Mittels Laserblitz-Photolyse wurden die Triplettlebenszeiten sowie die Löschraten der Triplettzustände verschiedener Acetophenonderivate durch dG, 8-oxodG, DNA, molekularen Sauerstoff und die Ketone selbst bestimmt. Für AP-OAc, AP und BP wurden Triplettlebensdauern von 7-9 µs gemessen, während die Triplettzustände von AP-OH und AP-OtBu aufgrund alpha Spaltung deutlich kurzlebiger waren (ca. 1 µs); die alpha Spaltung konnte EPR-spektroskopisch durch Spinabfangexperimente mit DMPO und TEMPO belegt werden. Im Fall von AP-OMe wurde weder dessen Triplettzustand noch die Bildung von Radikalen detektiert, was auf einer schnell ablaufenden Norrish-Typ-II-Spaltung beruht. Aufgrund dieses photochemischen Verhaltens wurden die Ketone (mit Ausnahme von AP-OMe) in zwei Gruppen klassifiziert, nämlich die „Gruppe A“-Ketone (keine Radikalbildung) und die „Gruppe B“-Ketone (Radikalbildner). Während die „Gruppe A“-Ketone gegenüber niedrigen Konzentrationen von DNA (62.5 µM) inaktiv waren, verursachten die bei der Bestrahlung der „Gruppe B“-Ketone generierten Peroxylradikale, neben wenigen direkt induzierten Strangbrüchen, hauptsächlich die Guaninoxidationsprodukte 8-oxoGua und guanidinfreisetzende Produkte (GRP). Erst wenn die DNA-Konzentration zehnfach erhöht wird (625 µM), tritt bei der Photolyse der „Gruppe A“-Ketone auch DNA-Oxidation durch einen Elektronentransfer von der Guaninbase auf das angeregte Keton ein. Ein analoger Konzentrationseffekt wurde auch in der dG-Oxidation beobachtet, bei niedrigen Substratkonzentrationen sind nur die radikalbildenden „Gruppe B“-Ketone aktiv. Die Tatsache, dass in der dG-Oxidation durch die „Gruppe A“-Ketone kein 8-oxodG detektiert wurde, wurde auf dessen effiziente Oxidation durch dG•+-Radikalkationen zurückgeführt. Die „Gruppe B“-Ketone sind in Abwesenheit von O2 gegenüber dG und DNA oxidativ inaktiv, da die in der alpha Spaltung generierten kohlenstoffzentrierten Radikale keine Peroxylradikale bilden können. Die „Gruppe A“-Ketone sind gegenüber DNA in Abwesenheit wie auch in Anwesenheit von Sauerstoff genauso reaktiv, da der Elektronentransfer von DNA zum Keton unabhängig von Sauerstoff ist. Um mechanistische Einblicke in die oxidative DNA-Schädigung zu erlangen, wurden photochemische Modellstudien mit dem Nukleosid dG sowie 8-oxodG durchgeführt, wobei zusätzlich Spiroiminodihydantoin gebildet wird. Bis vor kurzem wurde die Struktur dieses Oxidationsproduktes als 4-HO-8-oxodG angenommen, dass zuerst in der dG Oxidation mit Singulettsauerstoff (1O2) beobachtet wurde. Weder Spiroiminodihydantoin noch 4 HO-8-oxodG sind als authentische Verbindungen bekannt, so dass eine zweifelsfreie Strukturaufklärung die Bestimmung der Konnektivität der markierten Positionen erforderte. Diese Zuordnung erfolgte mittels eines SELINQUATE-NMR Spektrums, mit dem schlüssig die 4 HO-8-oxodG-Struktur ausgeschlossen wurde. Wie alle „Gruppe B“-Ketone sind auch alle „Gruppe A“-Ketone in Abwesenheit von O2 mit Ausnahme von AP-OAc gegenüber dG inert. Dies ist ein Beleg dafür, dass der Elektronentransferschritt von dG zum Keton in Abwesenheit von Sauerstoff (im Gegensatz zur DNA-Oxidation) reversibel ist und daher keine Oxidation möglich ist, wenn die Ketylradikale nicht durch O2 abgefangen werden. Das aus AP-OAc gebildete Ketylradikal besitzt als einziges einen effektiven unimolekularen Deaktivierungsweg, nämlich die Acetation-abspaltung, so dass die Reversibilität nicht mehr möglich ist. / By using the laser-flash-photolysis technique, the triplet lifetimes of several acetophenone derivatives and their quenching rates by dG, 8-oxodG, DNA and molecular oxygen were determined. For AP-OAc, AP and BP, triplet lifetimes of 7-9 µs were obtained, while for AP OH and AP OtBu the lifetimes were significantly shorter (ca. 1 µs) due to alpha cleavage. The alpha cleavage was verified by spin-trapping experiments with TEMPO and DMPO by EPR-spectral detection. For AP-OMe, neither its triplet state nor radical formation was observed due to rapid Norrish-Type-II cleavage. On the basis of this photochemical behavior, the ketones (with the exception of AP-OMe) were divided into two groups, namely the “group A” ketones (no radical release) and the “group B” ketones (radical release). While the “group A” ketones were inactive at low (62.5 µM) DNA concentrations, the peroxyl radicals generated on irradiation of the “group B” ketones led to few directly induced strandbreaks; mainly the guanine oxidation product 8-oxoGua and guanidine-releasing products (GRP) were observed. Only when the DNA concentration was increased tenfold (625 µM), did the excited ketones oxidize DNA through electron transfer. An analogous concentration effect was observed with dG, since at low substrate concentrations only the radical-releasing “group B” ketones were oxidatively active. The fact that in the dG oxidation by the “group A” ketones no 8-oxodG was detected is attributed to the efficient oxidation of 8-oxodG by the dG•+ radical cation. In the absence of O2, the „group B“ ketones do not oxidize dG and DNA, because peroxyl radicals are not formed by trapping of the carbon-centered radicals produced upon alpha cleavage. Since electron transfer is independent of oxygen, the “group A” ketones display the same reactivity towards DNA, whether oxygen is present or not. To gain insight into the mechanism of the oxidative DNA damage, photochemical model studies with the nucleosides dG and 8-oxodG were performed, in which spiroiminodihydantoin was obtained as an additional oxidation product. Until recently, the supposed structure of this oxidation product was 4-HO-8-oxodG, which was first observed in the dG oxidation by singlet oxygen. Since neither spiroiminodihydantoin nor 4-HO-8-oxodG are available as authentic compounds, an unequivocal structural elucidation required to assess the connectivity of the marked atoms. This assignment was achieved by means of the SELINQUATE-NMR technique, which definetively allowed to exclude the 4-HO-8-oxodG structure. Analogous to the “group B“ ketones, in the absence of molecular oxygen also “group A“ ketones (except AP-OAc) are unreactive towards dG. Evidently, the electron-transfer step from dG to the triplet-excited ketone is reversible in the absence of oxygen, since no dG oxidation occurs when the ketyl radicals are not trapped by molecular oxygen. The ketyl radical derived from AP-OAc is unique in that it possesses a unimolecular deactivation pathway, namely the cleavage into an acetoxy ion and a benzoylmethyl radical, which provides irreversible electron transfer between triplet-excited AP-OAc and dG even in the absence of molecular oxygen.

