed the sensitivity of the uvsB strain to menadione and paraquat. These results indicated a very complex and heterogeneous sensitivity behavior during growth in the presence of agents that directly or indirectly cause DNA damage and the transcriptional response to DNAdamaging agents does not necessarily identify the genes that protect against these agents.

Le syndrome de Williams-Beuren (SWB} est une maladie génétique rare causée par une microdélétion de la région 7q11.23. A la suite de l'observation clinique d'une jeune fille atteinte du SWB ayant développé un lymphome de Burkitt à l'âge de 7 ans, nous nous sommes intéressé au lien génétique entre SWB et cancer. L'étude d'une série de cas de cancers survenus chez des enfants atteints de SWB a montré que les lymphomes non-hodgkiniens de type B étaient surreprésentés dans cette population puisque 73% des cancers chez les enfants atteints du SWB étaient des LNH-B. La région critique du SWB a été explorée par CGH-array et séquencage haut-débit dans les échantillons sains et tumoraux de 2 patients atteints de SWB. Aucune perte d'hétérozygotie de la région 7q11.23 n'a été trouvé. En outre, une délétion somatique de la région 7q11.23 a été identifiée dans un lymphome de Burkitt sporadique (Guenat D et al., J Hematol Oncol, 2014). Nous avons ensuite exploré les mécanismes de réponses aux dommages à l'ADN dans des lignées de fibroblastes primaires dérivées de patients atteints du SWB ainsi que dans des lignées 293T traitées avec des siRNA ciblant RFC2, BAZ1B et GTF2/, 3 gènes localisés en 7q11.23 et codant des protéines de réparation de l'ADN. Les cellules dérivées de patients SWB ont montré un défaut de signalisation dans les voies ATM/ATR-dépendantes en réponse aux dommages à l'ADN (Guenat D et al., DNA repair, article soumis). L'haploinsuffisance de la région 7q11.23 associée au SWB pourrait donc jouer un rôle dans la lymphomagenèse B par l'altération de voies de réponse aux dommages à l'ADN ATM/ATR-dépendantes. Cependant, ces résultats mériteraient d'être confirmés dans des modèles murins reproduisant le génotype complet du SWB. Enfin, des données épidémiologiques exhaustives sur l'incidence des pathologies tumorales chez les individus atteints du SWB sont indispensables pour affirmer qu'une prédisposition au cancer existe chez ces patients / Williams-Beuren syndrome (WBS) is a genetic disorder caused by a microdeletion at 7q11.23. The case of a young girl with WBS who developed a Burkitt lymphoma at the age of 7 leads us to explore the genetic link between WBS and cancer. The study of a series of cancers occurred in WBS patients during childhood have shown that B-cell non hodgkin lymphoma are over-represented in this population since 73% cancer cases in WBS were B-NHL. The critical region of WBS was explored by array-CGH and high-throughput sequencing in normal and tumor samples from WBS patients. No loss of heterozygosity at 7q11.23 was found. ln addition, a somatic deletion at 7q11.23 was observed in a sporadic case of Burkitt lymphoma (Guenat D et al., J Hematol Oncol, 2014). DNA damage response mechanisms were then explored in primary fibroblast cell lines derived from WBS patients as well as in 293T cell line treated with siRNA targeting RFC2, GTF2/ and BAZ1 B, 3 genes mapping at 7q11.23 that encode proteins involved in DNA damage response. WBS patients cell lines have shown a defect in ATM/ ATR-dependent DNA damage response pathways (Guenat D et al., DNA Repair, article submitted). Haploinsufficiency of the 7q11.23 region associated with WBS might play a role in B-cell lymphomagenesis through the alteration of ATM/ATR-dependent DNA damage response pathways. However, these results deserve to be confirmed in mouse models that reproduce the complete genotype of human WBS. Finally, strong epidemiological data would be required to confirm the predisposition to cancer in WBS patients.

