Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval comme exigence partielle du programme de maîtrise en médecine expérimentale offert à l'Université du Québec à Chicoutimi en vertu d'un protocole d'entente avec l'Université Laval: Faculté de médecine, Université Laval, Québec et Département des sciences humaines, Université du Québec à Chicoutimi, Saguenay. Bibliogr.: f. [99]-108. Publié aussi en version électronique.

Thèse (M.Med.Exp.) -- Université du Québec à Chicoutimi, extensionné de l'Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. [99]-108. Document électronique également accessible en format PDF. CaQCU

Les maladies inflammatoires de l'intestin (MII) sont caractérisées par le dysfonctionnement de l'épithélium intestinal et la dérégulation de l'équilibre du système immunitaire. L'inflammation liée aux MII pourrait être déclenchée et / ou exacerbée par des signaux de danger tels que les nucléotides. Les nucléotides activent les récepteurs P2 et leurs niveaux sont modulés par des ectonucléotidases dont la famille des ecto-nucléosides triphosphates diphosphohydrolases (ENTPDases). Nous avons identifié le dernier membre de cette famille d'enzymes que nous avons nommé NTPDase8. Nous avons observé que cette enzyme est exprimée par peu de tissus dont les intestins. Dans cette thèse, nous démontrons que la NTPDase8 est exprimée à la surface apicale des cellules épithéliales intestinales (CEI) au niveau du colon. Nos résultats indiquent que la NTPDase8 est un protecteur clé de l'inflammation intestinale. En effet, elle prévient l'activation du récepteur P2Y6. Nous résultats proposent aussi que l’injection intra-rectale de la NTPDase8 protège totalement les souris de la colite induite par un modèle chimique. Le deuxième aspect abordé dans ma thèse est le rôle régulateur du récepteur P2Y6 dans l'inflammation intestinale. Nos résultats in vivo montrent l'importance de bloquer ce récepteur pharmacologiquement afin d’éviter le développement de l'inflammation et ainsi éviter une boucle inflammatoire. Nous avons également démontré que le récepteur P2Y6 joue un rôle clé dans la régulation de l'activité d'autres récepteurs à nucléotides in vitro, ce qui influence l'homéostasie des cellules épithéliales intestinales. Notre travail décrypte l'importance de la signalisation associée aux nucléotides dans la pathogenèse de la colite expérimentale et met en évidence des propriétés qui pourraient être appliquées à d’autres troubles gastro-intestinaux outre la colite. En extension, ces données suggèrent que l'axe NTPDase8-P2Y6 pourrait être une cible thérapeutique dans le traitement des maladies inflammatoires de l’intestin. / Inflammatory bowel diseases (IBD) are characterized by a dysfunction of the intestinal epithelium and a dysregulation of the immune system balance. The inflammation underlying IBD could be triggered and/or exacerbated by danger signals such as nucleotides. The nucleotides activate P2 receptors and their level is modulated by ectonucleotidases which include members of the ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) family. We identified the last member of this family of enzymes, the NTPDase8. We originally found its expression in the intestine at the RNA level. In this work, we demonstrate that NTPDase8 is expressed at the apical surface of intestinal epithelial cells (IEC) in the colon. Our results indicate that NTPDase8 is a key protector of intestinal inflammation by regulating the activation of P2Y6 receptor as the administration of the enzyme protects totally from the intestinal inflammation. In agreement, the deletion of NTPDase8 gene leads to a dramatic increase of inflammation is a murine model of colitis. The second aspect addressed in my thesis is the regulatory role of the P2Y6 receptor in intestinal inflammation. We found that this receptor expressed on IEC is pro-inflammatory and that blocking it pharmacologically prevented the intestinal inflammation triggered in a colitis model. We have also demonstrated that the P2Y6 receptor plays a key role in regulating the activity of other nucleotide receptors in vitro, which influences the homeostasis of intestinal epithelial cells. Our work deciphers the importance of nucleotide signaling in the pathogenesis of experimental colitis and highlights properties that could be applied to other gastrointestinal disorders. In extension, these data suggest that NTPDase8-P2Y6 axis could be a therapeutic target in the treatment of IBD.

