Schaut man durch ein Mikroskop auf eine biologische Zelle mit angefärbten Zytoskelett, so erblickt man lange, mehr oder minder gerade Objekte. Mit ziemlicher Sicherheit gehören diese zu einer von drei Arten von Zytoskelettfilamenten -- Aktin- oder Mikrofilamente, Intermediärfilamente und Mikrotubuli. Schon seit mehreren Jahrzehnten versucht man die mechanischen Eigenschaften lebender Zellen nicht nur zu beschreiben, sondern ihr Verhalten von zwei tieferen Ebenen ausgehend zu verstehen: Inwiefern beschreiben die Eigenschaften von Filamentnetzwerken und -gelen die Zellmechanik und, noch tiefgreifender, wie bestimmen eigentlich die einzelnen Filamente die Netzwerkmechanik. Das Verständnis der Mechanik homogener und isotroper, verhedderter als auch quervernetzter Gele ist dabei erstaunlich detailreich, ohne jedoch vollständig dem jüngeren Verständnis von Zellen als glassartige Systeme zu entsprechen. In den letzten Jahren sind daher anisotrope Strukturen mehr und mehr in den Fokus gerückt, die die Bandbreite möglichen mechanischen Verhaltens enorm bereichern. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit solch einem hochgradig anisotropen System -- nämlich Aktinbündeln -- unter drei Gesichtspunkten. Mit Hilfe von aktiven Biegedeformationen wird ein funktionales Modul, das eine differentielle Antwort auf verschiedenen Zeitskalen liefert, identifiziert. Es handelt sich um Aktinfilamente, die durch transiente Quervernetzer gebündelt werden. Während sich das System nach kurz anhaltenden Deformation völlig elastisch verhält, sorgt eine Restrukturierung der Quervernetzer während langanhaltender Deformationen für eine plastische Verformung des Bündels. In einem weiteren Aspekt widmet sich die Arbeit der frequenz- und längenabhängigen Biegesteifigkeit. Die Methode des Bündel-Wigglings, das Induzieren von \"Seilwellen\", wird dabei genutzt, um aus der Wellenform die Biegesteifigkeit zu berechnen. Bündel von Aktinbündeln zeigen dabei ein Verhalten, das vom klassischen Worm-like-chain-Modell abweicht und stattdessen durch das Worm-like-bundle-Modell beschrieben werden kann. Der letzte Aspekt dieser Arbeit untersucht den Musterbildungsprozess bei der Entstehung von Aktinbündeln. Gänzlich unerwartet entstehen quasi-isotrope Strukturen mit langreichweitiger Ordnung, wenn der Bündelungsprozess erst nach der Polymerisation von Filamenten frei von zusätzlichen mechanischen Einwirkungen einsetzt. Da dieser Zustand nicht von der klassischen Flüssigkristalltheorie vorhergesagt wird, soll eine Simulation eine Hypothese zum Entstehungsmechanismus testen. Die Annahme einer lateralen Kondensation von Filamenten zu Bündeln reicht demnach aus, um die beobachteten Strukturen zu erzeugen. Diese Arbeit leistet somit einen Beitrag zum Verständnis hochgradig anisotroper Strukturen und deren Überstrukturen, wie sie auch in lebendigen Zellen reichlich vorhanden sind. / Being the most basic unit of living organisms, the cell is a complex entity comprising thousands of different proteins. Yet only very few of which are considered to play a leading part in the cell’s mechanical integrity. The biopolymers actin, intermediate filaments and microtubules constitute the so-called cytoskeleton – a highly dynamic, constantly restructuring scaffold endowing the cell not only with integrity to sustain mechanical perturbations but also with the ability to rapidly reorganize or even drive directed motion. Actin has been regarded to be the protagonist and tremendous efforts have been made to understand passive actin networks using concepts from polymer rheology and statistical mechanics. In bottom-up approaches isotropic, homogeneous actin-gels are well-characterized with rheological methods that measure elastic and viscous properties on different time scales. Cells, however, are not exclusively isotropic networks of any of the mentioned filaments. Rather, actin alone can already be organized into heterogeneous and highly anisotropic structures like bundles. These heterogeneous structures have only come into focus recently with theoretical work addressing bundle networks. and, in the case of the worm-like bundle theory, individual bundles. This work aims at characterizing bundles and bundle-crosslinker systems mechanically in two complementary approaches – in the time as well as in the frequency domain. In addition, it illuminates a bundle formation mechanism that leads to bundle networks displaying higher ordering.

