La ribavirine est un agent antiviral à large spectre efficace in vitro contre de nombreux virus à ARN dont certains sont responsables d'encéphalites. In vivo la mauvaise diffusion de cet analogue nucléosidique au niveau de la barrière hémato-encéphalique, limite son efficacité dans le traitement des encéphalites virales. Des études antérieures ont montré la capacité des cyclodextrines natives à former des complexes d’inclusion avec la ribavirine et l’amélioration de l’activité antivirale de la ribavirine in vitro lorsque celle-ci est complexée à l’alpha- ou la bêta-cyclodextrine. Le bénéfice de cette complexation in vivo, a été évalué sur un modèle murin d'encéphalite utilisant une souche neuroadaptée du virus de la rougeole (CAM/RB) inoculée par voie intracrânienne chez la souris CBA/ca âgée de 3 à 4 semaines. Le développement de l’infection a été contrôlé par détermination de la charge virale dans le cerveau des souris, à l’aide d’une RT-PCR quantitative en méthode TaqMan amplifiant le gène N du virus de la rougeole et d’une gamme étalon externe. Lorsque les souris sont traitées par voie intrapéritonéale par 40 mg/kg de ribavirine complexée à l’alpha-cyclodextrine, la morbidité et la mortalité liées à l’encéphalite rougeoleuse sont diminuées par rapport à l’administration de ribavirine libre et la charge virale diminue de façon significative dans le cerveau au jour J6. La complexation à la bêta-cyclodextrine n’apporte pas de bénéfice comparé à la ribavirine libre. Ces données suggèrent que l’alpha-cyclodextrine améliore in vivo le passage de la ribavirine au travers de la barrière hémato-encéphalique. La cinétique de la ribavirine dans le cerveau des souris traitées par le complexe ribavirine/alpha-cyclodextrine a été étudiée de 30 minutes à 48 heures après l’administration de doses uniques ou répétées de ribavirine libre ou complexée à différents dosages. La ribavirine a été purifiée par une technique d’extraction en phase solide et quantifiée par chromatographie liquide haute performance après élaboration d'une gamme de calibration ex vivo. La quantité de ribavirine retrouvée dans le cerveau est plus élevée lorsque la molécule est injectée sous forme de complexe chez la souris saine ou infectée. Ces données illustrent l'amélioration de survie observée au préalable et ce modèle d'étude a permis de mettre en évidence l'impact virologique et pharmacologique de la complexation d'une molécule antivirale à l'alpha-cyclodextrine. / The objective of this work was to study the antiviral activity of ribavirin on measles encephalitis infection when using cyclodextrins as carriers. Ribavirin is a water-soluble synthetic nucleoside with broad spectrum antiviral properties, but it is ineffective against major viral encephalitis because of a failure to cross the blood brain barrier. The use of cyclic oligosaccharides can promote the activity of many drugs and the benefit of the association of ribavirin with alpha- or beta-cyclodextrine has already been demonstrated in vitro. The antiviral activity of the ribavirin/cyclodextrin complexes has been evaluated in vivo using an experimental model based on intracranial injection of the rodent adapted CAM/RB strain of measles virus in CBA/ca mice. Measles encephalitis development was monitored daily by viral load determination in mice brain. Intraperitoneal administration of the complex ribavirin/alpha-cyclodextrin (40 mg/kg of ribavirin) decreased the morbidity and the mortality of measles virus infected mice compared to free ribavirin treatment and the viral load in the brain is reduced at day 6 post-inoculation. At the opposite beta-cyclodextrin did not enhanced ribavirin in vivo antiviral activity. The role of alpha-cyclodextrin thus required to be defined and notably the hypothesis of ribavirin permeation enhancement through the blood brain barrier. Ribavirin specific extraction from brain tissue was developed, based on a solid phase extraction. It was quantified by high performance liquid chromatography at different time points after intraperitoneal injection of single or multiple doses of free ribavirin or of the complex ribavirin/alpha-cyclodextrin. Whatever the tested doses, quantity of ribavirin in the brain is significantly higher when the drug is injected as a complex with alpha-cyclodextrin, in healthy or measles virus-infected mice. So pharmacokinetic of ribavirin in brain tissue explains the advantage of the complex ribavirin/alpha-cyclodextrin over ribavirin in protecting mice from intracerebral infection with measles virus and confirms the interest of cyclodextrin complexes for human central nervous system diseases treatment.

Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie chronique multifactorielle. Les infections entérovirales, en particulier à Coxsackievirus du groupe B (CVB), et notamment CVB4, transmises par voie digestive, constituent le facteur de risque le plus souvent évoqué dans la littérature. Plusieurs mécanismes physiopathologiques sont proposés pour expliquer cette relation entre CVB4 et diabète de type 1. Il s’agit, entre autres, du tropisme préférentiel de CVB4 pour les ilots et les cellules β pancréatiques et l’inflammation qui s’ensuit, de la persistance du virus au niveau des cellules infectées qui pourrait constituer un facteur déterminant dans le processus d’altération des cellules endocrines, de l’exacerbation possible de l’infection par des d’anticorps facilitateurs ou encore du mimétisme moléculaire entre les auto-antigènes et les antigènes viraux. Par ailleurs des auteurs ont montré que la cause de la déplétion des cellules β chez des souris infectées par la souche diabétogénique CVB4E2 est un défaut de régénération plutôt qu’une destruction directe de ces cellules par le virus. La présence de constituants entéroviraux dans les cellules ductales du pancréas de patients diabétiques a été observée. Le diabète de type 1, qui serait l’expression finale d’un long processus, survient généralement chez des sujets jeunes, c’est pourquoi l’hypothèse que le tissu pancréatique jeune serait plus permissif aux infections à CVB4 n’est pas exclue. La prévention des infections virales reste le meilleur moyen de protéger les individus contre les maladies qu’elles provoquent. Un intérêt particulier est aujourd’hui accordé à la mise en évidences et à la caractérisation d’inhibiteurs antiviraux à large spectre. L’absence d’allaitement maternel est associé à un risque plus élevé de diabète de type 1, mais la nature du ou des facteurs du lait conférant une protection est mal connue, et l’activité anti-CVB4 du lait maternel n’a pas été étudiée jusqu’à présent. Objectifs : Nous avons émis l’hypothèse que CVB4 pouvait infecter des cellules humaines précurseurs de cellules endocrines, impliquées dans la régénération des îlots. L’infection de ces cellules par CVB4E2 et ses conséquences ont été étudiées ; nous avons utilisé des cellules humaines précurseurs canalaires primitives et la lignée continue de cellules Panc-1, dont la différenciation in vitro est possible. La permissivité au CVB4 du tissu pancréatique selon l’âge a été étudiée ex vivo chez le rat et l’existence d’inhibiteurs antiviraux à large spectre est notamment explorée dans l’intestin de souris. L’activité anti-CVB4 du lait maternel susceptible de protéger, à un âge critique, le jeune enfant vis-à-vis d’un virus diabétogène a été étudiée in vitro et l’hypothèse que le lait humain pourrait prévenir le déclenchement du DT1 chez la souris NOD a également été évaluée in vivo. / Type 1 diabetes (T1D) is a chronic multifactorial disease. Enteroviral infections, especially those with group B coxsackieviruses, and in particular the B4 serotype (CVB4), mainly transmitted by the fecal-oral route, are among the environmental factors most able to be involved in the pathogenesis of the disease. Several pathophysiological mechanisms have been proposed to explain this relationship between CVB4 and T1D. Among these mechanisms, the preferential tropism of CVB4 for islets and pancreatic β cells and the resulted inflammation; virus persistence in infected cells which can constitute an important factor in the process leading to endocrine cells alteration; the possible worsening of the infection by enhancing antibodies or molecular mimicry between self-antigens and viral antigens. Moreover, some studies have demonstrated that β-cell depletion in mice infected with the diabetogenic strain CVB4E2 is due to lack of regeneration rather than direct destruction of these cells by the virus. Enteroviral constituents have been detected in pancreatic ductal cells of T1D patients. Type 1 diabetes is a final expression of a long process usually occurring in young children. Therefore, the hypothesis that the pancreatic tissue of young subjects is more permissive to CVB4 infection can not be excluded. Prevention of viral infections is the best way to protect people against diseases they cause. Thus, identification and characterization of broad-spectrum antiviral inhibitors are of particular interest. A lower risk of T1D is associated with breastfeeding, however, the support of the breast milk protective effect has not been clarified, and the neutralizing activity of breast milk in vitro against CVB4 has not been studied so far.

Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie chronique multifactorielle. Les infections entérovirales, en particulier à Coxsackievirus du groupe B (CVB), et notamment CVB4, transmises par voie digestive, constituent le facteur de risque le plus souvent évoqué dans la littérature. Plusieurs mécanismes physiopathologiques sont proposés pour expliquer cette relation entre CVB4 et diabète de type 1. Il s'agit, entre autres, du tropisme préférentiel de CVB4 pour les ilots et les cellules β pancréatiques et l'inflammation qui s'ensuit, de la persistance du virus au niveau des cellules infectées qui pourrait constituer un facteur déterminant dans le processus d'altération des cellules endocrines, de l'exacerbation possible de l'infection par des d'anticorps facilitateurs ou encore du mimétisme moléculaire entre les auto-antigènes et les antigènes viraux. Par ailleurs des auteurs ont montré que la cause de la déplétion des cellules β chez des souris infectées par la souche diabétogénique CVB4E2 est un défaut de régénération plutôt qu'une destruction directe de ces cellules par le virus. La présence de constituants entéroviraux dans les cellules ductales du pancréas de patients diabétiques a été observée. Le diabète de type 1, qui serait l'expression finale d'un long processus, survient généralement chez des sujets jeunes, c'est pourquoi l'hypothèse que le tissu pancréatique jeune serait plus permissif aux infections à CVB4 n'est pas exclue. La prévention des infections virales reste le meilleur moyen de protéger les individus contre les maladies qu'elles provoquent. Un intérêt particulier est aujourd'hui accordé à la mise en évidences et à la caractérisation d'inhibiteurs antiviraux à large spectre. L'absence d'allaitement maternel est associé à un risque plus élevé de diabète de type 1, mais la nature du ou des facteurs du lait conférant une protection est mal connue, et l'activité anti-CVB4 du lait maternel n'a pas été étudiée jusqu'à présent. Objectifs : Nous avons émis l'hypothèse que CVB4 pouvait infecter des cellules humaines précurseurs de cellules endocrines, impliquées dans la régénération des îlots. L'infection de ces cellules par CVB4E2 et ses conséquences ont été étudiées ; nous avons utilisé des cellules humaines précurseurs canalaires primitives et la lignée continue de cellules Panc-1, dont la différenciation in vitro est possible. La permissivité au CVB4 du tissu pancréatique selon l'âge a été étudiée ex vivo chez le rat et l'existence d'inhibiteurs antiviraux à large spectre est notamment explorée dans l'intestin de souris. L'activité anti-CVB4 du lait maternel susceptible de protéger, à un âge critique, le jeune enfant vis-à-vis d'un virus diabétogène a été étudiée in vitro et l'hypothèse que le lait humain pourrait prévenir le déclenchement du DT1 chez la souris NOD a également été évaluée in vivo.