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des « fragments » de cellules activement libérés dans tous les fluides biologiques. Elles transitent dans la circulation corporelle et transmettent leur contenu bioactif à d’autres cellules. Le lait est le fluide qui contient le plus de VE et celles-ci encapsulent plusieurs éléments bioactifs qui ont des effets anticancéreux, anti-inflammatoire et diminuent notamment les symptômes de la polyarthrite rhumatoïde in vivo. Durant ma thèse j’ai exploré la diversité des VE présentes dans le lait bovin commercial et j’ai étudié leurs activités biologiques dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Les résultats que j’ai obtenus démontrent l’existence de plusieurs populations de VE dans le lait bovin commercial que j’ai pu discriminer grâce à l’utilisation du citrate de sodium pour leur isolation. J’ai découvert qu’elles étaient capables de survivre lors de la digestion in vitro durant laquelle elles protègent leur contenu bioactif, notamment des microARN. Après avoir décrit en détail les différents microARN et protéines encapsulées dans ces VE, j’ai pu trouver des marqueurs spécifiques pour certains sous-ensembles de VE du lait. J’ai aussi montré le transfert de miR-223 bovin à des cellules humaines in vitro et son activité biologique sur l’expression d’un gène rapporteur. J’ai alors exploré l’activité biologique des VE du lait dans un modèle murin de colite induite par le Dextran sulfate sodium (DSS). La prise orale de VE du lait a diminué les symptômes de la maladie, restauré en partie le microbiote intestinal et rétabli la barrière digestive et les niveaux de mucines. J’ai aussi découvert que différentes populations de VE du lait ont différents effets sur l’inflammation du côlon, notamment en modulant le niveau de certains microARN impliqués dans le développement des MICI. Le lait contient donc différentes VE avec des activités biologiques différentes capables de moduler l’inflammation et le développement de pathologies digestives. L’étude des mécanismes qui sous-tendent leur bioactivité pourrait impacter la prise en charge des maladies inflammatoires, permettrait une amélioration des formulations de lait pour les nouveau-nés et serait d’importance pour la santé publique et le traitement industriel du lait commercial. / Extracellular vesicles (EVs) are cellular “fragments” actively released in all biological fluids. They are transported through body circulation and transmit their bioactive content to remote recipient cells. Milk is the biological fluid most enriched in EVs and these encapsulate several bioactive elements with anti-cancer and anti-inflammatory effects and reduce the symptoms of rheumatoid arthritis in vivo. During my thesis, I explored the diversity of EVs present in commercial bovine milk and studied their biological activities in the context of inflammatory bowel diseases (IBD). The results I obtained demonstrate the existence of several EV subsets in commercial bovine milk that I could discriminate using sodium citrate for their isolation. I found these EVs can survive during in-vitro digestion and protect their bioactive content, including microRNAs. After detailing the different microRNAs and proteins encapsulated in these EVs, I found specific markers for certain populations of milk EVs. I also reported the transfer of vesicular bovine miR-223 to human cells in vitro and its biological activity on the expression of a reporter gene. I then explored the biological activities of milk EVs in a mouse model of DSS-induced colitis. The oral intake of milk EVs decreased the symptoms of the disease, restored part of the intestinal microbiota, restored the intestinal barrier and replenished mucin levels. Also, different populations of milk EVs differentially modulated inflammation in the colon, notably by regulating the level of certain IBD-associated microRNAs. Milk therefore contains different EV subsets with different biological activities capable of modulating inflammation and the development of digestive pathologies. Studying the mechanisms underlying their bioactivity could impact the management of inflammatory diseases, improve milk formulations for newborns, and be of importance to public health and industrial milk processing.