Breast cancer metastasis is one of the reasons why this type of cancer is destructive even after treatment as it tends to move from one organ to another increasing the risk factor for an individual. In the metastatic cascade, the tumour undergoes many different types of stress, including extracellular (ECM) stiffness. Key proteins that have been linked to the change in stiffness of the ECM are YAP and β-catenin. Both functions similarly in the manner that they need to translocate to the nucleus and bind to their respective transcription factors in order to activate their downstream genes. In parallel this seems to be on a stiffness dependent manner. Therefore, the hypothesis is that β-catenin is able to compensate for YAP function when YAP is downregulated in a stiffness dependent manner. In this work, results show a significant increase of YAP and β-catenin translocation to the nucleus of MDA-MB-231 cells when they are subject to the stiffer substrate in comparison to the softer substrate indicating increase gene expression of their respective pathways. The effect of the stiffness was then analyzed by doing single knockdown experiments with siRNA. To investigate the response of β-catenin, knocking down YAP was done, and it was shown that β-catenin translocation significantly increased on the softer matrix, while stiffer matrix showed no significant difference. Downstream gene expression also confirmed this idea with CTGF being downregulated with β-catenin knockdown and AXIN2 being downregulated with YAP knockdown. In the cell behavioural aspect, only when the double knockdown of YAP and β-catenin was done, the migration and proliferation rate had significant lowered. This echoes the idea further of the compensating effects of β-catenin to YAP. In addition, the exploration of the cytoskeleton network was investigated, as this is a key component in protein pathways, by treating the cells using LatA and Blebbistatin, affecting F-actin and myosin-II respectively. Knowing the critical role of cytoskeletal proteins in mechanotransduction, the hypothesis is that actin filaments and myosin-II mediate the YAP & β-catenin nuclear translocation activation. Findings show the direct relationship between F-actin and YAP as actin polymerization state significantly decreased when YAP was knockdown in a similar manner to when LatA was added. When myosin-II was added, both YAP and β-catenin nuclear translocation were affected, indicating its potential role in mechanotransduction. Furthermore, it was found that cell confluency and PIEZO1 activation had significant effects in YAP & β-catenin translocation. By seeding the cells with different densities, the β-catenin signalling could be visualized with IF staining, with the conclusion that at high confluency, the β-catenin translocation was alleviated. For the PIEZO1 studies, results indicate that PIEZO1 is an upstream regulator of YAP by doing single knockdown experiments and subsequently analysing YAP signalling. The findings underscore the potential significance of β-catenin as a modulator of mechanotransduction in the absence of YAP, showcasing the complexity of the protein signalling network orchestrating cellular response due to mechanical cues. Unravelling these protein interplay could offer novel insights into therapeutic targets for breast cancer mechanotransduction. Ultimately, this research adds to the understanding of the intricate protein signalling that governs mechanotransduction in breast cancer cells. The discovery of stiffness dependent YAP & β-catenin signalling, the interplay between YAP and β-catenin pathway mechanotransduction implicated by cell density, the regulation of YAP- β-catenin interplay in mechanotransduction by PIEZO1, the importance of F-actin & myosin-II in YAP & β-catenin translocation, and the YAP & β-catenin effects on cell behaviour, all help lay the groundwork for devising targeted interventions to impede cancer progression. / Thesis / Master of Applied Science (MASc) / Breast cancer is the most prominent type of cancer that exists in women and like other cancers, it can spread to other organs such as the bone, liver, and brain even though the microenvironments are different. With different proteins like yes-associated protein (YAP) regulating this microenvironmental change in the primary and secondary sites, it can flourish and become more aggressive which leads to death for the host. The interactions of these proteins and their pathways which affects the aggressiveness of the cancers are still not well understood. This project investigates the interaction between YAP and β-catenin in response to surface stiffness to understand the mechanical regulation of breast cancer metastasis. Alongside the protein signalling, cytoskeletal components, downstream gene expression, cell confluency, and membrane proteins are explored. Our results show that an increase in stiffness allow for higher nuclear translocation for YAP and β-catenin, enhancing downstream gene expression relating to migration and proliferation. Furthermore, in lower stiffness the crosstalk between YAP and β-catenin results in an inverse relationship. These findings suggest β-catenin compensates YAP function when YAP is inhibited. In terms of the cytoskeletal protein, an integral part of the cell, the intervention saw a significant alteration in the YAP & β-catenin signalling. Additionally, cell confluency played a large role in β-catenin nuclear translocation implicating the role of cell-to-cell contact in mechanotransduction. To see if mechanosensitive membrane proteins fit into the pathway, PIEZO1 studies were done and results show that it is an upstream effector of YAP, and consequently an indirect connection with β-catenin. All in all, this thesis provides insightful information in the role of stiffness matrix, cell confluency, membrane proteins and how that regulate YAP & β-catenin. This research provides the mechanism for the synergistic therapies targeting multiple proteins to prevent cancer growth and metastasis.

