Aggregatibacter actinomycetemcomitans is strongly associated with aggressive periodontitis and one of several virulence factors is a leukotoxin (LtxA). The toxin has a consequential impact on human leukocytes which leads to an interference with the host ́s defences due to a chain reaction involving activation and release of a pro-inflammatory cytokine; interleukin-1β (IL-1β). As an early phase in this reaction chain the toxin stimulates a massive release of adenosine triphosphate (ATP) from human leukocytes. We hypothesize that leukotoxin-induced pro- inflammatory cell death is initiated by ATP release through pannexin channels in the human monocyte cell membrane. The aim of this study was to investigate if blocking of pannexin channels with carbenoxolone (Cbx) results in a reduction of ATP release. A human monocyte cell line (THP-1 cells) was exposed to purified LtxA, Cbx and oxidized ATP. Colorimetric ATP kit was used to evaluate levels of ATP release and thereafter the samples were read in a spectrophotometer. This study confirms that LtxA induces an ATP release from THP-1 cells. Our conclusion is that blocking of pannexin channels does not result in a statistically significant reduction in ATP release, which indicates that ATP is released by one or several other undetected pathways.

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Dans les tumeurs solides, l'hypoxie est un mécanisme de résistance à la radiothérapie bien connu. Il a déjà été démontré que, lorsque les microbulles (MB) sont exposées à une impulsion ultrasonore (US), celles-ci peuvent induire une vasodilatation dans les tissus musculaires. De plus, une impulsion thérapeutique peut être délivrée localement dans la tumeur en dirigeant le faisceau US. Cette approche est donc proposée comme thérapie provasculaire ciblée, guidée par l’imagerie ultrasonore dans les tumeurs afin de réduire l'hypoxie avant la radiothérapie. Le contrôle de la vasodilatation est induit par la production d'oxyde nitrique (NO) par la voie de signalisation cellulaire du eNOS dans les cellules endothéliales. Il a été démontré que l'augmentation de l'ATP extracellulaire active la voie de signalisation du eNOS. Il a aussi été démontré que l’oscillation des MB sous l’effet des US libèrent de l'ATP lorsque le tissu musculaire est traité. Cependant, les effets des différentes conditions ultrasonores et de MB sur la libération d'ATP n'ont pas encore été étudiés. Nous émettons donc l'hypothèse qu'il existe des conditions permettant de maximiser l’activation des voies de signalisation purinergiques (ATP) et d'optimiser leur durée d’activation pour une réponse provasculaire optimale. Les motivations de ce projet sont de tester divers paramètres et d'étudier les interactions MB/cellules dans des conditions d'écoulement, qui sont généralement difficile à mettre en place lorsqu'on utilise des boîtes de Pétri. Pour quantifier plus facilement les voies de signalisation, nous avons créé des puces microfluidiques avec quatre canaux parallèles dans lesquels des cellules ont pu être cultivées. Avec quatre canaux traités lors d’une même impulsion ultrasonore, nous avons aussi augmenté le nombre de données à traiter et nous pouvons observer les effets de plusieurs impulsions lorsque les MB étaient dans un écoulement. En outre, la puce que nous avons développé est capable de donner une concentration en MB différente dans chaque canal afin de pouvoir tester quatre concentrations de MB différente dans des conditions d’écoulement. Les objectifs de ce projet de maîtrise sont donc les suivants : (1) concevoir la puce microfluidique ; (2) être capable de cultiver des cellules dans les canaux microfluidiques ; (3) créer des protocoles pour mesurer la libération d'ATP et la viabilité cellulaire après une impulsion ultrasonore ; (4) observer la capacité de la puce à donner différentes concentrations de MB dans chaque canaux en conditions d’écoulement. Lors de la conception de la puce microfluidique, nous avons créé un environnement dans lequel les quatre canaux de la puce ont des concentrations différentes de microbulles fluides. Ainsi, nous avons atteint les objectifs du projet. Nous avons réussi à introduire dans le canal microfluidique des cellules endothéliales de cordon ombilical humain (HUVEC) et une lignée cellulaire de cancer du sein (4T1). Les monocouches cellulaires créées par chacune des deux lignées cellulaires ont été traitées avec succès par une impulsion thérapeutique ultrasonore lors de l’injection de MB. Nos résultats montrent qu'une augmentation du nombre de cycles et de la pression, libère plus d'ATP et induisent une mortalité cellulaire plus importante. En outre, nous avons établi un lien entre la libération d'ATP et la mortalité cellulaire en comparant différentes impulsions thérapeutiques ultrasonore. Cette analyse a permis de dégager deux tendances. Avec des impulsions à faible énergie, la libération d'ATP est augmenté et on constate une très faible augmentation de la mort cellulaire ; inversement, avec des impulsions à plus forte énergie, la libération d'ATP et la mortalité cellulaire ont augmentés et on atteint un plateau. Ainsi, nos résultats confirment que différents mécanismes de libération d'ATP peuvent être déclenchés par les thérapies MB et US. / In solid tumors, hypoxia is a well-known resistance mechanism to radiation therapy. It was previously shown that microbubbles (MBs), when exposed to an ultrasound pulse (US) can cause vasodilation in muscle tissue. Conceptually, the therapeutic pulse can be localized on the tumor by steering the US beam. This approach is