La canneberge est un petit fruit typique du continent Nord-Américain et sa consommation s'est popularisée auprès de nombreuses personnes du fait de ses bienfaits reconnus sur la santé humaine. Le jus de canneberge possède également des effets bénéfiques sur la santé grâce à sa richesse en anthocyanes et en proanthocyanidines (PACs). Cependant, son contenu élevé en acides citrique, malique et quinique pourrait induire des effets secondaires au niveau intestinal lors de sa consommation quotidienne. De plus, la composition d'un tel type de jus pourrait également induire des changements au niveau du microbiote intestinal. De ce fait, l'objectif principal de cette thèse était de démontrer les effets potentiels du retrait des acides organiques par électrodialyse avec membranes bipolaires (EDMB) du jus de canneberge, sur l'apparition de l'inflammation intestinale in vitro et in vivo ainsi que sur le microbiote intestinal, tout en identifiant le ou les acide(s) organique(s) responsable(s) de cette inflammation et leur évolution au cours de la digestion. Dans un premier temps, l'étude réalisée in vitro a permis de démontrer pour la première fois l'évolution compositionnelle du jus de canneberge à chaque étape de la digestion. Les résultats ont indiqué une perte d'anthocyanes et de PACs majoritairement lors de la phase gastrique tandis que les concentrations en acides citrique, malique et quinique restaient inchangées à la fin de la digestion. De plus, il a été mis en évidence que l'acide citrique, présent dans le jus de canneberge, était responsable de la perte d'intégrité des cellules épithéliales et pourrait ainsi déclencher l'inflammation intestinale. Dans un second temps, une première étude réalisée in vivo, a quant à elle permis de démontrer l'effet de la concentration en acides organiques contenus dans le jus de canneberge sur l'apparition de l'inflammation intestinale chez la souris. Les résultats ont indiqué qu'il existait une relation entre la concentration en acides organiques du jus et la sévérité de l'inflammation intestinale observée. Aussi, il a été démontré que l'action protectrice des polyphénols, aux concentrations de ce jus de canneberge, aurait été diminuée par la forte teneur en acides organiques. Dans un troisième temps, une seconde étude in vivo a permis de confirmer l'importance de la concentration en polyphénols contenus dans le jus de canneberge quant à la protection de l'intestin contre l'apparition de l'inflammation. Les expériences menées chez la souris n'ont pas démontré de signe d'inflammation intestinale modulée par la teneur en acides organiques du jus de canneberge, de par sa teneur élevée en polyphénols. De ce fait, l'effet de l'EDMB sur l'amélioration de l'inflammation intestinale par le retrait des acides organiques contenus dans le jus de canneberge, n'a pas pu être démontré. Cependant, il a pu être observé que le retrait de ces acides organiques, à différents niveaux, induisait une modulation de la composition et des fonctions du microbiote intestinal. L'ensemble de cette thèse a donc démontré l'importance de l'aspect compositionnel du jus de canneberge quant à l'apparition de l'inflammation intestinale et la modulation du microbiote intestinal lors d'une consommation quotidienne. Cette thèse a également contribué à l'avancement des connaissances concernant l'impact de l'EDMB appliquée au jus de canneberge et les effets santé associés aux polyphénols et au microbiote intestinal en découlant. / Cranberry is a typical fruit from North America and its consumption increased due toits beneficial effects on human health. Cranberry juice is also recognized for its health benefits due to its richness in anthocyanins and proanthocyanidins (PACs). However, its high content of citric, malic and quinic acids could induce intestinal side effects when daily consumed. In addition, the composition of such a type of juice could also induce changes in the gut microbiota. Therefore, the main objective of this thesis was to demonstrate the potential effects of the removal of organic acids by electrodialysis with bipolar membrane(EDBM) in cranberry juice, on the apparition of intestinal inflammation in vitro and in vivo,as well as on the gut microbiota, while identifying the organic acid(s) responsible for this inflammation and their evolution during digestion. Firstly, an in vitro study demonstrated, for the first time, the evolution of composition of cranberry juice at each step of the digestion. Results indicated a loss in anthocyanins and PACs mainly at the gastric step while the content in organic acids was stable at the end of the digestion. Further more, it was evidenced that the content in citric acid of cranberry juice was responsible for the loss of integrity of the epithelial cells and, thereby, could induce intestinal inflammation. Secondly, a first in vivo study has shown the effect of the organic acid content of cranberry juice on the apparition of intestinal inflammation in mice. Results indicated a relation between the concentration in organic acids and the severity of the intestinal inflammation observed. Furthermore, the