La transcription est le processus biologique qui permet l'expression des gènes et donc est essentielle à la vie cellulaire. Ce phénomène nécessite une régulation très fine via de nombreux signaux cellulaires menant à un contrôle de la dynamique chromatinienne. Chez Saccharomyces cerevisiae, le complexe histone acétyltransférase NuA4 participe à cette régulation en acétylant les queues N-terminales des histones H4 et H2A. La chromatine est alors plus relâchée, ce qui facilite l'accès de toute la machinerie transcriptionnelle. Lors de cette étude, nous avons abordé deux aspects distincts de la fonction de NuA4. D'une part, la sous-unité Yng2, homologue de suppresseur de tumeur humain impliqué entre autres dans la régulation de p53, est connue pour interférer dans plusieurs processus cellulaires. In vivo, le mutant Ayng2 entraîne une diminution de l'acétylation de H4 et de la transcription dépendante de NuA4. La création de mutations ponctuelles dans le domaine ± Plant HomeoDomain ¿ (PHD) et la région polybasique de la protéine provoque la perte d'interactions spécifiques avec la modification post-traductionnelle H3K4me3 et les phosphatidylinositol phosphates. L'étude fonctionnelle de ces mutants révèle une répercussion sur l'activité de NuA4 et la transcription. D'autre part, les sous-unités EaO, 5 et 7 existent majoritairement hors de NuA4 sous la forme d'un trimère. Des tests de sensibilité mettent en évidence une corrélation entre ce trimère et la transcription. De plus, le trimère serait présent à la région codante de gènes transcrits suggérant un rôle dans l'élongation transcriptionnelle.

Chez S.cerevisiae, NuA4 est un complexe Histone acetyltransferase (HAT) de 1,3 MDa contenant 13 sous unités. Esal, seule HAT essentielle chez la levure, est la sous-unité catalytique qui acétyle les histones H4 et H2A et une des six protéines essentielles du complexe. De plus, six protéines sont présentes dans d'autres complexes de modification (SAGA, Sin3/Rpd3) et de remodelage ATP- dépendant de la chromatine (Ino80 et Swrl) et deux sous-groupes ont été identifiés comme ayant une activité cellulaire indépendante et distincte de NuA4 (PiccoloNuA4 et le trimère Eaf5/7/3). Cette organisation modulaire de NuA4 correspond aux multiples besoins de recrutements et de régulation d'Esal par la cellule lors des événements de réparation, de transcription et de replication de la chromatine. Chez l'humain, le complexe Tip60 est l'orthologue de NuA4 et regroupe les activités de modification de la chromatine de NuA4 et de Swrl. L'organisation spatiale de NuA4 présente donc beaucoup d'intérêt. Au sein du laboratoire du professeur Jacques Côté, je concentre mon travail sur la production et la purification du complexe NuA4. Avec nos échantillons hautement purifiés, les techniques d'analyse par microscopie électronique (EM) et de reconstitution informatique, réalisées par nos collaborateurs Johnathan Chittuluru et Francisco Asturias, permettent, avec une forte résolution, de visualiser le complexe en 3D. Les atouts majeurs associés à cette technique sont aussi de visualiser les interactions du complexe avec un nucléosome et de localiser les sous-unités dans le complexe (par deletion ou étiquetage). Dès lors, ces résultats apportent des indications pertinentes sur NuA4 et ces différents modules qui par recrutement ou interaction directe avec les histones participent à la régulation dynamique de la chromatine.