Schaut man durch ein Mikroskop auf eine biologische Zelle mit angefärbten Zytoskelett, so erblickt man lange, mehr oder minder gerade Objekte. Mit ziemlicher Sicherheit gehören diese zu einer von drei Arten von Zytoskelettfilamenten -- Aktin- oder Mikrofilamente, Intermediärfilamente und Mikrotubuli. Schon seit mehreren Jahrzehnten versucht man die mechanischen Eigenschaften lebender Zellen nicht nur zu beschreiben, sondern ihr Verhalten von zwei tieferen Ebenen ausgehend zu verstehen: Inwiefern beschreiben die Eigenschaften von Filamentnetzwerken und -gelen die Zellmechanik und, noch tiefgreifender, wie bestimmen eigentlich die einzelnen Filamente die Netzwerkmechanik. Das Verständnis der Mechanik homogener und isotroper, verhedderter als auch quervernetzter Gele ist dabei erstaunlich detailreich, ohne jedoch vollständig dem jüngeren Verständnis von Zellen als glassartige Systeme zu entsprechen. In den letzten Jahren sind daher anisotrope Strukturen mehr und mehr in den Fokus gerückt, die die Bandbreite möglichen mechanischen Verhaltens enorm bereichern. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit solch einem hochgradig anisotropen System -- nämlich Aktinbündeln -- unter drei Gesichtspunkten. Mit Hilfe von aktiven Biegedeformationen wird ein funktionales Modul, das eine differentielle Antwort auf verschiedenen Zeitskalen liefert, identifiziert. Es handelt sich um Aktinfilamente, die durch transiente Quervernetzer gebündelt werden. Während sich das System nach kurz anhaltenden Deformation völlig elastisch verhält, sorgt eine Restrukturierung der Quervernetzer während langanhaltender Deformationen für eine plastische Verformung des Bündels. In einem weiteren Aspekt widmet sich die Arbeit der frequenz- und längenabhängigen Biegesteifigkeit. Die Methode des Bündel-Wigglings, das Induzieren von \"Seilwellen\", wird dabei genutzt, um aus der Wellenform die Biegesteifigkeit zu berechnen. Bündel von Aktinbündeln zeigen dabei ein Verhalten, das vom klassischen Worm-like-chain-Modell abweicht und stattdessen durch das Worm-like-bundle-Modell beschrieben werden kann. Der letzte Aspekt dieser Arbeit untersucht den Musterbildungsprozess bei der Entstehung von Aktinbündeln. Gänzlich unerwartet entstehen quasi-isotrope Strukturen mit langreichweitiger Ordnung, wenn der Bündelungsprozess erst nach der Polymerisation von Filamenten frei von zusätzlichen mechanischen Einwirkungen einsetzt. Da dieser Zustand nicht von der klassischen Flüssigkristalltheorie vorhergesagt wird, soll eine Simulation eine Hypothese zum Entstehungsmechanismus testen. Die Annahme einer lateralen Kondensation von Filamenten zu Bündeln reicht demnach aus, um die beobachteten Strukturen zu erzeugen. Diese Arbeit leistet somit einen Beitrag zum Verständnis hochgradig anisotroper Strukturen und deren Überstrukturen, wie sie auch in lebendigen Zellen reichlich vorhanden sind.:1 Actin filament bundles and patterns 1.1 Actin and other cytoskeletal filaments 1.2 Filament and bundle mechanics 1.2.1 Polymer models 1.2.2 Worm-like bundle theory 1.3 Filament bundling 1.4 Active crosslinkers – contraction and pattern formation 2 Materials and Methods, Instruments and Software 2.1 Actin purification and labeling 2.2 Optical tweezers 2.3 Software libraries for instrument integration 3 Bundle mechanics in the time domain 3.1 Bundle formation and sample preparation 3.2 Bundle bending experiment 3.2.1 LabView VI for bundle bending 3.2.2 Bundle bending 3.2.3 Image analysis and data survey 3.3 Bundle workout – Results of the bending experiments 3.3.1 Multiple bends and elastic response 3.3.2 Endurance test – Plastic response after longer holds 3.3.3 Purely elastic depletion-force induced bundles 3.4 Elastic and plastic deformations of F-actin bundles – Discussion 3.4.1 Bundle formation process and bundle thickness 3.4.2 Elastic response 3.4.3 Elastic