protective action of polyphenols, at the concentration of the juice, was decreased by the high content in organic acids. Thirdly, a second in vivo study, demonstrated the significance of the concentrations of polyphenols of cranberry juice in protecting the intestine from the occurrence of the inflammation. Experiments conducted in mice could not evidence intestinal inflammation modulated by the content in organic acids of cranberry juice, due to its high content in polyphenols. Therefore, the effect of EDBM on improving intestinal inflammation by removing the organic acid content of cranberry juice, could not be demonstrated. However, it was observed that the removal of organic acids, at different levels, induced a modulation of the composition and the functions of the gut microbiota. Finally, this thesis demonstrated the importance of the compositional aspect of cranberry juice for the apparition of intestinal inflammation and the modulation of gut microbiota when daily consumed. This thesis has also contributed to the understanding of the impact of EDBM applied to cranberry juice and its following health effects.

La dépression majeure est devenue la cause principale d'incapacité dans le monde. Pourtant, les antidépresseurs les plus courants sont inefficaces chez 30-50% des patients traités. La dépression présente une comorbidité élevée avec les troubles gastro-intestinaux, avec une pathologie commune comprenant le dysbiose du microbiote un profil périphérique hautement inflammatoire, ce qui suggère une perméabilité intestinale accrue chez ces patients. Il est proposé que le stress chronique soit lié à la détérioration de la barrière intestinale et à la dérégulation de la signalisation intestin-cerveau, cependant, les mécanismes biologiques restent à identifier. Nous avons utilisé les modèles de la dépression pour étudier les effets du stress chronique sur la perméabilité intestinale chez les souris mâles et femelles. Le séquençage du microbiote a montré une modification des populations microbiennes après le stress. De plus, l'expression génétique des jonctions serrées intestinales a été altérée avec des effets spécifiques au sexe, en fonction du type et de la durée du stress. Certaines modifications des jonctions serrées sont associées à la résilience ou à la susceptibilité à l'exposition au stress, déterminée par des tests comportementaux. Nous avons également identifié la protéine de liaison au lipopolysaccharide (LBP) comme un biomarqueur potentiel lié à la susceptibilité au stress chronique. En étudiant les différences entre individus et selon les sexes, nos résultats contribueront à la connaissance des mécanismes moléculaires qui déterminent la vulnérabilité ou la résilience au stress chronique. Les femmes ayant un risque environ deux fois plus élevé de développer une dépression, l'identification des différences entre les sexes est particulièrement pertinente. Ces études contribueront à l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques et diagnostiques pour le traitement de la dépression. Des traitements ciblant l'intégrité de la barrière intestinale pourraient avoir des effets positifs sur les voies inflammatoires périphériques et centrales impliquées dans la dépression. / Major depressive disorder (MDD) is the leading cause of disability worldwide. Still, common antidepressants are ineffective in 30-50% of treated patients, highlighting that biological mechanisms remain to be elucidated. MDD has high comorbidity with gastrointestinal disorders including patterns of microbiota dysbiosis and inflammatory peripheral markers, suggesting enhanced intestinal permeability in these patients. Chronic stress, the main environmental risk factor for MDD is linked to intestinal barrier deterioration and dysregulated gut-brain signalling. Therefore, we investigate effects of chronic stress on manifestations of intestinal permeability in both male and female mouse models of depression. Sequencing showed altered microbial populations post-stress. Furthermore, gene expression of intestinal tight junctions was altered with sex-specific effects, dependent on stress type and duration. Certain tight junction changes associated with resilience or susceptibility to the stress exposure, as determined by behavioural tests. We also identified Lipopolysaccharide binding protein (LBP) as a potential biomarker related to susceptibility to chronic stress. By investigating individual and sex differences, our results will be contributing to the knowledge of molecular mechanisms underlying vulnerability or resilience to chronic stress. As women have roughly a twofold higher risk of developing depression, identifying sex differences is particularly relevant. These studies will help to develop more effective and appropriate therapeutic strategies for the treatment of depression and possibly identify biomarkers which are greatly needed in the field. Targeting the intestinal barrier and potentially promoting barrier integrity, future treatments could have positive downstream effects on peripheral and central inflammatory pathways implicated in depression.

