Ovarian cancer is a highly metastatic disease having a poor prognosis (<25%). The factors and underlying mechanisms that regulate ovarian cancer metastasis, however, are still incompletely understood. p70 S6 kinase (p70S6K), a serine/threonine kinase, is frequently activated in high-grade malignant human ovarian cancer. The aim of this study is to investigate the molecular mechanisms by which p70S6K may promote ovarian cancer metastasis. The results show that p70S6K is a critical regulator of the actin cytoskeleton, peritoneal adhesion and dissemination, and multicellular aggregates/spheroids formation in the acquisition of the metastatic phenotype. The regulation of p70S6K on the actin cytoskeleton is through two important functions: as an actin cross-linking protein and as a Rho family GTPase-activating protein. Ectopic expression of constitutively active p70S6K induced a marked reorganization of the actin cytoskeleton and directional migration of ovarian cancer cells. Actin binding and immunofluorescence studies showed that p70S6K had a direct interaction with the actin filaments with no other proteins involved. This interaction did not affect actin polymerization kinetics but cross-linked the actin filaments to inhibit cofilin-induced actin depolymerization. In addition, p70S6K mediated the activation of Rac1 and Cdc42 GTPases and their downstream effector p21-activated kinase 1, but not RhoA. Peritoneal adhesion and dissemination is regulated by p70S6K through integrin expression. Expression of p70S6K siRNA efficiently inhibited ovarian cancer cell adhesion to fibronectin and laminin among different peritoneal extracellular matrix components, as well as to human primary peritoneal mesothelial cells. These effects were associated with the expression of alpha5 and beta1 integrin. Studies into the mechanisms suggest that p70S6K may upregulate alpha5 integrin by a transcriptional mechanism whereas beta1 integrin is regulated at a post-transcriptional level. Enhanced expression of alpha5 and beta1 integrin by active p70S6K mediated the subsequent peritoneal adhesion. In ovarian cancer xenografts, p70S6K and beta1 integrin interference significantly inhibited peritoneal dissemination through reduction in the number and weight of tumors. Multicellular spheroids are present in the malignant ascites of ovarian cancer patients. Using a 3-dimensional culture system, expression of p70S6K siRNA resulted in inhibition of multicellular spheroid formation, which was mediated by N-cadherin but not E- or P-cadherin. In addition to spheroid formation, inhibition of p70S6K was associated with reduced growth of spheroids and disaggregation capabilities on different extracellular matrix components. Taken together, these findings indicate that p70S6K plays an important role in the biology of ovarian cancer metastasis through regulation of several critical steps in dissemination and migration, suggesting that p70S6K could be explored as a potential therapeutic target in ovarian cancer. / published_or_final_version / Biological Sciences / Doctoral / Doctor of Philosophy

No description available.

No description available.

To obtain a cell source for cartilage tissue engineering primary cells are passaged on polystyrene dishes to increase cell number however, this stiff environment results in dedifferentiation. This study evaluates the role of microenvironment stiffness on regulation of passaged chondrocyte phenotype. Results show passaged cells on soft polyacrylamide gels (0.5kPa) become round, less proliferative, less contractile, have higher levels of globular actin (g-actin) compared to filamentous actin (f-actin), MRTF localization in the cytoplasm and down-regulation of MRTF associated genes such as type I collagen, alpha-smooth muscle actin, transgelin, tenascin C and vinculin. This suggests that the chondrogenic phenotype during passaging is regulated by actin polymerization and activation of MRTF signaling that induces expression of non-chondrogenic genes, and has functional effects as the cells become proliferative and contractile. Modulating substrate stiffness maybe a way to influence aspects of the chondrogenic phenotype in order to obtain sufficient cells suitable for cartilage tissue engineering.