versus plastic response 3.5 Differential mechanical response – Summary 4 Bundle mechanics in the frequency domain 4.1 Bundle wiggling – the method 4.2 Bundle formation and sample preparation 4.3 Bundle wiggling experiment 4.3.1 LabView VI for bundle wiggling 4.3.2 Wiggling images to wiggle data 4.4 Bundle wiggling – Results 4.4.1 Bead at end 4.4.2 Wiggling bundled bundles 4.4.3 Thick bundles connected to networks 4.5 Frequency-dependent elastic response of bundles – Discussion 5 Actin bundle networks 5.1 Actin condensation in confined environments – The experiment 5.2 Simulating filament condensation 5.2.1 Implementation details 5.3 Simulation of filament condensation to bundle networks 5.4 Condensation drives pattern formation – Discussion 6 Conclusion A Calculations A.1 Subcircular bending arc and radius of curvature A.2 Correction factor for relaxations times of bundles with bead B Protocols B.1 G-actin from rabbit skeletal muscle B.1.1 Acetone powder prep B.1.2 Actin prep B.1.3 Actin gel-filtration B.2 Buffers B.3 NEM-myosin beads B.3.1 NEM-inactivated myosin B.3.2 NEM-myosin coated beads B.4 Bundle preps B.4.1 Depletion force induced and ff-actinin crosslinked bundles B.4.2 Depletion force induced bundles for wiggling experiments Bibliography / Being the most basic unit of living organisms, the cell is a complex entity comprising thousands of different proteins. Yet only very few of which are considered to play a leading part in the cell’s mechanical integrity. The biopolymers actin, intermediate filaments and microtubules constitute the so-called cytoskeleton – a highly dynamic, constantly restructuring scaffold endowing the cell not only with integrity to sustain mechanical perturbations but also with the ability to rapidly reorganize or even drive directed motion. Actin has been regarded to be the protagonist and tremendous efforts have been made to understand passive actin networks using concepts from polymer rheology and statistical mechanics. In bottom-up approaches isotropic, homogeneous actin-gels are well-characterized with rheological methods that measure elastic and viscous properties on different time scales. Cells, however, are not exclusively isotropic networks of any of the mentioned filaments. Rather, actin alone can already be organized into heterogeneous and highly anisotropic structures like bundles. These heterogeneous structures have only come into focus recently with theoretical work addressing bundle networks. and, in the case of the worm-like bundle theory, individual bundles. This work aims at characterizing bundles and bundle-crosslinker systems mechanically in two complementary approaches – in the time as well as in the frequency domain. In addition, it illuminates a bundle formation mechanism that leads to bundle networks displaying higher ordering.:1 Actin filament bundles and patterns 1.1 Actin and other cytoskeletal filaments 1.2 Filament and bundle mechanics 1.2.1 Polymer models 1.2.2 Worm-like bundle theory 1.3 Filament bundling 1.4 Active crosslinkers – contraction and pattern formation 2 Materials and Methods, Instruments and Software 2.1 Actin purification and labeling 2.2 Optical tweezers 2.3 Software libraries for instrument integration 3 Bundle mechanics in the time domain 3.1 Bundle formation and sample preparation 3.2 Bundle bending experiment 3.2.1 LabView VI for bundle bending 3.2.2 Bundle bending 3.2.3 Image analysis and data survey 3.3 Bundle workout – Results of the bending experiments 3.3.1 Multiple bends and elastic response 3.3.2 Endurance test – Plastic response after longer holds 3.3.3 Purely elastic depletion-force induced bundles 3.4 Elastic and plastic deformations of F-actin bundles – Discussion 3.4.1 Bundle formation process and bundle thickness 3.4.2 Elastic response 3.4.3 Elastic versus plastic response 3.5 Differential mechanical response – Summary 4 Bundle mechanics in the frequency domain 4.1 Bundle wiggling – the method 4.2 Bundle formation and sample preparation 4.3 Bundle wiggling experiment 4.3.1 LabView VI for bundle wiggling 4.3.2 Wiggling images to wiggle data 4.4 Bundle wiggling – Results 4.4.1 Bead at end 4.4.2 Wiggling bundled bundles 4.4.3 Thick bundles connected to networks 4.5 Frequency-dependent elastic response of bundles – Discussion 5 Actin bundle networks 5.1 Actin condensation in confined environments – The experiment 5.2 Simulating filament condensation 5.2.1 Implementation details 5.3 Simulation of filament condensation to bundle networks 5.4 Condensation drives pattern formation – Discussion 6 Conclusion A Calculations A.1 Subcircular bending arc and radius of curvature A.2 Correction factor for relaxations times of bundles with bead B Protocols B.1 G-actin from rabbit skeletal muscle B.1.1 Acetone powder prep B.1.2 Actin prep B.1.3 Actin gel-filtration B.2 Buffers B.3 NEM-myosin beads B.3.1 NEM-inactivated myosin B.3.2 NEM-myosin coated beads B.4 Bundle preps B.4.1 Depletion force induced and ff-actinin crosslinked bundles B.4.2 Depletion force induced bundles for wiggling experiments Bibliography

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Aktive Filament-Systeme, wie zum Beispiel das Zellskelett, sind Beispiele einer interessanten Klasse neuartiger Materialien, die eine wichtige Rolle in der belebten Natur spielen. Viele wichtige Prozesse in lebenden Zellen wie zum Beispiel die Zellbewegung oder Zellteilung basieren auf dem Zellskelett. Das Zellskelett besteht aus Protein-Filamenten, molekularen Motoren und einer großen Zahl weiterer Proteine, die an die Filamente binden und diese zu einem Netz verbinden können. Die Filamente selber sind semifexible Polymere, typischerweise einige Mikrometer lang und bestehen aus einigen hundert bis tausend Untereinheiten, typischerweise Mono- oder Dimeren. Die Filamente sind strukturell polar, d.h. sie haben eine definierte Richtung, ähnlich einer Ratsche. Diese Polarität begründet unterschiedliche Polymerisierungs- und Depolymerisierungs-Eigenschaften der beiden Filamentenden und legt außerdem die Bewegungsrichtung molekularer Motoren fest. Die Polymerisation von Filamenten sowie Krafterzeugung und Bewegung molekularer Motoren sind aktive Prozesse, die kontinuierlich chemische Energie benötigen. Das Zellskelett ist somit ein aktives Gel, das sich fern vom thermodynamischen Gleichgewicht befindet. In dieser Arbeit präsentieren wir Beschreibungen solcher aktiven Filament-Systeme und wenden sie auf Strukturen an, die eine ähnliche Geometrie wie zellulare Strukturen haben. Beispiele solcher zellularer Strukturen sind Spannungsfasern, kontraktile Ringe oder mitotische Spindeln. Spannungsfasern sind für die Zellbewegung essentiell; sie können kontrahieren und so die Zelle vorwärts bewegen. Die mitotische Spindel trennt Kopien der Erbsubstanz DNS vor der eigentlichen Zellteilung. Der kontraktile Ring schließlich trennt die Zelle am Ende der Zellteilung. In unserer Theorie konzentrieren wir uns auf den Einfluß der Polymerisierung und Depolymerisierung von Filamenten auf die Dynamik dieser Strukturen. Wir zeigen, dass der kontinuierliche Umschlag (d.h. fortwährende Polymerisierung und Depolymerisierung) von Filamenten unabdingbar ist für die kontraktion eines Rings mit konstanter Geschwindigkeit, so wie in Experimenten mit Hefezellen beobachtet. Mit Hilfe einer mikroskopisch motivierten Beschreibung zeigen wir, wie "filament treadmilling", also Filament Polymerisierung an einem Ende mit der gleichen Rate wie Depolymerisierung am anderen Ende, zur Spannung in Filament Bündeln und Ringen beitragen kann. Ein zentrales Ergebnis ist, dass die Depolymerisierung von Filamenten in Anwesenheit von filamentverbindenden Proteinen das Zusammenziehen dieser Bündel sogar in Abwesenheit