Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause for visual impairment in the elderly. The etiology of AMD remains unclear. Clinical and histopathological studies suggest that photoreceptors play a role in disease progression. Here, we found that photoreceptors of AMD patients show adaptive changes in gene expression, suggestive of a nutrient shortage. To study the effect of these changes, we mimicked the metabolic alteration in mouse photoreceptors, by disruption of the Tuberous Sclerosis Complex (TSC). This led to AMD hallmarks, including the advanced stages of geographic atrophy (GA) and choroidal neovascularization (CNV). Furthermore, we found that disease onset requires the activity of the mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1). To study the contribution of photoreceptors to disease, we profiled retinal phospholipids as photoreceptors are rich in phospholipids. We found a reduction in two docosahexaenoic acid (DHA)-containing phospholipids. Feeding DHA to mutant mice, alleviated most AMD-associated hallmarks. To study the inflammatory complications seen with current anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatments for CNV we used rAAV-mediated gene transfer to overexpress an anti-VEGF protein. We found that inhibition of VEGF can promote retinal inflammation. The data suggests that targeting photoreceptor metabolism may provide novel therapies to treat AMD.

Ackmann, Charlotte Osmotische Induktion des Komplementfaktors C9 in retinalen Pigmentepithelzellen Universität Leipzig, Dissertation 98 Seiten, 208 Literaturangaben, 28 Abbildungen, 8 Tabellen Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache für Erblindung bei Erwachsenen in den industrialisierten Ländern. Die AMD ist unter anderem eine chronisch entzündliche Erkrankung, bei der die Aktivierung der alternativen Komplementkaskade eine Rolle spielt. Daneben erhöht Bluthochdruck, der auch durch eine salzreiche Ernährung getriggert wird, das Risiko an einer AMD zu erkranken. Untersucht wurde die Genexpression des Komplementfaktors C9 unter verschiedenen pathologischen Bedingungen in humanen retinalen Pigmentepithel (RPE)-Zellen sowie deren Wirkung auf die physiologischen Eigenschaften der Zellen. Gezeigt wird, dass die Expression des C9 Gens in humanen RPE-Zellen spezifisch durch Hyperosmolarität, Hypoxie und oxidativen Stress induziert wird. Die Menge an C9 Protein wurde durch Hyperosmolarität leicht aber signifikant erhöht. Die hyperosmotische Induktion der C9 mRNA ist abhängig von der Aktivierung der Signalproteine p38 MAPK, ERK1/2, JNK, PI3K, sowie der Transkriptionsfaktoren STAT3 und NFAT5 während für die Hypoxie-induzierte C9 mRNA Expression nur eine Beteiligung des Transkriptionsfaktors STAT3 nachgewiesen wurde. Die Aktivierung verschiedener Signalwege durch Hyper-osmolarität und Hypoxie lässt vermuten, dass eine hohe Kochsalzaufnahme auch unter normoxischen Verhältnissen die Eigenschaften RPE-Zellen verändert. Hyperosmolarität hemmt die Proliferation und Migration der RPE-Zellen, während chemische Hypoxie nur die Proliferationsrate verringert. Die Wirkung einer erhöhten extrazellulären NaCl-Konzentration auf die C9 mRNA Expression wird über zwei Mechanismen vermittelt: über die Erhöhung der extrazellulären Osmolarität und über die Veränderung des NaCl-Gradienten über der Plasmamembran. Die NaCl Wirkung über den veränderten NaCl-Gradienten lässt vermuten, dass eine übermäßige Aufnahme von Kochsalz nicht nur über die Erhöhung des Blutdruckes die Pathogenese der AMD stimuliert, sondern dass Kochsalz auch eine direkte stimulierende Wirkung auf RPE-Zellen besitzt. Diese Vermutung könnte erklären, weshalb hoher Blutdruck ein Risikofaktor der AMD ist, aber Medikamente zur Behandlung des Bluthochdruckes das Risiko der AMD nicht verändert.:Inhaltsverzeichnis Bibliographische Beschreibung IV Abkürzungsverzeichnis V 1. EINLEITUNG 1 1.1. Das retinale Pigmentepithel (RPE) 1 1.2. Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) 2 1.2.1. Die atrophe AMD 3 1.2.2. Die exsudative AMD 4 1.2.3. Die Aktivierung des Komplementsystems bei der exsudativen AMD 5 1.3. Risikofaktoren der AMD 7 1.4. Einfluss von Hypertonie auf die AMD 9 1.4.1. Hypertonie 9 1.4.2. Hypertonie als Risikofaktor der AMD 10 1.5. Therapie der AMD 11 2. FRAGESTELLUNG 13 3. MATERIAL UND METHODEN 14 3.1. Arbeitsmaterialien 14 3.1.1. Substanzen 14 3.1.2. Medien 15 3.1.3. Kits 15 3.1.4. Primer 16 3.1.5. Längenstandards 16 3.1.6. Antikörper 16 3.1.7. Rekombinante humane Proteine 17 3.1.8. Selektive Hemmer 17 3.1.9. Geräte 17 3.2. Zellbiologische Methoden 19 3.2.1. Zellkultivierung 19 3.2.2. Zellstimulation 20 3.2.3. Bestimmung der Proliferationsrate 21 3.2.4. Zellmigration 22 3.3. Molekularbiologische Methoden 23 3.3.1. RNA-Präparation 23 3.3.2. RNA Quantifizierung 24 3.3.3. cDNA-Synthese 24 3.3.4. Real-Time PCR 24 3.3.5. Agarose-Gel-Elektrophorese 26 3.3.6. Untersuchungen mit short interfering (si) RNA 27 3.4. Immunologische Methoden 28 3.4.1. Western Blot 28 3.4.1.1. Extraktherstellung aus RPE-Zellen 28 3.4.1.2. Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford 29 3.4.1.3. SDS-Gelektrophorese 30 3.4.1.4. Western Blot 32 3.5. Statistische Auswertung 33 4. ERGEBNISSE 34 4.1. Regulation der Genexpression von Komplementfaktoren in RPE-Zellen 34 4.1.1. Hyperosmolarität erzeugt durch NaCl 34 4.1.2. Hyperosmolarität erzeugt durch Sucrose 36 4.1.3. Wirkung von Hypoosmolarität und oxidativem Stress 37 4.1.4. Wirkung von Hypoxie 38 4.1.5. Gemeinsame Wirkung von CoCl2 und NaCl 38 4.1.6. Wirkung von Zytokinen 39 4.1.7. Wirkung von Serum- und Gerinnungsfaktoren sowie Glukose 40 4.1.8. Wirkung von Entzündungsmediatoren 40 4.1.9. Wirkung von Matrixmetalloproteinase und Triamcinolon 41 4.2. Wirkung von Hyperosmolarität auf die Transkription und die Stabilität der C9 mRNA 42 4.3. Beteiligung intrazellulärer Signalwege und Transkriptionsfaktoren an der Induktion der C9 mRNA unter Hyperosmolarität und Hypoxie in RPE-Zellen 43 4.3.1. Beteiligung intrazellulärer Signalwege und Transkriptionsfaktoren an der NaCl-induzierten C9 mRNA Expression in RPE-Zellen 43 4.3.2. Hyperosmolare Induktion der C9 mRNA: Einfluss des Transkriptionsfaktors NFAT5 44 4.3.3. Beteiligung intrazellulärer Signalwege und Transkriptionsfaktoren an der Hypoxie-induzierten C9 mRNA Expression bei RPE-Zellen 46 4.4. Aktivierung intrazellulärer Signalproteine durch Hyperosmolarität bzw. Hypoxie 47 4.5. Wirkung von Hyperosmolarität auf das C9 Protein 48 4.6. Wirkung von Hyperosmolarität auf die physiologischen Eigenschaften der RPE- Zellen 50 4.6.1. Wirkung von Hyperosmolarität auf die Zellproliferation 50 4.6.2. Wirkung von Hyperosmolarität auf die Zellmigration 51 4.6.3. Wirkung von Hyperosmolarität auf die Zellvitalität 51 5. DISSKUSION 53 5.1. Wirkung von Hyper-, Hypoosmolarqität, Hypoxie und oxidativem Stress auf die Genexpression von C9 in humanen RPE-Zellen 53 5.3. Wirkung von Hyperosmolarität auf die Stabilität der C9 mRNA 56 5.4. Beteiligung intrazellulärer Signalwege und Transkriptionsfaktoren an der NaCl- bzw. CoCl2-induzierten C9 mRNA Expression in RPE-Zellen 56 5.5. Einfluss des Transkriptionsfaktors NFAT5 auf die hyperosmolare C9 Induktion 58 5.6. Aktivierung intrazellulärer Signalproteine durch Hyperosmolarität bzw. Hypoxie 58 5.7. Wirkung von Hyperosmolarität auf das C9 Protein 59 5.8. Wirkung des Komplementfaktors C9 und der Hyperosmolarität auf die physiologischen Eigenschaften von RPE-Zellen 60 5.8.1. Wirkung auf die Zellproliferation 60 5.8.2. Wirkung auf die Zellmigration 60 5.8.3. Wirkung auf die Zellvitalität 61 5.9. Bedeutung für das Verständnis der Pathogenese der AMD 61 6. ZUSAMMENFASSUNG 63 7. LITERATURVERSZEICHNIS 68 8. TABELLENVERZEICHNIS 85 9. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 86 10. ANHANG 88 10.1. Eigenständigkeitserklärung 88 10.2. Lebenslauf 89 10.3. Danksagung 90