Les archées sont depuis peu reconnues comme étant des microorganismes ubiquitaires retrouvées dans le système digestif de l’humain et de plusieurs animaux. Les humains peuvent donc être exposés aux archées par leur propre microflore intestinale, mais aussi par le contact avec des fèces animales, dont les composantes peuvent être aérosolisées et inhalées. L’impact de ces archées sur la santé respiratoire et intestinale des humains n’est pas clairement établi. La composition exacte des bioaérosols doit être définie afin de bien comprendre ce à quoi sont exposés les humains. Par ailleurs, l’impact de Methanosphaera stadtmanae (MSS) et Methanobrevibacter smithii (MBS), deux espèces d’archées retrouvées dans le tractus intestinal, est inconnu dans un contexte de maladies inflammatoires de l’intestin. L’étude de la biodiversité des bioaérosols des fermes laitières a démontré la présence de grandes concentrations et de plusieurs espèces de bactéries et d’archées dans l’air de ces environnements. Les mécanismes inflammatoires pulmonaires à la base de la réponse immune causée par les archaea ont été étudiés grâce à un modèle murin d’exposition chronique des voies respiratoires. MSS a démontré un potentiel immunogénique plus fort que MBS, en induisant davantage d’altérations histopathologiques, de cellules inflammatoires et de cellules dendritiques myéloïdes activées que MBS dans les poumons de souris. Le potentiel inflammatoire de MSS et MBS a aussi été confirmé avec un modèle de cellules humaines. Finalement, afin d’étudier le rôle des archées dans l’inflammation intestinale, la présence de MBS et de MSS a été évaluée dans les selles de patients atteints de maladies inflammatoires de l’intestin et de sujets sains. Une prévalence accrue de l’archée inflammatoire MSS a été retrouvée dans les selles des patients. Des anticorps spécifiques à MSS ont aussi été retrouvés en plus grande concentration chez ce groupe de sujets. Ces résultats démontrent que les archées sont présentes à la fois dans les bioaérosols et dans les intestins humains et qu’elles peuvent avoir des impacts sur l’inflammation respiratoire et intestinale. Nous ne commençons qu'à explorer la présence des archées dans l’environnement humain et la réponse à ces agents méconnus. Leur rôle en tant qu'agents protecteurs, pro-inflammatoires ou tolérés mérite d'être approfondi. / Archaea have recently been recognized as ubiquitous microorganisms found in the digestive tract of human and several animal species. Humans can thus be exposed to archaea through several routes such as their own intestinal microflora, but also via exposure to animal manure which components can be aerosolized and inhaled. Archaeal impact on respiratory and intestinal human health is not known. Bioaerosol’s exact composition must be defined in order to better understand what humans are exposed to. Moreover, the role of Methanosphaera stadtmanae (MSS) and Methanobrevibacter smithii (MBS), two archaeal species found in human gut, on the health of the intestinal tract and potentially in inflammatory bowel diseases is unknown. Studies on dairy barns’ bioaerosol’s biodiversity revealed the presence of high airborne concentrations and various species of bacteria and archaea. Pulmonary inflammatory mechanisms of immune response to archaea were studied using a chronic airway exposure mouse model. MSS showed a higher immunogenic potential than MBS, with more severe hitopathological alterations and higher numbers of inflammatory cells and activated myeloid dendritic cells in exposed mice lungs than MBS. The inflammatory potential of MSS and MBS was also confirmed with a human cell model. Finally, to study the role of archaea in bowel inflammation, the presence of MBS and MSS was evaluated in stool samples from inflammatory bowel diseases’ patients and control subjects. A higher prevalence of the inflammatory archaea MSS was detected in stool samples from patients. MSS-specific antibodies were also found in higher concentration in this group. These results show that archaea are present in bioaerosols and human gut and that they can have an impact on respiratory and intestinal inflammation. We are just beginning to explore the presence of archaea in human environment and our response to these unheralded agents. Their role as protective, proinflammatory or tolerated agents awaits further studied.