Würzburg, Univ., Diss., 2002.

Mit Aminotransferasen können chirale Amine auf biotechnologischem Weg hergestellt werden. Diese besitzen große Bedeutung als Bausteine für weitere Synthesen in der pharmazeutischen und agrochemischen Industrie. Da natürlich vorkommende Enzyme oft nicht die gewünschte Substratspezifität für bestimmte industrielle Anwendungen besitzen, ist eine Optimierung durch Mutagenese notwendig. Solche Entwicklungen sind jedoch oft mit hohem Zeit- und Kostenaufwand verbunden. Die Optimierung kann entweder ungezielt durch empirische Methoden oder gezielt unter Einbeziehung von Informationen über das Enzym erfolgen. Die notwendigen Daten können als Vorbereitung zu konkreten Produktentwicklungen durch Untersuchungen an potentiell geeigneten Enzymen gewonnen werden. Um einen solchen rationalen Ansatz bei der einer speziellen Amin-Pyruvat-Aminotransferase zu ermöglichen, war es Ziel der vorliegenden Arbeit die Grundlagen für die Veränderung der Substratspezifität dieses Enzyms zu erarbeiten. Zunächst wurden strukturelle Informationen durch ein Homologie-Modell gewonnen und später durch eine experimentell bestimmte Struktur ergänzt. Mit dieser Struktur wurden die Substrat-bindenden Reste identifiziert und zunächst der Einfluss auf die Substratbindung durch ortsgerichtete Mutagenese überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass alle acht ausgewählten Aminosäurereste an der Substratbindung beteiligt sind. Zudem wurde unter diesen Positionen nach Mutanten gesucht, die neue Substrate umsetzen können. Eine Reihe von Mutanten wurde identifiziert, die verschiedene neue Substrate umsetzen. Für zwei Positionen konnten eine Reihe von Mutanten identifiziert werden, die neue Substrate akzeptieren. Durch die Art der Seitenketten, die Position der Aminosäuren und der chemischen Struktur der akzeptierten Substrate konnten eine Reihe von Aussagen über den Mechanismus der Substratbindung für diese Amin-Pyruvat-Aminotransferase gemacht werden. Außerdem wurde die Zweckmäßigkeit der eingesetzten theoretischen und experimentellen Methoden für die Anwendung bei Entwicklungen mit Enzymen dieser Klasse gezeigt.