Le génome est organisé sous forme de chromatine afin de contourner la problématique d’espace limité dans le noyau. De plus, cette structure hautement condensé est une barrière physique aux processus cellulaires qui nécessite l’accès à l’information génétique. Les dernières années d'études ont dévoilé des complexes modificateurs de la chromatine comme des acteurs clés dans plusieurs mécanismes de modulation de la chromatine. L'un de ces modificateurs est NuA4, un complexe conservé au cours de l’évolution qui acétyle les histones H2A, H2A.Z et H4. Dans cette thèse, en utilisant Saccharomyces cerevisiae comme organisme modèle, nous avons identifié l'implication de NuA4 dans l'incorporation de H2A.Z et la biosynthèse des voies purines. Dans une seconde partie, nous étudions la participation de NuA4 dans la réponse aux dommages de l'ADN. Plus précisément, nous avons caractérisé la phosphorylation des sous-unités NuA4 dépendante de Mec1/Tel1. L’ensemble de ces travaux, comment NuA4 coordonne différentes activités cellulaires. / Cell genome is packaged into chromatin in order to compensate the limited space within the nucleus. However, this highly condensed structure also presents strong physical barriers for cellular processes using DNA as templates. Recent years of studies have unveiled chromatin modifying complexes as key players in several mechanisms of chromatin modulation. One of these modifiers is NuA4, an evolutionary conserved large multi-subunit histone acetyltransferase complex that acetylates histone H2A, H2A.Z and H4. In this thesis, using Saccharomyces cerevisiae as model system, we identified the implication of NuA4 in global histone variant H2A.Z incorporation and purine biosynthesis pathways. Moreover, we also show previously uncharacterized involvement of NuA4 in DNA damage response pathways through Mec1/ Tel1-dependent phosphorylation events on NuA4 subunits. Further analysis will shed light on detailed mechanisms about how NuA4, as a multifunctional complex, coordinates various cellular activities.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdorales, 2014-2015 / La chromatine est une structure nucléaire composée des histones, autour desquelles l’ADN s’enroule pour être empaqueté dans le noyau. La dynamique de cette structure permet de réguler plusieurs procédés nucléaires, tels que la transcription, la réplication et la réparation de l’ADN. Il existe, entre autre, des complexes de modifications de la chromatine qui collaborent à la régulation de ces différentes fonctions nucléaires. Les acétyltransférases de la famille MYST participent à l’acétylation des queues N-term des histones. Très conservées de la levure à l’humain, elles possèdent des rôles importants dans plusieurs processus cellulaires. Deux des complexes MYST ont été au cœur de mes études doctorales, soit le complexe HBO1 et MOZ/MORF. Mon projet de doctorat avait comme premier objectif de disséquer les différents domaines protéiques présents au sein de ces deux complexes et de caractériser leurs interactions soit avec les autres sous-unités, soit avec la chromatine. Par des analyses biochimiques, nous avons déterminé le mode d’assemblage des complexes MYST. Nous avons également caractérisé leurs différents domaines de reconnaissance de modifications post-traductionnelles des histones, afin de déterminer leur mode de recrutement. Des analyses à l’échelle du génome entier nous ont aussi permis de localiser ces protéines à des loci bien précis. De plus, il nous a été possible de constater l’importance de l’association des protéines INGs sur la fonction suppresseur de tumeur du complexe HBO1-JADE. Suite à une purification de la protéine BRPF1, j’ai pu constater l’association de HBO1 avec cette protéine. Comme deuxième objectif de thèse, j’ai donc eu à caractériser le nouveau complexe HBO1-BRPF1 et à démontrer sa spécificité d’acétylation. En utilisant des essais d’acétylation in vitro combinés à des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine, j’ai pu établir un nouveau mode de régulation de l’activité acétyltransférase de la protéine HBO1. Ce mécanisme étonnant démontre un changement de spécificité de l’activité catalytique des MYST en fonction de leur association aux protéines d’échafaudage. Tous ces résultats démontrent donc qu’il est important