O início e a progressão do carcinoma espinocelular oral (CEO) são caracterizados pela aquisição de alterações genéticas e epigenéticas. A proteína SET é descrita como uma oncoproteína e, recentemente, o seu acúmulo foi mostrado em CEO. Diversas funções têm sido atribuídas à SET, tais como controle do ciclo celular, sobrevivência celular, migração celular, acetilação de histonas, e resposta ao estresse oxidativo. Este contexto sugere a SET como alvo terapêutico, mas primeiramente, é essencial entender a sua ação na tumorigênese e progressão em CEO. A hipótese central no presente estudo refere-se ao papel da SET na instabilidade genômica e reparo de DNA, bem como na regulação epigenética da expressão de miRNA, com impacto no desenvolvimento e progressão de CEO. O silenciamento estável de RNA foi realizado usando plasmídeo contendo short hairpin RNA contra SET (shSET) em linhagens de CEO in vitro (HN12 e Cal27) e in vivo (tumores xenoenxerto de HN12). Efeitos da redução da SET em CEO, in vitro e in vivo, foram avaliados no perfil de metilação (MSP, methylation specific PCR), expressão de miR-9 (qRT-PCR) e reparo de DNA (reparo mismatch e de quebra de fita dupla - DSB). A instabilidade genômica foi abordada por meio de cinco microssatélites (PCR convencional) para avaliar a instabilidade de microssatélites (MSI), e ensaio cometa para avaliar danos ao DNA (SSB, DSB, cross-link, etc.). O status de proteínas envolvidas em reparo de DSB (ATM, BRCA1 e MLH1) foi avaliado por imunofluorescência e Western blotting (WB). A resposta aos danos no DNA (DDR) induzidos por radioterapia (raios-X) foram analisados nas células HN12 por meio de ensaios clonogênico e de ciclo celular; proteínas associadas à apoptose, autofagia, ciclo celular e reparo foram avaliadas por WB. A redução da SET nas células HN12 modificou a transcrição dos loci codificantes do miR-9 por meio da reversão parcial de hipermetilação, tanto in vitro quanto in vivo, para o locus miR-9-1, e in vitro para o miR-9-3, com aumento nos níveis de miR-9 e miR-9*. A análise de 5 microssatélites mostrou alteração no perfil alélico de dois marcadores, D5S346 e D2S123, nas células HN12 shSET e nos tumores xenoenxerto da HN12 shSET (in vivo) em relação aos respectivos controles, o que sugere a presença de MSI e é um indício do papel da SET no reparo de DNA tipo mismatch. A linhagem HN12 shSET apresentou diminuição de danos no DNA e aumento das proteínas de reparo de DSB, MLH1, ATM, p-ATM e BRCA1 em relação a células HN12 shCTRL. Na DDR induzida por raios-X as células HN12 shSET apresentaram nas primeiras 48 horas uma menor perda de viabilidade (menor % em sub G0/G1), com parada em G2/M, maior nível de ATM ativa, aumento dos níveis de p21 e LC3B-II, além de menor clivagem de PARP e caspase-8 em relação as células HN12 shCTRL; isto sugere uma melhor resposta a danos de DSB e ativação de vias de sobrevivência nas células HN12 shSET. Entretanto, após 12 dias de radioterapia as células HN12 shSET mostraram uma tendência a menor sobrevivência. Portanto, os nossos resultados indicam o envolvimento da SET na regulação transcricional do miR-9, nas vias de reparo do tipo mismatch e de DSB em CEO, com potenciais implicações tanto na tumorigênese quanto na progressão da doença. / Oral squamous cell carcinoma (OSCC) onset and progression are characterized by acquisition of genetic and epigenetic alterations. SET protein is known as an oncoprotein and, recently, its accumulation was demonstrated in OSCC. Several functions have been attributed to SET, such as cell cycle control, cell survival, cell migration, histone acetylation, and response to oxidative stress. This context outstands SET as a therapeutic target, but first, it is essential to understand its