Ces travaux de thèse CIFRE, réalisés au sein du Laboratoire de Biotechnologie et Chimie Marines de l’Université de Bretagne-Sud et du Groupe Olmix, s’inscrivent dans le cadre d’un projet national de valorisation de biomasses d’algues vertes, le projet ULVANS. Ce projet est le fruit d’une collaboration entre cinq industriels bretons et deux laboratoires universitaires. Les objectifs de ces travaux de thèse concernent i) la caractérisation approfondie de la matière première, en particulier des polysaccharides matriciels solubles (ulvanes) et des protéines, ii) la mise au point d’un procédé d’extraction assistée par enzymes des métabolites algaux, iii) la caractérisation biochimique et moléculaire des hydrolysats enzymatiques, avec pour objectif la compréhension de l’effet des enzymes commerciales sur les algues, iv) l’évaluation des activités antioxydantes et antivirales des hydrolysats, v) l’étude de l’influence des paramètres d’hydrolyse en vue de déterminer les conditions optimales pour l’extraction des métabolites d’intérêt et enfin vi) de conclure, à partir des éléments fournis par l’étude, sur la viabilité d’un tel procédé à l’échelle industrielle. En conclusion de ces travaux, l’hydrolyse enzymatique apparait comme un procédé intéressant pour le bioraffinage des algues vertes. Bien que les préparations enzymatiques commerciales utilisées ne soient pas spécifiques des composés algaux, les protéases ont conduit à une augmentation significative des rendements d’extraction, alors que l’effet des carbohydrases reste modéré. L’étude de l’influence des paramètres d’hydrolyses a confirmé les résultats préliminaires et montré que la température, la concentration d’enzyme et la méthode de broyage présentaient peu d’effets sur les activités des protéases testées. Un résultat majeur de cette étude aura été la mise en évidence d’activités anti-herpétiques dans les hydrolysats. La caractérisation des fractions actives a montré que les activités étaient liées à la présence de protéines ou glycoprotéines dans les extraits. Ce résultat présente un intérêt majeur car à l’heure actuelle, a priori, aucune activité de ce type n’a été identifiée chez Ulva sp. / This PhD Thesis works, conducted in the Laboratoire de Biotechnologie et Chimie Marines of the Université de Bretagne-Sud and in the Olmix Group, was included in a national project for the upgrading of green seaweed biomasses, the Ulvans project. This project results in the collaboration of five industrial companies and two academic research laboratories. The objectives of this thesis works had been i) the characterization of the raw material, particularly the soluble matrix polysaccharides (ulvans) and proteins, ii) the development of an enzyme-assisted extraction process of algal metabolites, iii) the biochemical and molecular characterization of the enzymatic hydrolyzates, with the aim of understanding the effect of enzymes on algae thallus, iv) the screening of antioxidant and antiviral activities of hydrolyzates, v) the study of the influence of hydrolysis parameters to determine the optimum conditions for the extraction of metabolites of interest and finally vi) to conclude, according to the results provided by this study, on the viability of the industrial upscaling of the process. In conclusion of this work, enzymatic hydrolysis appeared to be an effective process for biorefinery of green seaweeds. Although commercial enzymatic preparations were not specific of algal compounds, protéases led to a significant increase in the extraction yields, whereas the effect of carbohydrases were moderate. The study of hydrolysis parameters confirmed the preliminary results and showed that the temperature, the concentration of enzyme and the grinding method had no effect on the protease used. A major result of this study has been the highlighting of anti-oxidant and anti-herpetic compounds in hydrolyzates. The antiviral activity of ulvans had several times been demonstrated but the biochemical characterization of actives fractions showed that the activity could be associated to proteins or glycoproteins. This result is very interesting because, a priori, any antiviral activity has also been related to this type of compounds in Ulva sp.