de considérer l’ensemble des sous-unités des complexes MYST, car elles sont toutes aussi importantes que l’enzyme pour la reconnaissance, la spécificité d’acétylation ainsi que les fonctions cellulaires de ces complexes. / Chromatin is a nuclear structure formed by DNA that is wrapped around histone octamers, allowing for its compaction in the nucleus. This structure is dynamic and regulates many nuclear processes, such as transcription, replication and DNA repair. Among other factors, complexes that modify chromatin collaborate for the regulation of these nuclear functions. The MYST acetyltransferase family participate in the acetylation of histone N-term tails. Highly conserved from yeast to human, they play various roles in many cellular pathways. During my PhD, I have focused on two of these MYST acetyltransferases, HBO1 and MOZ/MORF. The first objective of my project was to dissect the different protein domains comprised within these complexes and define their interactions either with other subunits or with chromatin. Using biochemical experiments, we brought to the forefront the assembly mechanism of the MYST complexes. Additionally, we characterized their chromatin recognition domains, which helped us determine their recruitment mechanism. Genome-wide analysis also gave us the precise localisation of these proteins on many loci. Moreover, we could determine that the association with ING subunits is essential for the tumor suppressor function of these complexes. Following purification of the BRPF1 protein, we could detect binding of the HBO1 protein. Thus, the second objective of my PhD project was to characterize the newly identified HBO1-BRPF1 complex and determine its acetylation specificity. Using in vitro acetylation assays combined with chromatin immunoprecipitation experiments, we unravelled a new regulation mechanism of the HBO1 acetyltransferase activity. This surprising mechanism shows a switch of histone tail acetylation specificity depending of the associated scaffold proteins, an activity previously thought to be intrinsic to the catalytic subunit. These data highlight a new role of the associated scaffold subunits within MYST-ING acetyltransferase complexes in directing the acetylation of specific histone tails. Altogether, these results demonstrate that it is important to consider MYST acetyltransferases as complexes, since their different subunits contribute to chromatin recognition, acetylation specificity and cellular functions.

La résistance aux antibiotiques apparaît aujourd'hui comme un problème majeur de santé publique, en particulier à cause de l'apparition de souches de bactéries multirésistantes par production d'enzymes de modification de ces antibiotiques. Nous avons étudié une de ces enzymes de résistance, l'AAC(6')-Ib conférant la résistance aux aminoglycosides, antibiotiques à large spectre utilisés principalement en milieu hospitalier pour lutter contre des infections sévères. Deux variants de cette enzyme se sont répandus dans les souches cliniques résistantes : le premier confère une résistance élargie à tous les aminoglycosides, le second confère une résistance élargie à une autre classe d'antibiotiques, les fluoroquinolones. Nous avons résolu la structure de l'enzyme sauvage et du premier variant par cristallographie aux rayons X. Nous avons également modélisé la structure du deuxième variant. Ces structures nous ont permis d'apporter une explication possible sur l'adaptation de cette enzyme aux différents antibiotiques. En parallèle, nous avons réalisé un criblage de ligands de cette enzyme par RMN à flux continu robotisé. Nous avons pu isoler plusieurs motifs se fixant dans le site actif de l'enzyme constituant des pistes intéressantes dans la conception d'inhibiteurs de l'activité enzymatique.