Meckel-Gruber syndrome (MKS) is a recessive genetic disease that is uniformly lethal in affected children due to resultant developmental defects in the kidney and brain. 13 MKS genes have been identified, and further candidate genes have been linked to this disease, all encoding unrelated proteins. Their role is believed to be in generation and compartmentalisation of the primary cilium, a microtubule-based organelle that functions in signal transduction of developmentally-crucial pathways. However, recent evidence indicates that these proteins are also likely involved in regulation of the actin cytoskeleton. Furthermore, research is beginning to uncover roles of other ciliopathy proteins in regulation of additional subcellular structures, such as the microtubule cytoskeleton, focal adhesions and the Golgi. To begin to understand the roles of the MKS proteins beyond the cilium, I examined a number of cellular features of patient fibroblasts carrying mutations in TMEM216 (MKS2) and TMEM67 (MKS3). In this thesis, I describe the temporal appearance and nature of prominent actin bundles observed in these cells, and analyse the dependency of these on the Rho/ROCK signalling pathway. Furthermore, I identify novel alterations to the microtubule cytoskeleton and organisation of the Golgi complex in MKS patient cells, and subsequently establish a temporal order of these phenotypes, demonstrating microtubule defects as the first to occur in these cells. Finally, I connect these phenotypic defects to Rho/ROCK signalling. In contrast to the prevailing view in the ciliopathy field, I believe that a diffusion barrier at the transition zone is not the primary role of MKS proteins. Instead I propose, supported by these data, that MKS protein complexes play a dual role as effectors of Rho signalling in addition to performing a structural role with particular importance in tethering the cytoskeleton to membranes. I therefore conclude that these, and other ciliopathy protein complexes, may act as important signal transduction and structural components at multiple locations throughout the cell.

Die proximale spinale Muskelatrophie (SMA) stellt eine der häufigsten erblichen Ursachen für den Tod im Kindesalter dar. Die Patienten leiden unter symmetrischer, langsam progredienter Muskelschwäche und in schweren Fällen auch an sensiblen Ausfällen. Die neurodegenerative Erkrankung wird autosomal-rezessiv durch Deletion bzw. Mutationen des SMN1-Gens (survival motor neuron 1-Gens) auf Chromosom 5q13 vererbt. Das SMN-Protein wird ubiquitär exprimiert und findet sich in allen untersuchten Geweben in einem Multiproteinkomplex, dem sogenannten SMN-Komplex, der die Zusammenlagerung von spleißosomalen Komplexen koordiniert. Die Funktion solcher Komplexe ist für alle Zelltypen essentiell. Deshalb stellt sich die Frage, welcher Pathomechanismus für die Erkrankung SMA verantwortlich ist. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Überlebensraten der Smn–/–;SMN2-Motoneurone 14 Tage alter Mausembryonen gegenüber Smn+/+;SMN2-Motoneuronen (Kontrollen) nicht reduziert waren. Bei der morphologischen Untersuchung der Zellen zum gleichen Entwicklungszeitpunkt zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede. Die Axonlängen der Smn-defizienten Motoneurone waren gegenüber Kontrollen signifikant verringert. Das Dendritenwachstum war nicht beeinträchtigt. Die Untersuchung der Wachstumskegel ergab bei den Smn–/–;SMN2 Motoneuronen eine signifikante Verminderung der Fläche gegenüber Kontrollen. Weiterhin zeigten sich Defekte im Zytoskelett. In