Les maladies virales à transmission vectorielle émergentes et ré-émergentes comme la dengue, le chikungunya ou le zika sont responsables de nombreuses épidémies sévères à travers le monde. Récemment, la propagation rapide et très étendue du virus zika (ZIKV) ainsi que les complications neurologiques graves liées à l’infection par ZIKV ont incité l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) à déclarer le ZIKV comme une urgence de santé publique mondiale. Aujourd’hui, les mesures préventives ou curatives de l’infection par ZIKV sont quasiment inexistantes. D’autre part, la flore endémique de La Réunion est connue comme une source riche, renouvelable et prometteuse en produits naturels anti-infectieux. L’inscription à la pharmacopée française de 19 plantes médicinales réunionnaises souligne le potentiel thérapeutique des substances naturelles issues de la biodiversité locale. Les travaux ont été consacrés à l’identification de substances naturelles anti-ZIKV issues d’une sélection de sept plantes médicinales réunionnaises inscrites à la pharmacopée française. Dans une première étape, une extraction sans solvant assistée par micro-ondes a été appliquée sur les sept plantes médicinales sélectionnées afin d’obtenir des éco-extraits. Dans une deuxième étape, le criblage de l’activité antivirale, en utilisant un clone moléculaire du ZIKV avec un gène rapporteur, a permis d’identifier deux éco-extraits actifs provenant de Aphloia theiformis et de Psiloxylon mauritianum. Après avoir vérifié l’absence de cytotoxicité et de génotoxicité des extraits actifs, l’activité antivirale a été aussi démontrée sur d’autres types d’extraits réalisés via des méthodes d’extractions traditionnelles (infusion, décoction et macération). L’activité antivirale a été validée sur différentes souches de ZIKV (historique et épidémique) ainsi que sur les 4 sérotypes du virus de la dengue. Enfin, le mode d’action des deux extraits actifs a été étudié. Il a été montré que les éco-extraits d’A. theiformis et de P. mauritianum ciblent les phases précoces du cycle viral en inhibant l’attachement du virus à la cellule hôte. À l’aide de la microscopie électronique, il a été montré que l’éco-extrait d’A. theiformis déforme la particule virale empêchant cette dernière de s’attacher à la membrane de la cellule hôte. Ces résultats démontrent l’importance des plantes médicinales réunionnaises comme source de substances naturelles anti-infectieuses. / Emerging and re-emerging vector-borne viral diseases such as dengue, chikungunya or zika are responsible for many severe epidemics worldwide. Recently, the rapid spread of zika virus (ZIKV) worldwide and the serious neurological complications associated with ZIKV infection have prompted the World Health Organization (WHO) to declare ZIKV a public health emergency. Today, preventive or curative measures against ZIKV infection are almost non-existing. On the other hand, the endemic flora of Reunion Island is known as a rich, renewable and promising source of natural anti-infective products. The registration of 19 medicinal plants from Reunion Island in the French pharmacopoeia highlights the therapeutic potential of natural substances derived from local biodiversity. The work was dedicated to the identification of natural anti-ZIKV substances from a selection of seven medicinal plants from La Reunion registered in the French pharmacopoeia. In a first step, in collaboration with a local start-up (Bourbon Extracts), a solvent-free microwave-assisted extraction was applied to the seven selected plants in order to obtain eco-extracts. In a second step, the screening for antiviral activity, using a ZIKV molecular clone with a reporter gene, allowed the identification of two candidate plants: Aphloia theiformis and Psiloxylon mauritianum. After verifying the absence of cytotoxicity and genotoxicity of the active extracts, the antiviral activity was also demonstrated on other types of extracts using traditional extraction methods (infusion, decoction and maceration). The antiviral activity has been validated on different strains of ZIKV (historical and epidemic) as well as on the four serotypes of the dengue virus. Finally, the mode of action of the two active extracts has been studied. It has been shown that the eco-extracts from A. theiformis and P. mauritianum target the early steps of the viral cycle by inhibiting the attachment of the virus to the host cell. Using electron microscopy, it has been shown that the eco-extract of A. theiformis deforms the viral particle preventing its attachment to the membrane of the host cell. These results demonstrate the importance of medicinal plants from Reunion Island as a source of natural anti-infectious substances.