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20810号 / 医博第4310号 / 新制||医||1025(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 清水 章, 教授 萩原 正敏, 教授 松原 和夫 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21002号 / 医博第4348号 / 新制||医||1027(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 大森 孝一, 教授 山田 亮, 教授 Shohab YOUSSEFIAN / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of cells located directly behind the photoreceptor cells in the retina. These cells are involved in a variety of functions that support the visual process in the eye, namely 1) they form a blood-retina barrier which separates the neural retina from the choroid's blood supply, 2) the apical processes of RPE cells diurnally phagocytose the outer segments of photoreceptor cells, and 3) they participate in the renewal of the photopigment 11-cis retinal. Age-related macular degneration (AMD) is the leading cause of blindness in people over the age of 50 years in North America and other developed countries. AMD involves the death of retinal pigment epithelial (RPE) cells in the macula early in the progress of the disease. Like some other postmitotic cells, the RPE accumulates autofluorescent lysosomal storage bodies (lipofuscin) during senescence. Lipofuscin is reported to begin accumulating in the human RPE around age 20 and continues to accumulate throughout an individual's life. This progressive accumulation of lipofuscin can eventually occupy a substantial fraction of the RPE cytoplasmic volume and may lead to impairment of normal RPE functions, resulting in retinal degeneration and loss of visual function as in AMD. Another autofluorescent granule that accumulates in RPE cells and may contribute to the etiology of AMD is a complex granule exhibiting properties of both melanosomes and lipofuscin granules called melanolipofuscin (MLF). In contrast with the accumulation of LF in the RPE, MLF accumulation has been reported by Feeney-Burns to more closely reflect the onset of AMD. Although there have been significant advances in our understanding of AMD, knowledge of the mechanisms responsible for its progression remain unclear. This dissertation details experiments that were designed to better understand the factors that may play a causal role in AMD as well as the development of methods to assist in AMD research. Specifically, the protein composition of retinal LF was assessed to elucidate its origin. These findings are reported in chapter 2. The accumulation, composition and phototoxicity of MLF were analyzed to assess MLF's origin and possible contribution to AMD. These results are reported in chapter 3. Because protein oxidation is possibly a common posttranslational modification to proteins which accumulate in lipofuscin and melanolipofuscin granules, a method for the detection and analysis of oxidized proteins was developed and is reported in chapter 4. Chapter 5 details the proteomic differences between ARPE-19 cells - the only human RPE cell line available for research - in their differentiated and undifferentiated states and compares these to the proteome of human RPE cells. These results are also compared to the phenotypic difference of these cells as observed by transmission electron microscopy.

Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the United States of America. The pyridinium bis-retinoid A2-ethanolamine (A2E) has been implicated to play a role in AMD. We have observed novel pyridinium bis-retinoids through melanolipofuscin and human RPE extractions that may also play a role in the pathology of AMD. We have begun the construction of an amino-retinoid library in order to identify these ocular compounds. The compounds from the amino-retinoid library are also used in a targeted and triggered drug delivery system for treating cancer. Folic acid is coupled with the amino-retinoids to specifically target cancer cells. The first two amino-retinoids to be synthesized and characterized were A2-dopamine (A2D) and A2-cadaverine (A2C). Both pyridinium bis-retinoids were shown to generate cytotoxic oxidation products similar to A2E. Successful coupling of folic acid to A2C was achieved to form the folic acid-A2-cadaverine (FA-A2C) product. Preliminary irradiation results suggest that the FA-A2C product may be more photoreactive than initially anticipated. This could mean less drug and light exposure required to induce apoptosis and could eventually lead to a less invasive and toxic cancer treatment.