molekulare Motoren herbeiführen kann. Ferner entwickeln wir eine generische Kontinuumsbeschreibung aktiver Filament-Systeme, die ausschließlich auf Symmetrien der Systeme beruht und von mikroskopischen Details unabhängig ist. Diese Theorie erlaubt uns eine komplementäre Sichtweise auf solche aktiven Filament-Systeme. Sie stellt ein wichtiges Werkzeug dar, um die physikalischen Mechanismen z.B. in Filamentbündeln aber auch bei der Bildung von Filamentringen im Zellkortex zu untersuchen. Schließlich entwickeln wir eine auf einem Kräftegleichgewicht basierende Beschreibung für bipolare Strukturen aktiver Filamente und wenden diese auf die mitotische Spindel an. Wir diskutieren Bedingungen für die Bildung und Stabilität von Spindeln. / Active filament systems such as the cell cytoskeleton represent an intriguing class of novel materials that play an important role in nature. The cytoskeleton for example provides the mechanical basis for many central processes in living cells, such as cell locomotion or cell division. It consists of protein filaments, molecular motors and a host of related proteins that can bind to and cross-link the filaments. The filaments themselves are semiflexible polymers that are typically several micrometers long and made of several hundreds to thousands of subunits. The filaments are structurally polar, i.e. they possess a directionality. This polarity causes the two distinct filament ends to exhibit different properties regarding polymerization and depolymerization and also defines the direction of movement of molecular motors. Filament polymerization as well as force generation and motion of molecular motors are active processes, that constantly use chemical energy. The cytoskeleton is thus an active gel, far from equilibrium. We present theories of such active filament systems and apply them to geometries reminiscent of structures in living cells such as stress fibers, contractile rings or mitotic spindles. Stress fibers are involved in cell locomotion and propel the cell forward, the mitotic spindle mechanically separates the duplicated sets of chromosomes prior to cell division and the contractile ring cleaves the cell during the final stages of cell division. In our theory, we focus in particular on the role of filament polymerization and depolymerization for the dynamics of these structures. Using a mean field description of active filament systems that is based on the microscopic processes of filaments and motors, we show how filament polymerization and depolymerization contribute to the tension in filament bundles and rings. We especially study filament treadmilling, an ubiquitous process in cells, in which one filament end grows at the same rate as the other one shrinks. A key result is that depolymerization of filaments in the presence of linking proteins can induce bundle contraction even in the absence of molecular motors. We extend this description and apply it to the mitotic spindle. Starting from force balance considerations we discuss conditions for spindle formation and stability. We find that motor binding to filament ends is essential for spindle formation. Furthermore we develop a generic continuum description that is based on symmetry considerations and independent of microscopic details. This theory allows us to present a complementary view on filament bundles, as well as to investigate physical mechanisms behind cell cortex dynamics and ring formation in the two dimensional geometry of a cylinder surface. Finally we present a phenomenological description for the dynamics of contractile rings that is based on the balance of forces generated by active processes in the ring with forces necessary to deform the cell. We find that filament turnover is essential for ring contraction with constant velocities such as observed in experiments with fission yeast.