Les huiles essentielles de citronnelle (Cymbopogon citratus), de géranium (Pelargonium graveolens) et de vétiver (Vetiveria zizanioides) sont utilisées partout dans le monde pour leur activité répulsive contre les principaux vecteurs (moustiques, tiques) de maladies infectieuses chez l'Homme (paludisme, chikungunya, …). L'application cutanée de ces produits naturels pour éviter le contact avec un vecteur n'avait pas été encore envisagée comme moyen de limiter les premiers stades de l’infection par l'agent pathogène transmis par le vecteur. Pour vérifier cette hypothèse, les travaux ont été consacrés à la mise en place d'un cadre structuré pour la réévaluation chimique et biologique des trois huiles essentielles sur le modèle du virus du Ross River (alphavirus) de la même famille que le virus du Chikungunya. La caractérisation chimique des huiles essentielles avec une technique de haute résolution (GC×GC/TOF-MS) a permis d'établir leur profil chémotypique précis. L'utilisation de marqueurs spécifiques (clones moléculaires du virus) a permis d'établir l'inhibition de la réplication virale en fonction des conditions d'application des huiles essentielles de géranium et citronnelle. Ces résultats suggèrent l'intérêt d’une huile essentielle répulsive dans les premiers stades d'une infection par un vecteur. À ce titre, l'étude comparative établit la haute valeur ajoutée de l'huile essentielle de géranium et oriente la recherche de nouveaux anti-infectieux naturels vers des complexes riches en monoterpènes. / Essential oils of citronella (Cymbopogon citratus), geranium (Pelargonium graveolens) and vetiver (Vetiveria zizanioides) are used worldwide as topical repellent against the main vectors (mosquitoes, ticks) of human infectious diseases (Malaria, chikungunya, …). Skin treatment with these natural products, initially to avoid contact with the vector had not yet been considered as a way to disrupt the early stages of infection when the repelling action fails. To check this hypothesis, a structured framework has been performed for the chemical and biological re-evaluation of the three essential oils. The latter was tested against Ross River virus (alphavirus) that belongs to the same family of Chikungunya virus. Analysis of essential oils using a high-resolution technique (GC × GC / TOF-MS) resulted in a more accurate chemotypical profile of the local production. The use of specific markers (molecular clones of the virus, Saclay CEA) allowed to establish the inhibition of viral replication depending of the conditions of geranium and citronella essential oils application. These results suggest the great interest of an essential oil topical repellent in the early stages of a vector infection. The comparative study established the high value of geranium essential oil and gave future direction to the discovery of new anti-infectious solutions from monoterpenes-rich natural complexes.

Le travail de recherche présenté dans ce mémoire de thèse a été centré sur une nouvelle famille de flavones aux propriétés antivirales. Mon travail de thèse avait pour premier objectif d'améliorer la synthèse de la ladanéine (tête de série) et permettre l'accès à d’autres analogues. Un développement méthodologique a permis de mettre au point une synthèse compatible avec les procédés industriels qui permette d'améliorer les rendements et de raccourcir significativement les délais d'obtention. De plus, aucune purification par colonne de silice n’est nécessaire. Une étude physico-chimique détaillée a ensuite été menée. Les propriétés acido-basiques de la série de composés ont d'abord été évaluées avant l'étude des propriétés électrochimiques. Ces données sont déterminantes pour une meilleure compréhension du mécanisme d'action de ces flavones. La complexation au Fe(III) a été également démontrée comme essentielle pour l’activité antivirale de ces composés. Les propriétés de complexation de ce cation ont donc été étudiées et ont apporté des informations importantes. Finalement, dans le but d’améliorer les propriétés pharmacocinétiques de ces agents virucides, des formulations originales avec le Mg(II), cation biocompatible, ont été élaborées et étudiées. / The research work presented in this manuscript was centered on a novel flavone series displaying potent antiviral activities toward enveloped viruses such as HCV. The first goal of my research work was to improve the synthesis of ladanein (the lead antiviral compound) and to allow an easy access to a broad range of analogues. A methodological approach allowed setting up a synthetic route compatible with industrial processes with high yields and significantly shortened preparation time. Furthermore, no silica gel column chromatography was needed throughout the synthetic route. A thorough physico-chemical study was then undertaken. The acido-basic properties of this homogenous series of compounds were first evaluated prior to the investigation of their electrochemical parameters. These data are essential for a deeper understanding of the mechanism of action of these polyphenolic compounds. Fe(III) was shown to be essential for the antiviral activity of these compounds and, hence, the Fe(III) complexation properties of the flavones have been studied and provided important information. Last but not least, in order to improve the pharmacokinetic properties of the flavones, original formulation approaches using the biocompatible Mg(II) cation were undertaken and thoroughly investigated.