role in tumorigenesis and progression in OSCC. The central hypothesis of this study refers to SET role in genomic instability and DNA repair, as well as miRNA epigenetic regulation, with impact in OSCC development and progression. Stable SET knockdown (shSET) was achieved using short hairpin RNA against SET mRNA in vitro (HN12 and Cal27, OSCC cell lines) and in vivo (HN12 xenografts tumors). Effects of SET knockdown were assessed in OSCC, in vitro e in vivo, regarding DNA methylation (MSP, methylation specific PCR) and expression of miR-9 (qRT-PCR), and DNA repair (mismatch and double-strand breaks/DSB repair). Genomic instability was addressed by means of five microsatellites (conventional PCR) to assess microsatellite instability (MSI), and comet assay to assess DNA damage (SSB, DSB, cross-link, etc.). The status of proteins involved in DSB repair (ATM, BRCA1 and MLH1) was assessed by immunofluorescence and Western blotting (WB). The DNA damage response (DDR) induced by ionizing radiation (X-rays) was assessed in HN12 cells through clonogenic and cell cycle assays; proteins associated with apoptosis, autophagy, cell cycle and repair were assessed by WB. SET knockdown in HN12 cells modified miR-9 transcription through hypermethylation partial reversal for miR-9-1 locus, both in vitro and in vivo, and for miR-9-3 in vitro, with increase of miR-9 and miR-9* levels. Analysis of 5 microsatellites showed changes in the allelic profile of two markers, D5S346 and D2S123, in HN12 shSET cells (in vitro) and HN12 shSET xenografts tumors (in vivo) compared to their controls, suggesting MSI and it\'s a clue of SET role in mismatch repair. HN12 shSET cells showed decreased DNA damage and increased DSB repair protein levels (MLH1, ATM, p-ATM and BRCA1) compared to HN12 shCTRL. In the first 48 hours, HN12 shSET X-rays-induced DDR showed lower loss of viability (lower % in subG0/G1), increased G2/M checkpoint, higher levels of active ATM, p21, LC3B-II, and less PARP and caspase-8 cleavage than HN12 shCTRL. These results suggest a higher efficiency of DSB damage response and activation of survival pathways in the presence of SET knockdown. However, 12 days after radiotherapy, HN12 shSET cells presented a tendency for higher intrinsic radiosensitivity in relation to control. Therefore, our findings indicate a SET involvement in miR-9 transcriptional regulation, and in mismatch and DSB repair, with potential implications in oral tumorigenesis and progression.

Este trabalho descreve um ataque que detecta as teclas pressionadas em teclados mecânicos pela análise das vibrações geradas quando as mesmas são pressionadas. Dois equipamentos foram experimentados no ataque: um teclado genérico de automação comercial e um terminal de ponto de venda (POS / PIN-pad). Acelerômetros são utilizados como sensores de vibração. Propositalmente, o equipamento necessário para a execução do ataque é de baixíssimo custo, de modo a ressaltar o risco das vulnerabilidades encontradas. Obtivemos taxas de sucesso médio de 69% no reconhecimento das teclas pressionadas para o terminal PIN-pad em repouso e 75% para o mesmo sendo segurado na mão. No caso de teclado de automação comercial, as taxas médias de acerto ficaram em torno de 99%. / This work describes an attack that identifies the sequence of keystrokes analyzing mechanical vibrations generated by the act of pressing keys. We use accelerometers as vibration sensors. The apparatus necessary for this attack is inexpensive and can be unobtrusively embedded within the target equipment. We tested the proposed attack on an ATM keypad and a PIN-pad. We achieved the key recognition rates of 99% in ATM keypad, 69% in PIN-pad resting on a hard surface and 75% in PIN-pad hold in hand.