den Motoneuronen von Kontrolltieren fand sich eine Anreicherung von beta-Aktin in perinukleären Kompartimenten sowie besonders stark in den Wachstumskegeln. Die beta-Aktin-Anreicherung nahm im Verlauf des Axons zu. In Smn–/–;SMN2-Motoneuronen war keine Anreicherung im distalen Axon oder in den Wachstumskegeln detektierbar. Eine gleichartige Verteilungsstörung fand sich für das SMN-Interaktionsprotein hnRNP R (heterogenous nuclear ribonucleoprotein R) und, wie andere Arbeiten zeigen konnten, auch für die beta-Aktin-mRNA, die spezifisch an hnRNP R bindet. In gleicher Weise wurden auch Veränderungen in den sensorischen Neuronen aus den Hinterwurzelganglien 14 Tage alter Mausembryonen untersucht. Bei Smn–/–;SMN2-Mäusen war die Neuritenlänge sensorischer Neurone im Vergleich zur Kontrolle gering, jedoch signifikant verkürzt und die Fläche der Wachstumskegel hochsignifikant verringert. Im Smn–/–;SMN2 Mausmodell für eine schwere Form der SMA fanden sich in den sensorischen Nervenzellen im Vergleich zu den Motoneuronen geringer ausgeprägte, jedoch gleichartige Veränderungen, was auf einen ähnlichen Pathomechanismus in beiden Zelltypen hinweist. / Proximal spinal muscular atrophy (SMA) represents one of the most common hereditary diseases leading to death in childhood. The patients suffer from symmetric and slowly progressive muscle weakness and atrophy as well as sensory defects in severe cases. The neurodegenerative autosomal recessive disease is caused by deletion or mutations of the survival motor neuron 1 (SMN1) gene on chromosome 5q13. The SMN protein is expressed ubiquitously and it is found associated in a multiprotein complex, termed SMN complex, in all tissues under observation. It coordinates spliceosomal complex assembly. The function of these complexes is essential for all cell types. Hence, the question is which pathomechanism causes SMA. Here, we demonstrate that the survival rate of Smn–/–;SMN2 motor neurons of 14-day-old mouse embryos was not reduced in comparison to Smn+/+;SMN2 motor neurons (controls), whereas morphological differences were apparent at the same developmental stage of the cells. Axon length in Smn-deficient motor neurons was significantly reduced vs. control motor neurons. Dendritic outgrowth was not affected. Investigation of the growth cone area of Smn–/–;SMN2 motor neurons showed a significant reduction vs. controls. Additionally, defects in the cytoskeletal structure were detected. In motor neurons of control animals, accumulation of beta-actin was found in the perinuclear compartments, and more pronounced in the growth cones, with an increase of beta-actin accumulation along the axon. In Smn–/–;SMN2 motor neurons, no beta-actin accumulation was detected in distal parts of the axon or in the growth cones. The same imbalance was found for the distribution of the SMN interacting protein hnRNP R (heterogenous nuclear ribonucleoprotein R), and, as shown by others, also for the distribution of beta-actin mRNA, which specifically binds to hnRNP R. In the same manner, alterations of the sensory neurons from dorsal root ganglia of 14-day-old mouse embryos were examined. Neurite outgrowth length of Smn–/–;SMN2 sensory neurons was reduced to a small extent, but significantly, in comparison to control neurons, and reduction of the growth cone area was highly significant. In the Smn–/–;SMN2 mouse model resembling a severe type of SMA, alterations in sensory neurons were less prominent than defects in motor neurons, but of the same kind, pointing to a similar pathomechanism in both cell types.