therefore proposed as a targeted image-guided provascular therapy in tumors to reduce hypoxia before radiotherapy. However, the effects of US and MB conditions on the relative increase in tumor perfusion remain largely unknown. Vascular control is managed by the production of nitric oxide (NO) through the eNOS pathway inside the endothelial cells. Increases in extracellular ATP have been shown to be a signaling event for the activation of this pathway. Fittingly, MB and US have been shown to release ATP when muscle tissue was treated. However, the effects of therapeutic US and MB parameters on the treatment have not yet been described. We, therefore, hypothesize that there are conditions that will maximize the purinergic signaling pathways (ATP) and optimize their time course for an optimal provascular response. The motivation for this project came from the desire to test various parameters and study MB/cell interactions in flowing conditions, which are typically limited when using petri dish setups. To quantify more easily the signaling pathways, we created microfluidic chips with four parallel cell coated channels. This chip allowed us to increase the throughput when using a single US exposure in static conditions and with the ability to support multiple US exposures with MB replenishment in flowing conditions. Also, the custom-made chip multiplexes the bubble concentration to obtain four channels with different flowing microbubble concentrations. The goals of this master’s project were thus: (1) to design the microfluidic chip; (2) to demonstrate the capacity for cell culture; (3) create protocols for measuring ATP and cell viability after therapeutic pulses; (4) to demonstrate repeatable flowing conditions with the multiplexed MB concentration. On the design of the microfluidic chip, we were successful at creating an environment where four of the four channels in the chip have different concentrations of flowing microbubbles. Thus, fulfilling the project's goals. We have succeeded in seeding both Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and a breast cancer cell line (4T1) into the microfluidic channel. The cell monolayers created by both cell lines were successfully treated with an US and MB therapeutic pulse. Our results support that an increase in both, cycles and pressure, release more ATP and cause more cell death. Further, we linked ATP release to cell death by comparing different therapeutic pulses. From this analysis, two trends appeared. With lower energy pulses, ATP release increased sharply with a very small increase in cell death; conversely, with higher energy pulses, ATP release continued to increase with cell death but reached a plateau. Thus, our results support that different mechanisms of ATP release can likely be triggered by MB and US therapy.

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L’ATP est bien connue pour son rôle de transporteur d'énergie à l’intérieur des cellules, mais en dehors de la cellule, elle agit en tant que molécule de signalisation extracellulaire. En se liant aux récepteurs purinergiques, l’ATP extracellulaire amorce la signalisation purinergique afin de réguler certains processus physiologiques et pathophysiologiques. Dans les poumons, l’ATP stimule la sécrétion de surfactant et promeut la clairance mucociliaire. Compte tenu du rôle critique de l’ATP extracellulaire dans les poumons, il est important de comprendre le mécanisme du relargage d’ATP cellulaire — la première étape de la signalisation purinergique. Parce que les forces mécaniques constituent le déclencheur principal du relargage d’ATP, cette thèse a pour but d’investiguer le(s) mécanisme(s) physiologique(s) et les sources cellulaires d’un tel relargage d’ATP mécanosensible. Cet ouvrage est divisé en trois parties : 1) Pour étudier les caractéristiques spatiales et temporelles du relargage d’ATP, j’ai développé une technique d’imagerie hautement sensible basée sur la bioluminescence de la luciférine-luciférase couplée avec un système de lentilles à grand champ de vision (WFOV, wide field of view) optimisant l’apport de lumière. Pour évaluer notre approche d’imagerie, j’ai soumis des cellules A549, dérivées d’un adénocarcinome pulmonaire humain, à un étirement ou un choc hypotonique de 50% pour déclencher un relargage d’ATP. J’ai démontré que notre technique nous permet de quantifier précisément la quantité et le taux (ou l’efflux) d’ATP s’échappant des cellules. Le WFOV constitue un outil essentiel utilisé dans les études décrites dans cette thèse pour déterminer le mécanisme et la source cellulaire du relargage d’ATP dans l’alvéole. 2) Afin d’examiner le mécanisme physiologique du relargage d’ATP induit par l’étirement dans les cellulaires alvéolaires primaires, j’ai déterminé les contributions individuelles des cellules alvéolaires de type 1 (AT1) en comparaison des cellules alvéolaires de type 2 (AT2). Pour ce faire, des cellules AT2 fraîchement isolées de poumons de rats ont été ensemencées sur une chambre flexible en silicone et cultivées jusqu’à sept jours, ce qui permettait aux cellules AT2 de se transdifférencier progressivement en cellules semblables aux cellules AT1. Le ratio des cellules alvéolaires (AT2:AT1), étant de 4:1 au jour 3, est devenu 1:4 au jour 7. La quantité d'ATP libérée diminuait avec le nombre décroissant de cellules AT2, les impliquant en tant que principale source pour le relargage d’ATP en réponse à un étirement. Alors que les modulateurs pharmacologiques des canaux d’ATP, carbenoxolone et probénécide, ne diminuaient pas la quantité d’ATP libérée, le BAPTA, un