Techn. Universiẗat, Diss., 2004--Dresden.

Mit Aminotransferasen können chirale Amine auf biotechnologischem Weg hergestellt werden. Diese besitzen große Bedeutung als Bausteine für weitere Synthesen in der pharmazeutischen und agrochemischen Industrie. Da natürlich vorkommende Enzyme oft nicht die gewünschte Substratspezifität für bestimmte industrielle Anwendungen besitzen, ist eine Optimierung durch Mutagenese notwendig. Solche Entwicklungen sind jedoch oft mit hohem Zeit- und Kostenaufwand verbunden. Die Optimierung kann entweder ungezielt durch empirische Methoden oder gezielt unter Einbeziehung von Informationen über das Enzym erfolgen. Die notwendigen Daten können als Vorbereitung zu konkreten Produktentwicklungen durch Untersuchungen an potentiell geeigneten Enzymen gewonnen werden. Um einen solchen rationalen Ansatz bei der einer speziellen Amin-Pyruvat-Aminotransferase zu ermöglichen, war es Ziel der vorliegenden Arbeit die Grundlagen für die Veränderung der Substratspezifität dieses Enzyms zu erarbeiten. Zunächst wurden strukturelle Informationen durch ein Homologie-Modell gewonnen und später durch eine experimentell bestimmte Struktur ergänzt. Mit dieser Struktur wurden die Substrat-bindenden Reste identifiziert und zunächst der Einfluss auf die Substratbindung durch ortsgerichtete Mutagenese überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass alle acht ausgewählten Aminosäurereste an der Substratbindung beteiligt sind. Zudem wurde unter diesen Positionen nach Mutanten gesucht, die neue Substrate umsetzen können. Eine Reihe von Mutanten wurde identifiziert, die verschiedene neue Substrate umsetzen. Für zwei Positionen konnten eine Reihe von Mutanten identifiziert werden, die neue Substrate akzeptieren. Durch die Art der Seitenketten, die Position der Aminosäuren und der chemischen Struktur der akzeptierten Substrate konnten eine Reihe von Aussagen über den Mechanismus der Substratbindung für diese Amin-Pyruvat-Aminotransferase gemacht werden. Außerdem wurde die Zweckmäßigkeit der eingesetzten theoretischen und experimentellen Methoden für die Anwendung bei Entwicklungen mit Enzymen dieser Klasse gezeigt.

A series of para-substituted acetophenones bearing a furanyl or a thiophenyl moiety show a large Stokes-shift, which is a function of various solvent properties. Photophysical properties such as emission lifetime of the compounds have been determined using time-correlated-single photon counting to secure the intrinsic fluorescence behaviour. The solvent dependent position of the UV/Vis emission band [small nu, Greek, tilde]max,em of the compounds has been measured in 26 various solvents. The influence of the solvent on [small nu, Greek, tilde]max,em is of very complex nature and mathematically analysed by multiple square linear solvation energy (LSE)-correlation analysis using Catalán's four-solvent parameter set. Solvent acidity has a strong influence on the bathochromic shift of 2,5-disubstituted furan derivatives compared to the non-5-substituted furan and thiophene derivatives, which show a contrary behaviour. Therefore, the 5-cyanofuranyl-substituted acetophenone derivative is useful as a probe for measuring environmental properties by fluorescence spectroscopy. / Dieser Beitrag ist aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

A series of para-substituted acetophenones bearing a furanyl or a thiophenyl moiety show a large Stokes-shift, which is a function of various solvent properties. Photophysical properties such as emission lifetime of the compounds have been determined using time-correlated-single photon counting to secure the intrinsic fluorescence behaviour. The solvent dependent position of the UV/Vis emission band [small nu, Greek, tilde]max,em of the compounds has been measured in 26 various solvents. The influence of the solvent on [small nu, Greek, tilde]max,em is of very complex nature and mathematically analysed by multiple square linear solvation energy (LSE)-correlation analysis using Catalán's four-solvent parameter set. Solvent acidity has a strong influence on the bathochromic shift of 2,5-disubstituted furan derivatives compared to the non-5-substituted furan and thiophene derivatives, which show a contrary behaviour. Therefore, the 5-cyanofuranyl-substituted acetophenone derivative is useful as a probe for measuring environmental properties by fluorescence spectroscopy. / Dieser Beitrag ist aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.