Die proximale spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine autosomal rezessive Erb-krankheit, welche durch fortschreitende Muskelatrophie mit Betonung der pro-ximalen Extremitäten, sowie zunehmende motorische Lähmungen charakterisiert wird. Bedingt wird diese neurodegenerative Erkrankung durch Mutation bzw. Deletion des SMN1-Gens auf Chromosom 5q13. Dies führt zu reduzierten Mengen des ubiquitär exprimierten SMN-Proteins, da der Verlust des SMN1-Gens nicht durch das noch verbleibende SMN2-Gen kompensiert werden kann. Die SMN-Promotor-Region enthält ein CRE II bindendes Element, welches Effekte von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) vermittelt und so die SMN-Transkription in untersuchten Zellen stimuliert. Ausgehend von diesem Befund stellte sich die Frage, ob cAMP dem Mangel an volllängen SMN bei der SMA entgegen wirkt. Daher wurden für diese Dissertation neurosphärenbildende kortikale Vorläuferzellen und primär kultivierte Motoneuronen von Smn+/+; SMN2- und Smn–/–;SMN2-Mausembryonen untersucht, um zu klären, ob die cAMP-Behandlung der Zellen zu einer Hochregulierung des SMN2-Transkripts führt, und durch die resultierende Erhöhung des SMN-Proteingehalts morphologische und funktionelle Defekte kompensiert werden. Die Untersuchung zeigte eine signifikante Zunahme des SMN2-Transkriptgehalts in Anwesenheit von cAMP. Dadurch kam es zu einem Anstieg der SMN-Proteinmenge im Soma, Axon und Wachstumskegel von Smn–/–;SMN2-Motoneuronen. Die Verteilungs-störung des SMN-Interaktionspartners hnRNP R mit fehlender kontrolltypischer Anreicherung im distalen Axon und Wachstumskegel von Smn–/–;SMN2-Motoneuronen wurde ebenfalls durch cAMP kompensiert. Smn-defiziente Mo-toneurone zeigten im Vergleich zu Kontrollzellen kleinere Wachstumskegel sowie ein Defizit an &#946;-Aktin im distalen Axon. Zudem fehlte in Smn–/–;SMN2-Motoneuronen die bei Kontrollen ausgeprägte Zusammenlagerung von N-Typ spezifischen Ca2+-Kanälen in der Präsynapse, die nach Kontakt mit der &#946;2-Kette des endplattenspezifischen Laminin-221 spontan öffnen und so einen in-trazellulären Kalziumanstieg bewirken, wodurch es zu Erregbarkeitsstörungen und Axonelongationsdefekten bei Smn-defizienten Motoneuronen kommt. Die Behandlung der Smn-defizienten Motoneuronen mit cAMP führte zur Vergrößerung der Wachstumskegelfläche und zu einer im Verlauf des Axons zunehmenden Anfärbung mit &#946;-Aktin. Außerdem kam es zu einer Erhöhung der Menge an Cav2.2-Kanalprotein in den Wachstumskegeln Smn-defizienter Motoneurone, was mit einer erhöhten Erregbarkeit korrelierte und zu einer Normalisierung der Axonlänge von Smn–/–;SMN2-Motoneuronen auf Laminin-221 führte. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen die Vermutung zu, dass Smn-defiziente Motoneurone in vivo Defekte im präsynaptischen Bereich der Motorendplatte aufweisen. In Zukunft können mit dem beschriebenen in vitro Assay weitere Substanzen, welche die SMN2-Traskription stimulieren, auf ihr kompensatorisches Potential getestet werden. / Proximal autosomal recessive spinal muscular atrophy (SMA) is caused by mutation or deletion of the SMN1-gene on chromosome 5q13. The SMN promotor region contains a CRE II binding element, which mediates effects of cyclic adenosine monophosphate and stimulates the SMN transcription in examined cells. In animal models of SMA, spinal motoneurons exhibit reduced axon elongation and growth cone size. These defects correlate with reduced ß-actin protein levels in distal axons. In this study I examined primary cultured motoneurons from Smn+/+;SMN2- and Smn-/-;SMN2-mice embryos. The examination could show a significant increase of the SMN2 transcript by treating the cells with cAMP. The Smn protein level increases in the soma, axonal department and growth cones of Smn-deficient motoneurons which were treated with cAMP in cell culture. I could also show that Smn–deficient motoneurons exhibit severe defects in clustering Cav2.2 channels in axonal growth cones and that treating with cAMP compensate these defects. Growth cone size, axonal length, hnRNP R protein levels and ß-actin protein levels in distal axons being normalized by cAMP treating of the Smn-/-;SMN2-motoneurons. Other substances, which stimulate the SMN2 transcription, can be tested in the future with the in this study established in vitro assay.