O início e a progressão do carcinoma espinocelular oral (CEO) são caracterizados pela aquisição de alterações genéticas e epigenéticas. A proteína SET é descrita como uma oncoproteína e, recentemente, o seu acúmulo foi mostrado em CEO. Diversas funções têm sido atribuídas à SET, tais como controle do ciclo celular, sobrevivência celular, migração celular, acetilação de histonas, e resposta ao estresse oxidativo. Este contexto sugere a SET como alvo terapêutico, mas primeiramente, é essencial entender a sua ação na tumorigênese e progressão em CEO. A hipótese central no presente estudo refere-se ao papel da SET na instabilidade genômica e reparo de DNA, bem como na regulação epigenética da expressão de miRNA, com impacto no desenvolvimento e progressão de CEO. O silenciamento estável de RNA foi realizado usando plasmídeo contendo short hairpin RNA contra SET (shSET) em linhagens de CEO in vitro (HN12 e Cal27) e in vivo (tumores xenoenxerto de HN12). Efeitos da redução da SET em CEO, in vitro e in vivo, foram avaliados no perfil de metilação (MSP, methylation specific PCR), expressão de miR-9 (qRT-PCR) e reparo de DNA (reparo mismatch e de quebra de fita dupla - DSB). A instabilidade genômica foi abordada por meio de cinco microssatélites (PCR convencional) para avaliar a instabilidade de microssatélites (MSI), e ensaio cometa para avaliar danos ao DNA (SSB, DSB, cross-link, etc.). O status de proteínas envolvidas em reparo de DSB (ATM, BRCA1 e MLH1) foi avaliado por imunofluorescência e Western blotting (WB). A resposta aos danos no DNA (DDR) induzidos por radioterapia (raios-X) foram analisados nas células HN12 por meio de ensaios clonogênico e de ciclo celular; proteínas associadas à apoptose, autofagia, ciclo celular e reparo foram avaliadas por WB. A redução da SET nas células HN12 modificou a transcrição dos loci codificantes do miR-9 por meio da reversão parcial de hipermetilação, tanto in vitro quanto in vivo, para o locus miR-9-1, e in vitro para o miR-9-3, com aumento nos níveis de miR-9 e miR-9*. A análise de 5 microssatélites mostrou alteração no perfil alélico de dois marcadores, D5S346 e D2S123, nas células HN12 shSET e nos tumores xenoenxerto da HN12 shSET (in vivo) em relação aos respectivos controles, o que sugere a presença de MSI e é um indício do papel da SET no reparo de DNA tipo mismatch. A linhagem HN12 shSET apresentou diminuição de danos no DNA e aumento das proteínas de reparo de DSB, MLH1, ATM, p-ATM e BRCA1 em relação a células HN12 shCTRL. Na DDR induzida por raios-X as células HN12 shSET apresentaram nas primeiras 48 horas uma menor perda de viabilidade (menor % em sub G0/G1), com parada em G2/M, maior nível de ATM ativa, aumento dos níveis de p21 e LC3B-II, além de menor clivagem de PARP e caspase-8 em relação as células HN12 shCTRL; isto sugere uma melhor resposta a danos de DSB e ativação de vias de sobrevivência nas células HN12 shSET. Entretanto, após 12 dias de radioterapia as células HN12 shSET mostraram uma tendência a menor sobrevivência. Portanto, os nossos resultados indicam o envolvimento da SET na regulação transcricional do miR-9, nas vias de reparo do tipo mismatch e de DSB em CEO, com potenciais implicações tanto na tumorigênese quanto na progressão da doença. / Oral squamous cell carcinoma (OSCC) onset and progression are characterized by acquisition of genetic and epigenetic alterations. SET protein is known as an oncoprotein and, recently, its accumulation was demonstrated in OSCC. Several functions have been attributed to SET, such as cell cycle control, cell survival, cell migration, histone acetylation, and response to oxidative stress. This context outstands SET as a therapeutic target, but first, it is essential to understand its role in tumorigenesis and progression in OSCC. The central hypothesis of this study refers to SET role in genomic instability and DNA repair, as well as miRNA epigenetic regulation, with impact in OSCC development and progression. Stable SET knockdown (shSET) was achieved using short hairpin RNA against SET mRNA in