Cette thèse traite de la résistance du VIH-1 aux antirétroviraux, en particulier de l'activité antivirale de plusieurs inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI) ainsi que des inhibiteurs de protéase (IP). Nous avons exploré l’émergence et la spécificité des voies de mutations qui confèrent la résistance contre plusieurs nouveaux INNTI (étravirine (ETR) et rilpivirine (RPV)) (chapitres 2 et 3). En outre, le profil de résistance et le potentiel antirétroviral d'un nouvel IP, PL-100, est présenté dans les chapitres 4 et 5. Pour le premier projet, nous avons utilisé des sous-types B et non-B du VIH-1 pour sélectionner des virus résistants à ETR, et ainsi montré que ETR favorise l’émergence des mutations V90I, K101Q, E138K, V179D/E/F, Y181C, V189I, G190E, H221H/Y et M230L, et ce, en 18 semaines. Fait intéressant, E138K a été la première mutation à émerger dans la plupart des cas. Les clones viraux contenant E138K ont montré un faible niveau de résistance phénotypique à ETR (3,8 fois) et une diminution modeste de la capacité de réplication (2 fois) par rapport au virus de type sauvage. Nous avons également examiné les profils de résistance à ETR et RPV dans les virus contenant des mutations de résistance aux INNTI au début de la sélection. Dans le cas du virus de type sauvage et du virus contenant la mutation unique K103N, les premières mutations à apparaître en présence d’ETR ou de RPV ont été E138K ou E138G suivies d’autres mutations de résistance aux INNTI. À l’inverse, dans les mêmes conditions, le virus avec la mutation Y181C a évolué pour produire les mutations V179I/F ou A62V/A, mais pas E138K/G. L'ajout de mutations à la position 138 en présence de Y181C n'augmente pas les niveaux de résistance à ETR ou RPV. Nous avons également observé que la combinaison de Y181C et E138K peut conduire à un virus moins adapté par rapport au virus contenant uniquement Y181C. Sur la base de ces résultats, nous suggérons que les mutations Y181C et E138K peuvent être antagonistes. L’analyse de la résistance au PL-100 des virus de sous-type C et CRF01_AE dans les cellules en culture est décrite dans le chapitre 4. Le PL-100 sélectionne pour des mutations de résistance utilisant deux voies distinctes, l'une avec les mutations V82A et L90M et l'autre avec T80I, suivi de l’addition des mutations M46I/L, I54M, K55R, L76F, P81S et I85V. Une accumulation d'au moins trois mutations dans le rabat protéique et dans le site actif est requise dans chaque cas pour qu’un haut niveau de résistance soit atteint, ce qui démontre que le PL-100 dispose d'une barrière génétique élevée contre le développement de la résistance. Dans le chapitre 5, nous avons évalué le potentiel du PL-100 en tant qu’inhibiteur de protéase de deuxième génération. Les virus résistants au PL-100 émergent en 8-48 semaines alors qu’aucune mutation n’apparaît avec le darunavir (DRV) sur une période de 40 semaines. La modélisation moléculaire montre que la haute barrière génétique du DRV est due à de multiples interactions avec la protéase dont des liaison hydrogènes entre les groupes di-tétrahydrofuranne (THF) et les atomes d'oxygène des acides aminés A28, D29 et D30, tandis que la liaison de PL-100 est principalement basée sur des interactions polaires et hydrophobes délocalisées à travers ses groupes diphényle. Nos données suggèrent que les contacts de liaison hydrogène et le groupe di-THF dans le DRV, ainsi que le caractère hydrophobe du PL-100, contribuent à la liaison à la protéase ainsi qu’à la haute barrière génétique contre la résistance