Bei Yeast Two-Hybrid Untersuchungen wurde in unserer Arbeitsgruppe das RNA-Bindungsprotein hnRNP-R als Interaktionspartner von SMN gefunden und es konnte gezeigt werden, dass hnRNP-R mit SMN in Axonen von primären Motoneuronen kolokalisiert (Rossoll et al., 2002). hnRNP-R assoziiert mit der β-Aktin mRNA und nach Überexpression kommt es zu einer Akkumulation von β-Aktin in den Wachstumskegeln von neuronalen Zellen, sowie zu verstärktem Neuritenwachstum bei PC12 Zellen. Wird die SMN-Bindungsdomäne von hnRNP-R deletiert, ist dieser Effekt stark reduziert (Rossoll et al., 2003). Auf diesen in vitro Befunden ist die Hypothese begründet, dass hnRNP-R an der Translokation der β-Aktin mRNA in die Wachstumskegel von neuronalen Zellen beteiligt ist. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit die Rolle von hnRNP-R bei der Entwicklung in Neuronen des Nervensystems näher untersucht. Dazu wurden Zebrafisch Embryonen als in vivo Modellsystem für Morpholino vermittelte Knockdown Untersuchungen gewählt. Zunächst wurde ein gegen murines Protein hergestelltes hnRNP-R Antiserum charakterisiert und gezeigt, dass es das Zebrafisch Protein spezifisch erkennt. Dieses Antiserum wurde in Western Blot Analysen verwendet um den hnRNP-R Knockdown in Zebrafisch Embryonen zu verifizieren. Bei den hnRNP-R Morpholino injizierten Embryonen konnten dosisabhängig axonale Veränderungen beobachtet werden. Diese Veränderungen stimmen mit einem Krankheitsmodell für SMA im Zebrafisch überein. Es konnte gezeigt werden, dass das Überleben primärer Motoneurone in Zebrafisch Embryonen nicht beeinträchtigt ist und dass andere neuronale Zellen keine signifikante Beeinflussung durch einen hnRNP-R Knockdown erfahren. Um die Spezifität des axonalen Phänotyps, der durch hnRNP-R Knockdown hervorgerufen wurde zu belegen, wurde mit muriner hnRNP-R mRNA ein Rescue-Experiment durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass dabei der axonale Phänotyp weitestgehend wieder aufgehoben wurde. Parallel zu den Zebrafisch Experimenten wurde ein hnRNP-R Knockout Konstrukt mittels homologer Rekombination in Escherichia coli hergestellt und in murine embryonale Stammzellen elektroporiert. Die Charakterisierung einer hnRNP-R Knockout Maus könnte weitere bedeutende Einsichten in die in vivo Funktionen von hnRNP-R bei der Embryonalentwicklung und speziell der Entwicklung von Motoneuronen gewähren. Um der Frage nach zu gehen, welche mRNAs in Wachstumskegeln von Axonen primärer Maus Motoneuronen zu finden sind oder durch Transportprozesse lokal akkumuliert sind,wurden Versuche unternommen, um mittels Laser-Mikrodissektion einzelne Wachstumskegel von Motoneuronen für Untersuchungen der enthaltenen mRNAs zu gewinnen. Erstmalig ist es im Rahmen dieser Arbeit gelungen, kompartimentalisierte Kulturen von primären Motoneuronen der Maus zu etablieren. Damit wurde die Grundlage geschaffen, um RNA-Profile von distalen Zellkompartimenten wie den Axonen und Wachstumskegeln zu bestimmen. / In previous yeast two-hybrid studies, we have shown that hnRNP-R is an interaction partner of SMN and that it co-localises with SMN in axons of primary motor neurons (Rossoll et al., 2002). hnRNP-R associates with the β-actin mRNA and after overexpression, an accumulation of β-actin in growth cones of neuronal cells and elongated neurite growth of pc12 cells could be observed. If the SMN binding domain of hnRNP-R was deleted, this effect was strongly reduced (Rossoll et al., 2003). On this in vitro observations the hypothesis is based, that hnRNP-R plays an important role in the translocation of β-actin mRNA to the growth cones of neuronal cells. For that reason, the role of hnRNP-R in the development of neuronal cells of the nervous system