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La régulation de la dynamique des chromosomes dicte la finalité de nombreux processus, tels la transcription, la réparation, la réplication et la recombinaison de l'ADN. Ce contrôle s'exerce notamment par la modification de la chromatine, un assemblage nucléoprotéique responsable de l'organisation de l'information génétique à l'intérieur du noyau des cellules eucaryotes. La chromatine constitue une plateforme dynamique et active où l'intégration de multiples événements de signalisation s'effectue. De ce fait, elle est porteuse d'une information épigénétique cruciale à l'homéostasie de la cellule et des organismes. Les complexes multiprotéiques pouvant modifier ou remodeler la structure de la chromatine sont au cœur de cette régulation. Leur caractérisation biochimique et fonctionnelle est donc primordiale à la compréhension des fonctions nucléaires. Une des modifications les mieux caractérisées est l'acétylation post-traductionnelle des queues N-terminales des histones, protéines structurales majeures de la chromatine. Chez Saccharomyces cerevisiae, le complexe histone acétyltransférase NuA4, dont l'activité catalytique est portée par la protéine Esal, est le seul de ce type à être essentiel à la viabilité de la levure. Cet assemblage de 13 sous-unités cible les extrémités des histones H2A et H4 et agit comme co-activateur transcriptionnel ainsi que co-facteur dans la réparation des cassures double brin de l'ADN. Le but premier mes études doctorales était de déterminer si le complexe NuA4 était conservé chez l'humain. Nous avons donc entrepris la purification et la caractérisation biochimique et fonctionnelle de ce complexe à partir de cellules humaines en culture. Ainsi, nous avons pu mettre en évidence l'étonnante conservation de NuA4 chez les eucaryotes, en plus d'observer l'évolution convergente de deux complexes aux activités distinctes, réunis en une seule entité chez les métazoaires. L'identification des différentes protéines constituant ces complexes nous a amené à caractériser l'environnement moléculaire d'une famille de suppresseurs de tumeur impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire et agissant comme co facteurs de p53; la famille « inhibitor of growth ». Ceci nous a permis d'identifier trois nouveaux complexes histone acétyltransférase chez l'humain. De plus, nous avons mis en évidence leur rôle essentiel dans le processus de réplication de l'ADN.

L'acétylation des histones module la structure de la chromatine et joue un rôle critique dans les processus liés à l'ADN, notamment l'expression génique. Dans la levure bourgeonnante *Saccharomyces cerevisiae*, le complexe NuA4 acétyle les histones H4 et H2A, ainsi que la variante d'histone Htz1, pour réguler la transcription. La formation de ribosomes fonctionnels nécessite la transcription coordonnée de 138 gènes de protéines ribosomiques (RP) et de plus de 200 gènes de biogenèse des ribosomes (RiBi). NuA4 est recruté aux promoteurs de ces gènes et acétyle les nucléosomes proches du promoteur. Cette thèse de doctorat examine les fonctions biologiques de NuA4 en tant que coactivateur dans la régulation de l'expression des gènes RP et RiBi en réponse à divers signaux environnementaux. Nous explorons l'interaction fonctionnelle entre NuA4 et Sfp1, un facteur de transcription sensible aux nutriments et au stress, et détaillons les implications de l'acétylation des lysines dépendante de NuA4 sur Sfp1. Le **Chapitre I** présente la méthode Anchor Away (AA), un outil de déplétion conditionnelle des protéines. Nous décrivons des procédures expérimentales détaillées pour réaliser la déplétion des protéines nucléaires, accompagnées de conseils pratiques. En utilisant AA, nous démontrons la déplétion rapide de Sfp1 et d'Esa1 (la sous-unité catalytique de NuA4) du noyau, comme en témoigne la diminution de la liaison de Sfp1 aux promoteurs des gènes RP et la perte de l'acétylation des histones dépendante de NuA4. Le **Chapitre II** présente nos principales conclusions concernant les rôles de Sfp1 et NuA4 dans l'expression des gènes RP et RiBi. À l'aide d'approches biochimiques et génomiques, nous révélons que NuA4 interagit avec Sfp1 pour faciliter la transcription des gènes RiBi et RP par des mécanismes distincts. De plus, nous examinons les conséquences fonctionnelles de l'acétylation de Sfp1 dépendante de NuA4 dans diverses conditions de croissance. Cette thèse enrichit notre compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels l'acétylation dépendante de NuA4 influence la transcription génique. / Histone acetylation modulates chromatin structure and plays a critical role in DNA-templated processes, including gene expression. In the budding yeast *Saccharomyces cerevisiae*, the NuA4 complex acetylates histones H4 and