chélateur de calcium intracellulaire ([Ca2+]i), l’a significativement réduite. De même, ces trois modulateurs exercent des effets similaires sur les réponses calciques intracellulaires mesurées par le Fura-2, suggérant une connexion entre le relargage d’ATP et les niveaux de [Ca2+]i. 3) Pour explorer le rôle qu’ont les propriétés viscoélastiques de la membrane dans le relargage d’ATP mécanosensible, j’ai démontré qu’une déformation de 30% induisait un relargage d’ATP transitoire qui était accompagné d’une absorption d’iodure de propidium (PI, propidium iodide) chez des cellules AT2. Ceci est cohérent avec une rupture membranaire transitoire induite par une déformation, assez large pour le passage d’ATP et de PI. L’efflux d’ATP augmente aussi selon le taux de déformation, et la durée de déformation prolonge la demi-vie du relargage d’ATP. Donc, ces résultats fournissent des indices sur la manière dont l’étirement de la membrane viscoélastique peut mener au relargage d’ATP par un mécanisme alternatif impliquant une mécanoporation de la membrane cellulaire. Dans l’ensemble, ces résultats démontrent que le relargage d’ATP ne se produit pas à travers les canaux conduisant l’ATP mais plutôt par une mécanoporation transitoire de la membrane. D’autres études sur les dommages membranaires sont nécessaires pour mieux comprendre sa contribution dans le relargage d’ATP mécanosensible et les signaux de [Ca2+]i. De telles études élucideront la signalisation purinergique dans les organes qui sont constamment exposés à des contraintes physiques. Ceci pourrait suggérer des cibles/approches thérapeutiques pour moduler les impacts négatifs d’un relargage d’ATP excessif observés lors de certaines conditions pathologiques, telles que les lésions pulmonaires induites par la ventilation mécanique. / ATP is widely known to be an energy carrier within cells, but outside of the cell, it acts as an extracellular signaling molecule. Upon binding to purinergic receptors, extracellular ATP initiates the purinergic signaling to regulate certain physiological and pathophysiological processes. In the lungs, ATP stimulates surfactant secretion and promotes mucociliary clearance. Given the critical role of extracellular ATP in the lungs, it is important to understand the mechanism of cellular ATP release — the first step of purinergic signaling. Because mechanical forces constitute the primary trigger of ATP release, this thesis aims to investigate the physiological mechanism(s) and cellular sources of such mechanosensitive ATP release. This work is divided into three parts: 1) To study the spatial and temporal characteristics of ATP release, I developed a highly sensitive imaging technique based on luciferin-luciferase bioluminescence coupled with a custom-designed lens system, which combined a wide field of view (WFOV) and high light-gathering power. To evaluate our imaging approach, I subjected A549 cells, derived from human lung adenocarcinoma, to stretch or 50% hypotonic shock to trigger ATP release. I demonstrated that our technique allows us to precisely quantify the amount and the rate (or efflux) of ATP escaping from cells. The WFOV constitutes an essential tool used in the studies described in this thesis to determine the mechanism and cellular source of ATP release in the alveolus. 2) To examine the physiological mechanism of stretch-induced ATP release in primary alveolar cells, I determined the individual contributions of alveolar type 1 (AT1) in comparison with alveolar type 2 (AT2) cells. To this end, freshly isolated AT2 cells from rat lungs were seeded on a flexible silicone chamber and were cultured for up to seven days, which allowed AT2 cells to progressively transdifferentiate into AT1-like cells. The ratio of alveolar cells (AT2:AT1), being 4:1 on day 3, became 1:4 on day 7. The quantity of released ATP decreased with the decreasing numbers of AT2 cells, implicating them as the main source of ATP release in response to stretch. While pharmacological ATP channel modulators, carbenoxolone and probenecid, did not diminish the amount of ATP release, BAPTA, an intracellular calcium ([Ca2+]i) chelator, significantly reduced it. Likewise, these three modulators had similar effects on intracellular calcium responses measured by Fura-2, suggesting a connection between ATP release and [Ca2+]i levels. 3) To explore the role of membrane viscoelastic properties in mechanosensitive ATP release, I demonstrated that a 30% strain induced transient ATP release that was accompanied by uptake of propidium iodide (PI) in AT2 cells. This is consistent with a strain-induced transient membrane rupture, big enough for the passage of ATP and PI. ATP efflux also increases with strain rate, and hold time prolongs the half-life of ATP release. Thus, these results provide clues on how stretching of the viscoelastic membrane may lead to ATP release via an alternate mechanism involving transient mechanoporation of the cell membrane. Overall, these findings demonstrate that stretch-induced ATP release does not occur through ATP-conducting channels but rather a transient membrane mechanoporation. Further studies on membrane injury induced by strain are needed to better understand its contribution to mechanosensitive ATP release and [Ca2+]i signaling. Such studies will elucidate purinergic signaling in organs that are constantly exposed to physical stresses. This could suggest novel therapeutic targets/approach to modulate the negative impacts of excessive ATP release observed under certain pathological conditions, such as ventilator-induced lung injury.