was investigated in more detail, in line with this thesis. We have chosen embryonic zebrafish as an in vivo model system for morpholino mediated knockdown analysis of hnRNP-R. First of all an antiserum that has been generated against murine hnRNP-R protein was characterised and it could be shown that it specifically recognises the zebrafish protein. This antiserum was used in western blot analysis to verify the hnRNP-R knockdown in embryonic Zebrafish. Dose dependent axonal phenotypes could be described in hnRNP-R morpholino injected embryos, that resembled the alterations, observed in a disease model for SMA in zebrafish. We could show that the survival of motor neurons in zebrafish embryos was not impaired and that other populations of neuronal cells, were not significantly affected by the hnRNP-R knockdown. To prove the specificity of the axonal phenotype after hnRNP-R knockdown, a rescue experiment with co-injected mouse hnRNP-R mRNA has been performed, that nearly abolished the axonal phenotype. In parallel to the zebrafish experiments an hnRNP-R knockout construct was made by homologues recombination in Escherichia coli. This construct has been electroporated into embryonic stem cells of mice, and obtained clones have been screened. The characterisation of an hnRNP-R knockout mouse could reveal important insights of in vivo functions of hnRNP-R in embryonic development and especially the development of motor neurons. To answer the question, which mRNAs are located in growth cones of primary mouse motor neurons, or are locally accumulated due to mRNA transport processes, growth cones of primary mouse motor neurons have been cut by laser micro dissection. For the first time, compartmentalised cell cultures of primary motor neurons could be established during this thesis, providing the background to generate detailed RNA profiles of distal cell compartments like axons and growth cones.

This project focused on extracellular signal-regulated kinase (ERK) and focal adhesion proteins related to ERK activity, and found a novel signaling pathway contributing to aging-related defects in smooth muscle contractility. Previous members of our lab have used ERK inhibitors to demonstrate the role of ERK in smooth muscle contraction. Dr. Nicholson used the ERK inhibitor FR 18024 and noted that, in the presence of this inhibitor phenylephrine (PE) induced a higher stress increase in young mouse aortas compared to old aortas. Inhibition of the kinase ERK abolished this difference. He also quantitated ERK phosphorylation, a marker of ERK activation in PE-stimulated aortas from both young and aged mice and found a significant lower level of phosphorylated-ERK (p-ERK) in aged mouse aortas. I was interested in determining the substrate of ERK that is affected in aging. Caldesmon (CaD) is one of the known substrates of ERK in smooth muscle. More importantly, CaD, as an actin-binding protein, inhibits cross-bridge formation by blocking the interaction between actin and myosin. Thus, I tested the hypothesis that, caldesmon phosphorylation is inhibited in aged mouse aortas. To determine the mechanism by which regulation of ERK activation changes with age, the role of micro-RNAs (miRs) in the regulation ERK phosphorylation was investigated. Transfection of miR-137 and -34a into A7r5 cells resulted in a significantly lower level of p-ERK in response to the phorbol ester DPBA. Further, together with my collaborators I found that transfection of miR-137 and -34a led to significantly decreased focal adhesion protein levels in A7r5 smooth muscle cells, such as paxillin and src. To confirm whether focal adhesion proteins contribute to the impairment of agonist-induced ERK phosphorylation, paxillin