vitro (HN12 and Cal27, OSCC cell lines) and in vivo (HN12 xenografts tumors). Effects of SET knockdown were assessed in OSCC, in vitro e in vivo, regarding DNA methylation (MSP, methylation specific PCR) and expression of miR-9 (qRT-PCR), and DNA repair (mismatch and double-strand breaks/DSB repair). Genomic instability was addressed by means of five microsatellites (conventional PCR) to assess microsatellite instability (MSI), and comet assay to assess DNA damage (SSB, DSB, cross-link, etc.). The status of proteins involved in DSB repair (ATM, BRCA1 and MLH1) was assessed by immunofluorescence and Western blotting (WB). The DNA damage response (DDR) induced by ionizing radiation (X-rays) was assessed in HN12 cells through clonogenic and cell cycle assays; proteins associated with apoptosis, autophagy, cell cycle and repair were assessed by WB. SET knockdown in HN12 cells modified miR-9 transcription through hypermethylation partial reversal for miR-9-1 locus, both in vitro and in vivo, and for miR-9-3 in vitro, with increase of miR-9 and miR-9* levels. Analysis of 5 microsatellites showed changes in the allelic profile of two markers, D5S346 and D2S123, in HN12 shSET cells (in vitro) and HN12 shSET xenografts tumors (in vivo) compared to their controls, suggesting MSI and it\'s a clue of SET role in mismatch repair. HN12 shSET cells showed decreased DNA damage and increased DSB repair protein levels (MLH1, ATM, p-ATM and BRCA1) compared to HN12 shCTRL. In the first 48 hours, HN12 shSET X-rays-induced DDR showed lower loss of viability (lower % in subG0/G1), increased G2/M checkpoint, higher levels of active ATM, p21, LC3B-II, and less PARP and caspase-8 cleavage than HN12 shCTRL. These results suggest a higher efficiency of DSB damage response and activation of survival pathways in the presence of SET knockdown. However, 12 days after radiotherapy, HN12 shSET cells presented a tendency for higher intrinsic radiosensitivity in relation to control. Therefore, our findings indicate a SET involvement in miR-9 transcriptional regulation, and in mismatch and DSB repair, with potential implications in oral tumorigenesis and progression.

The purpose of our thesis is to investigate the incentive mechanisms that may be used for a timely and successful implementation of Public-Private Partnership (PPP) projects. This purpose is achieved by investigating challenges and success factors within one of the largest Public-Private Partnership projects in Europe, the SESAR programme which stands for Single European Sky ATM Research and that aims at modernising the European air traffic management (ATM) system. The categories of SESAR actors that we investigated include: stakeholders (airspace users such as Air France, KLM, SAS; ANSPs from Sweden,Finland, Netherlands and the CANSO organisation; airport representatives including Swedavia, Zürich Airport and Guernsey Airport); as well as manufacturers (e.g. Airbus, Frequentis, Thales); international organisations as principals (e.g. European Commission – SESAR Joint Undertaking-, EUROCONTROL) and advisers (e.g. Helios UK). Referring to our contribution to the theory, we identify four categories of incentive mechanisms for timely implementation of large PPP projects: i. Financial incentives such as loans, proportionate with the level of risks the implementer bears; the deduction of loan fees or reduction of service charges can motivate stakeholders to implement earlier, once they identify a positive business case. ii. Operational incentives can refer to certain preferential treatment to those who comply and detrimental treatment to those who do not comply. iii. Legal incentives such as mandates can force commitment and have an impact on the timely implementation of PPP projects within a certain time-frame. iv. Intangible incentives, such as transparent communication, collaboration and less political behaviour, are seen as major factors contributing to the commitment and trust level among the actors involved, thus, enabling the success of the PPP project implementation.