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Deutschsprachige Zusammenfassung Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. Titel: Mögliche Korrelation zwischen dem Stadium der altersabhängigen Makuladegeneration und der zentralen Hornhautdicke eingereicht von: Christian Koch angefertigt an der: Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde Universität Leipzig betreut von: Professor Dr. med. Peter Wiedemann Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde Universität Leipzig Monat und Jahr: Juni 2015 Annahme: Es soll ein statistischer Zusammenhang zwischen der zentralen Hornhautdicke in der Pupillenmitte mit dem nicht exsudativen frühen Stadium der AMD, dem exsudativen späten Stadium der AMD und einer Kontrollgruppe überprüft werden. Methodik: Die erste Studiengruppe stellten 48 Augen von 48 Patienten mit einer Form der frühen AMD dar (Durchschnittsalter 75,4 Jahre, 70,8% der Probanden waren Frauen). Die zweite Studiengruppe bildeten 49 Augen von 49 Patienten mit einer Form der späten AMD (Durchschnittsalter 79,8 Jahre, 59,2% der Probanden waren Frauen). Als Kontrollgruppe wurden 49 Augen von 49 Individuen ohne retinale oder korneale Erkrankungen genutzt (Durchschnittsalter 68,9 Jahre, 59,2% der Probanden waren Frauen). Die Vermessung der Hornhautdicke in Pupillenmitte im Sinne der Hornhautmittendicke erfolgte als Pachymetrie mit der Oculus Pentacam. Ergebnisse: Die durchschnittliche zentrale Hornhautdicke betrug bei der Kontrollgruppe 552,76 μm (SD 36,27 μm), bei der nicht exsudativen Gruppe 552,19 μm (SD 31,27 μm) und bei der exsudativen Gruppe 553,73 μm (SD 33,11 μm). Die Extrempunkte der Kontrollgruppe lagen bei 483 und 640 μm, der Gruppe der nicht exsudativen AMD bei 480 und 617 μm und Minimum und Maximum der exsudativen Gruppe bei 473 und 617 μm. Es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede im arithmetischen Mittel der zentralen Hornhautdicke in Pupillenmitte bei der Studiengruppe mit früher AMD im Vergleich mit der Studiengruppe mit später AMD und jeweils im Vergleich zur Kontrollgruppe (P > 0,05). Schlussfolgerung: Die Messwerte der zentralen Hornhautdicke bei Patienten mit früher AMD, später AMD und Kontrollindividuen unterscheiden sich nicht. Die Erhebung der Hornhautmittendicke bietet somit keine Screeningmöglichkeit zur Erkennung einer AMD. / English Abstract Central corneal thickness in patients with AMD Koch, C.; Jochmann, C.; Wiedemann, P. University of Leipzig, Department of Ophthalmology and Eye Hospital, Leipzig, Germany Purpose: To evaluate central corneal thickness in patients with AMD in the early and late phase and a control group. Method: The first study group was made up of 48 eyes of 48 patients with early AMD (mean age 75.4 years, 70.8 % women), the second study group was made up of 49 eyes of 49 patients with late AMD (mean age 79.8 years, 59.2 % women). 49 eyes of 49 individuals without any retinal or corneal damage (mean age 68.9 years, 59.2 % women) were used as control group. The central corneal thickness was measured with the Oculus Pentacam pachymetry. Results: The mean central corneal thickness in early non-exudative AMD group was found to be 552.19 μm (SD 31.27 μm), while the mean central corneal thickness in the late exudative AMD group was measured as 553.73 μm (SD 33.11 μm). The control group had a mean central corneal thickness of 552.76 μm (SD 36.27 μm). There were no statistically significant differences in the mean central corneal thickness in the early non-exudative AMD group in comparison with the late exudative AMD group and each of them compared to the control group (P > 0,05). Conclusion: The central corneal thickness measurements do not differ in patients with early non-exudative AMD, late exudative AMD and control subjects.