siRNA and src inhibitor were used. The results showed that paxillin is required for the phosphorylation of ERK1 and ERK2 and src is required for ERK2 phosphorylation. In conclusion, age-related increases in miR-137 and -34a decrease ERK phosphorylation via downregulation of paxillin and src. The decrease in ERK phosphorylation leads to a decrease in CaD phosphorylation and inhibits contraction. Thus, the thin filament-coupled pathway in differentiated vascular smooth muscle is inhibited in the aged mouse aorta and this leads to aging-associated defects in smooth muscle contractility. / 2021-06-18T00:00:00Z

Die c-Jun-N-terminale Kinase (JNK), ein Mitglied der Familie der MAP-Kinasen (Mi-togen Activated Protein Kinases), wirkt als signalübertragender Effektor, der den klei-nen GTPasen der Rho–Familie Rac und Cdc42 nachgeschaltet ist. Rho-GTPasen spielen eine Schlüsselrolle in der Regulation von zellulären Aktinstrukturen und steuern Prozesse in der Zelle, die Änderungen der Aktinstruktur erfordern, wie z.B. Änderungen der Zellmorphologie, Zellmigration, Wachstum und Differenzierung. Genetische Studien an der Fruchtfliege Drosophila melanogaster konnten eine Rolle des Drosophila-JNK-Homologs DJNK(basket) in der Regulation von Zellbewegungen und Zellmorphologieänderungen während der Drosophila-Embryogenese zeigen. Inhibierung der Funktion von DJNK auf allen Stufen der DJNK-Signaltransduktions-kaskade führt zum sogenannten dorsal closure-Phänotyp der Embryonen mit fehlender Zellstreckung und fehlender Migration dorsaler Epithelzellen. Der molekulare Mechanismus, mit dessen Hilfe Rho-GTPasen Aktinstrukturen regu-lieren und wie JNK Einfluss auf Zellmorphologie und Zellbewegung nimmt, ist bisher nicht bekannt. Die Identifizierung neuer, mit JNK interagierender Proteine könnte zum besseren Verständnis der Funktion und Regulation von JNK führen. In dieser Arbeit wurde ein Yeast-Two-Hybrid-Screen mit dem Drosophila-Homolog DJNK/basket durchgeführt, der zur Entdeckung des Drosophila-Proteins p150-Spir als Interaktionspartner von DJNK führte. Der C-terminus des p150-Spir-Proteins enthält eine JNK-Interaktionsdomäne, ein DEJL-Motiv (Docking Site for Erk and JNK, LxL) und wird von aktivierten JNK-Proteinkinasen phosphoryliert. p150-Spir ist ein Multi-Domänen-Protein, das in seiner aminoterminalen Hälfte eine Aufeinanderfolge von vier WH2-Domänen (Wiskott Aldrich Homology Domain 2) enthält. WH2-Domänen binden monomeres Aktin, Proteine mit WH2 Domänen, wie z.B. WASP oder WAVE sind Aktinreorganisatoren. Die transiente Überexpression von p150-Spir in NIH3T3-Mausfibroblasten führt ebenfalls zu einer Aktinreorganisation. Eine weitere Domäne in p150-Spir ist eine modifizierte FYVE-Zinkfinger-Struktur (mFYVE) im zentralen Bereich des Proteins, die für die subzelluläre Lokalisation von p150-Spir von Bedeutung ist. Mutationen, welche die Zinkfingerstruktur zerstören, führen bei Überexpression in NIH3T3-Zellen zu einer zytoplasmatischen Lokalisation der mutierten p150-Spir-Proteine, während Wildtyp-p150-Spir perinukleär akkumuliert. Spir-Proteine sind evolutionär hoch konserviert. Es konnten Spir-ähnliche Sequenzen auf den humanen Chromosomen 16 und 18, in der Maus und in der Seescheide Ciona savignyi gefunden werden. Der höchste Grad an Konservierung besteht im Bereich der funktionellen Proteindomänen. Ein in allen Spir-Proteinen ent-haltenes, als Spir-Box bezeichnetes hoch konserviertes Sequenzmotiv befindet sich unmittelbar vor dem mFYVE-Zinkfinger. Die Spir-Box zeigt Strukturverwandschaft zur Rab-GTPase-Bindungsregion in Rabphilin 3A, einem Protein, das ebenfalls eine FYVE-Domäne besitzt. Rab-GTPasen sind wie FYVE-Domänenproteine in die Regulation zellulärer Vesikeltransportprozesse