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La dérégulation du système de surveillance qui bloque la prolifération lorsque l'intégrité du génome est compromise fait partie intégrante de la cancérogenèse. Nous cherchons à décortiquer les mécanismes qui, en phase G2, orchestrent l'arrêt du cycle cellulaire, irréversible, en présence des lésions de l'ADN (sénescence) ou réversible (quiescence), en absence de signaux mitogéniques ou confluence. L'objectif du premier volet fut d'élucider les rôles respectifs de l'inhibiteur de CDK (CKI) p21Waf1 et des kinases Chk1 et Chk2 dans l'arrêt en G2 dû au stress génotoxique menant à la sénescence. Nous avons montré que dans les cellules humaines normales cet arrêt nécessite l'action de p21 et Chk1 tandis que Chk2 n'est pas requise. Au contraire, dans plusieurs lignées cancéreuses, malgré la présence de p53, ce rôle de p21 est compromis à cause d'une activation inefficace de la kinase ATM. Par conséquent, en dépit d'une forte activation de Chk1 bloquant la mitose, ces cellules ne parviennent pas à initier la sénescence (Lossaint et al., soumis). L'objectif du deuxième volet fut de mettre en évidence le programme déclenchant la quiescence lors de confluence ou en absence de sérum. Les travaux antérieurs de l'équipe ont montré que cette décision pouvait être prise avant la mitose même si l'arrêt du cycle n'a lieu qu'en phase G1 suivante. En étudiant les fibroblastes synchronisés nous avons trouvé que la quiescence est précédée par l'inhibition pré-mitotique de la phosphorylation de pRb due à une diminution de cycline D1 et une stabilisation du CKI p27Kip1 (Chassot et al., 2008). De plus, nos résultats récents montrent que la présence de sérum entre le point R et la mitose est requise pour initier la réplication de l'ADN au cycle suivant. Les travaux futurs devraient élucider comment différentes voies de signalisation, via la voie cycline D-pRb, affectent divers composants de l'appareil de réplication de l'ADN pour inhiber la progression du cycle de façon réversible ou irréversible. / Cancer is a multi-step process resulting from abrogation of several barriers to uncontrolled proliferation. They include inhibitory pathways with appropriate checkpoints that lead to reversible (quiescence) or irreversible (senescence, apoptosis) block of cell proliferation. We are especially interested in pathways orchestrating cell cycle exit that operate in the G2 phase. The first objective of this thesis was to decipher mechanisms that prevent mitosis in response to DNA damage. We found that Cdk inhibitor p21Waf1 plays a crucial role in blocking mitotic onset in normal cells; acting in tandem with checkpoint kinase Chk1, p21 inactivates mitotic Cdks and inhibits pRb phosphorylation, thereby irreversibly blocking mitotic entry. In contrast, in p53-proficient transformed cells, the induction of p21 in G2 is impaired, most likely because of deficient ATM activation. While, in some cases, Chk1 hyper-activation prevents mitosis, the absence of p21 compromises the senescence program from G2. Finally, we showed that Chk2 is dispensable for G2 arrest in both non-transformed and transformed cells (Lossaint et al., submitted). Our second objective was to elucidate the pathways that induce quiescence (G0). This reversible cell cycle exit occurs in G1, requires pRb family members and p27Kip1-dependent Cdk inactivation. Based on observations obtained in our team and the data in the literature, we hypothesized that reversible cell cycle exit program might be launched before mitosis. By using an in vitro wounding model, we showed that confluence-driven quiescence is preceded by pre-mitotic CDK inhibition by p27, cyclin D1 downregulation and reduced pre-mitotic pRb phosphorylation (Chassot et al., 2008). Moreover, our results obtained in synchronized fibroblasts that were serum-starved after release from G1/S block suggest that cyclin D1 might stimulate proliferation by keeping pocket proteins phosphorylated during G2/M progression (Lossaint et al., in preparation).