H2A, as well as the histone variant Htz1, to regulate transcription. The formation of functional ribosomes requires the coordinated transcription of 138 ribosomal protein (RP) genes and over 200 ribosome biogenesis (RiBi) genes. NuA4 is recruited to the promoter of these genes and acetylates the promoter-proximal nucleosomes. This doctoral thesis investigates the biological functions of NuA4 as a coactivator in regulating RP and RiBi gene expression in response to various environmental cues. We explore the functional interaction between NuA4 and Sfp1, a transcription factor sensitive to nutrients and stress, and detail NuA4-dependent lysine acetylation of Sfp1 and its implications. **Chapter I** introduces the Anchor Away (AA) method, a conditional protein depletion tool. We describe detailed experimental procedures to complete nuclear protein depletion in a step-by-step fashion, accompanied by troubleshooting tips. Using AA, we demonstrate rapid depletion of Sfp1 and Esa1 (the NuA4 catalytic subunit) from the nucleus, evidenced by reduced Sfp1 binding at RP gene promoters and loss of NuA4-dependent histone acetylation. **Chapter II** presents the main findings regarding the roles of Sfp1 and NuA4 in RP and RiBI gene expression. Using biochemical and genomic approaches, we reveal that NuA4 interacts with Sfp1 to facilitate transcription of RiBi and RP genes via distinct mechanisms. Additionally, we explore the functional consequences of NuA4-dependent acetylation of Sfp1 under various growth conditions. This thesis extends our understanding of the molecular mechanisms of NuA4-dependent acetylation on gene transcription.

Un xénobiotique subit plusieurs étapes de biotransformations simultanées ou successives dont les principaux sites sont les tissus situés à l'interface entre l'organisme et le milieu extérieur, à savoir : le tube digestif, l'appareil respiratoire, le rein et le foie. Ce dernier étant fonctionnellement le plus important. Les phases réactionnelles principales constituant les étapes de détoxification, phase I, phase II et phase III, ne sont possibles que par l'intervention de systèmes enzymatiques spécifiques. Etant donné la grande diversité des xénobiotiques auxquels l'organisme est exposé, il existe une multitude d'enzymes présentant des spécificités variées. Les réactions de biotransformation des xénobiotiques s'enchaînent rarement de façon linéaire, car deux voies ou plus prennent souvent naissance à partir d'un métabolite donné. On comprend dès lors que l'existence d'un variant enzymatique défectif pour l'une de ces voies réactionnelles pourra orienter le métabolisme d'une substance donnée vers une autre voie. Cette dernière, généralement mineure, prendra donc une grande importance et les polymorphismes qui la concernent pourront orienter le devenir des métabolites ainsi formés. La famille des N-acétyltransférases (NATs) fait partie des enzymes assurant principalement la réaction de conjugaison de la phase II de détoxification des xénobiotiques. Le polymorphisme des NATS représente l'un des exemples de variation pharmacogénétique décrit, et de l'un des plus documentés, depuis sa découverte au début des années 50, en même temps que la découverte de la grande efficacité de l'isoniazide (INH) dans le traitement de la tuberculose.Les travaux de cette thèse avaient pour objectif d'étudier le profil d'acétylation de la NAT2 dans la population sénégalaise afin de les répartir en acétyleurs lents et en acétyleurs rapides, et de déterminer la cinétique de l'isoniazide chez des sujets tuberculeux en corrélation avec les résultats de génotypage. L'étude des mutations du gène NAT2 a été effectuée par PCR-séquençage directe et a permis de mettre en évidence 11 variants alléliques dans la population sénégalaise.l'activité enzymatique de la NAT2 a été déterminée par utilisation du test à la caféine et le rapport des ratios des métabolites majeurs a permis classer les sénégalais en acétyleurs lents et rapides. La cinétique de l'isoniazide a utilisée la chromatographie UPLC-MS/MS. Ce travail présente les premiers résultats de l'étude de la NAT2 dans la population sénégalaise qui pourront être utilisés pour une meilleur optimisation de l'utilisation de l'INH dans la prise en charge de la tuberculose, maladie à forte prévalence en Afrique.