involviert. Das Vorhandensein beider Do-mänen in p150-Spir deutet auf eine Rolle des Proteins in zellulären Transportprozes-sen hin. Ein denkbares Modell wäre, daß p150-Spir unter der Kontrolle von JNK-Signalen zelluläre Aktinstrukturen reguliert, die für Transportprozessse in der Zelle von Bedeutung sind; p150-Spir fungiert damit möglicherweise als direktes Bindeglied zwischen MAPK-Signaltransduktionskaskaden und dem Aktinzytoskelett. / Summary c-Jun-N-terminal kinases (JNKs) are members of the MAPK family (mitogen activated protein kinases) and act as downstream effectors of Rho family-GTPases, Rac and Cdc42. Rho family GTPases are involved in the regulation of cellular actin structures and control cellular processes which require remodelling of the actin skeleton, such as morphological changes, migration, growth and differentiation. A role for the Drosophila JNK-homolog DJNK/basket in the regulation of cell move-ment and cell shape changes during Drosophila embryogenesis arises from its func-tion in the process of dorsal closure. Inhibition of the DJNK-cascade results in a mu-tant phenotyp, where the dorsal elongation and migration of the epithelial cells fails. However, a direct link between JNK signaling and actin reorganization has not yet been established. A Yeast-Two-Hybrid-Screen using DJNK as a bait led to the discovery of the new Drosophila protein p150-Spir. p150-Spir is a multi-domain protein with a stretch of acidic amino acids, a cluster of 4 WH2-domains (Wiskott Aldrich Homology Domain 2), a Spir-Box and a modified FYVE zinc-finger motif (mFYVE). In addition, the C-terminus of p150-Spir harbors a docking site for ERK and JNK, LXL (DEJL-motif) and is phosphorylated by JNK in vitro and in vivo. When coexpressed with p150-Spir in NIH3T3 cells, JNK translocates to and colocalizes with p150-Spir at discrete spots around the nucleus. In its N-terminal part p150-Spir possesses 4 WH2-Domains. WH2-domains bind monomeric actin and WH2-family proteins, such as WASP and WAVE are involved in actin reorganization. We can show that in NIH3T3 mouse fibroblasts, p150-Spir co-localizes with F-actin and its overexpression induces clustering of filamentous actin around the nucleus. A modified FYVE zinc-finger structure (mFYVE) is located in the central region of the protein. FYVE-fingers mediate cell membrane localization of proteins. Disruption of the p150-Spir mFYVE-structure by deletion mutagenesis or cysteine/serine substitu-tions shows that the mFYVE-domain determines the subcellular localisation of p150-Spir. In contrast to the perinuclear distribution of the wild type p150-Spir, the mutated protein exhibits a uniform cytoplasmic distribution. Spir-family proteins are highly conserved among different species. Comparison of Drosophila p150-Spir sequences to EST data bases identified similar sequences in human (on chromosomes 16 and 18), mouse and the ascidian Ciona savignyi. A con-served sequence motif found in all Spir proteins - called Spir-Box - is located in the N-terminus, next to the mFYVE domain. Close inspection of the Spir-Box sequence revealed homology to the GTPase binding region of Rabphilin 3A, a FYVE domain containing protein which binds the small GTPase Rab3a. Rab-GTPases are involved in the regulation of cellular vesicle trafficking processes. The presence of a mFYVE domain in p150-Spir protein and a Spir-Box - a possible Rab-GTPase binding motif - suggests a potential function of Spir proteins in vesicel transport. In a possible model Spir initiates remodelling processes of the actin cytoskeleton, necessary for cellular transport processes under the control of JNK signals and thereby provides a direct link between MAPK-signaling and the actin cytoskeleton.