Au cours de sa vie, un individu sur cinq sera touché par la dépression. Cette pathologie est la principale cause d'incapacité mondiale. Malgré l'existence de traitements pharmacologiques, 30 à 50 % d'individus déprimés ne répondent pas aux antidépresseurs. Ce faible taux souligne l'importance d'étudier des approches thérapeutiques novatrices qui ciblent les systèmes biologiques comme l'axe intestin-cerveau ou encore l'utilisation de stratégies préventives. Le stress chronique est un contributeur majeur au développement de la dépression et est associé à une activation de la réponse inflammatoire. Cette dernière affecte directement l'intégrité de la barrière intestinale, plus particulièrement la couche de cellules épithéliales interconnectées par les jonctions serrées qui tapissent l'intestin, régulant la perméabilité intestinale. Pour valider l'efficacité des stratégies préventives et d'étudier les effets du stress chronique sur l'intégrité intestinale, nous utilisons le modèle murin de la défaite sociale qui mime l'intimidation par les pairs. Pendant 10 jours, des souris mâles sont mises en contact avec un agresseur et en contact sensoriel. Ensuite, les sujets passent un test d'interactions sociales pour déterminer le phénotype comportemental face au stress, soit la susceptibilité ou la résilience. Pendant la défaite, elles sont exposées à un environnement enrichi ou de l'exercice physique, qui reproduit les stratégies préventives, favorisant la résilience face au stress. Les tissus intestinaux sont récoltés pour l'analyse transcriptionnelle et morphologique des protéines de jonctions serrées pour vérifier les changements de la barrière intestinale. Les stratégies préventives augmentent la proportion de souris résilientes. Au sein de cette population, l'expression des protéines de jonction serrée de l'intestin montre une adaptation moléculaire reliée à une diminution du stress chronique, ce qui suggère que l'intégrité de la barrière intestinale pourrait jouer un rôle clé dans la réponse au stress. Ces changements physiologiques pourraient prévenir les symptômes dépressifs et favoriser de nouvelles modalités thérapeutiques pour traiter la dépression. / Throughout life, one in five individuals will be affected by major depressive disorder (TDM). This disorder is the main cause of disability worldwide. Even though pharmacological treatment is available, only 30 to 50 % of depressed patients completely remit, suggesting that novel therapeutic approach targeting biological systems such as the gut-brain axis or preventive strategies should be studied. Chronic stress is the main contributor to the development of TDM and is associated with activation of inflammatory responses. This in return affects gut barrier (BI) integrity, more specifically the intestinal cell epithelium interconnected by tight junction proteins, regulating gut permeability. To validate efficacy of preventive strategies and study chronic stress effect on gut barrier integrity, we used a murine model of chronic social defeat stress (CSDS) which mimics intimidation. For 10 days, male mice are put in contact with a novel aggressor and after in sensory contact. After, animals are subjected to the social interaction test to determine behavioral phenotype, either susceptibility or resilient to stress. During the defeat, mice have access to enrich environment (EE) or voluntary wheel running (VWR), which reproduced preventive strategies. Intestinal tissue is collected for transcriptional analysis and morphological evaluation of tight junction protein to study intestinal barrier changes. Preventive strategies increase resilient mouse population. Expression of tight junction protein in the jejunum show molecular adaptation related a dampened stress response, suggesting that integrity of BI could play a key role in response to chronic stress. These physiological changes could prevent depressive symptoms and may open new alternatives in treatment of depression.