et que la refonte de la structure de PL-100 pour inclure un groupe di-THF pourrait améliorer l’activité antivirale et le profil de résistance. / This thesis focuses on HIV-1 drug resistance and on the antiviral activity of several non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) and protease inhibitors (PIs). We have explored the mutational pathways and resistance patterns of several new NNRTIs (etravirine (ETR) and rilpivirine (RPV)) (Chapters 2 and 3). In addition, the drug resistance profile and potential of a novel protease inhibitor (PI) PL-100 is presented in Chapters 4 and 5. In the first project, we used both B and non-B subtypes of HIV-1 to select for ETR resistance and showed that ETR selected for mutations at positions V90I, K101Q, E138K, V179D/E/F, Y181C, V189I, G190E, H221H/Y and M230L within 18 weeks of commencing drug pressure. Interestingly, E138K was the first mutation to emerge in most instances. Viral clones containing E138K displayed low-level phenotypic resistance to ETR (3.8-fold) and modestly impaired replication capacity (2-fold) compared to wild-type virus. We also examined resistance patterns to ETR and RPV in viruses containing NNRTI mutations at baseline. In wild-type (wt) viruses and viruses containing K103N alone, E138K or E138G mutations were observed in the presence of either ETR or RPV drug pressure followed by the appearance of other NNRTI resistance mutations. Alternatively, subtype B viruses containing Y181C generated V179I/F or A62V/A on exposure to ETR or RPV drug pressure, respectively, but not E138K. The addition of mutations at position 138 to Y181C did not significantly enhance levels of resistance to ETR or RPV. We also observed that the combination of Y181C and E138K may lead to a less fit virus compared to virus containing Y181C alone. Based on these findings, we suggest that Y181C may be antagonistic to E138K. The tissue culture drug resistance analysis of PL-100 in subtype C and CRF01_AE viruses is described in Chapter 4. PL-100 selected for PI resistance mutations along either of two distinct pathways, one of which involved resistance mutations at positions V82A and L90M while the other involved a mutation at position T80I, with other mutations being observed at positions M46I/L, I54M, K55R, L76F, P81S and I85V. An accumulation of at least three mutations in the protease flap and enzyme active sites were required in each case for high-level resistance to occur, demonstrating that PL-100 has a high genetic barrier against the development of drug resistance. In Chapter 5, we evaluated the potential of PL-100 as a second generation HIV-1 protease inhibitor. PL-100 resistant variants emerged within 8-48 weeks while darunavir (DRV) did not select for resistance mutations over a period of 40 weeks. Structural modeling demonstrated that the high genetic barrier of DRV is due to numerous interactions with protease that include hydrogen-bonding to PR backbone oxygens at amino acid positions A28, D29 and D30 via di-tetrahydrofuran (THF) groups, while binding of PL-100 was predominantly based on polar interactions and delocalized hydrophobic interactions through its diphenyl groups. Our data suggest that hydrogen bonding contacts and the di-THF group in DRV, as well as the hydrophobic nature of PL-100, contribute to PI binding and a high genetic barrier for resistance and that redesigning the structure of PL-100 to include a di-THF group might improve it antiviral potency and drug resistance profile.

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