Ansamling av amyloid beta (Aβ) i de extracellulära miljöerna är associerad till många svåra sjukdomar som Alzheimers och ålders-relaterad makuladegeneration (AMD). Amyloider karaktäriseras av att de är olösliga, toxiska mot neuron och orsakar därför svår skada. AMD är den ledande orsaken till blindhet och irreversibelt förlorande av skarp syn då Aβ manifesterar i makula. I AMD orsakar Aβ inflammatorisk aktivitet där det retinala pigmentepitelet bryts ned och ljuskänsliga fotoreceptorer dör genom apoptos. Idag lever ca 150 miljoner människor med AMD där mänga har svårt att utföra vardagliga uppgifter till följd av förlust av skarp syn. Idag är Kongo röd en av de vanligaste metoderna för att visualisera amyloider in vitro. Den patogenes som orsakas av amyloider kan analyseras med immunofluorescens och immunohistokemi. Syftet med studien var att undersöka förekomst av amyloider i samband med celldöd i näthinna från gris, undersöka den patogenes som amyloider orsakar med immunofluorescens och immunohistokemi, samt undersöka om det finns korrelation mellan amyloider och celldöd. Resultatet visade att amyloider var förekommande i näthinnan och hade orsakat celldöd och ansamling av aggresomer. Amyloider och den patologi som orsakats kunde visualiseras i det yttre lagret av näthinnan. / Deposition of amyloid beta (Aβ) in the extracellular environment are associated to some severe diseases, like Alzheimer’s disease and age-related macular degeneration (AMD). Amyloids are characterized by insolubility, toxicity towards neuron and are there-for damaging to tissues. AMD is the primary cause of blindness and irreversible loss of central vision through manifestation of Aβ in the macula. In AMD, Aβ drives an inflammatory action that degenerates the retinal pigment epithelium and cause atrophy of photoreceptors. Today ~150 million people live with AMD where many find difficulties performing everyday tasks due to loss of sharp vision. Congo red is a gold standard for visualizing amyloids in vitro and the pathogenesis caused by amyloids can be analyzed by immunofluorescence and immunohistochemistry. The purpose of this study was to show the presence of amyloids relating to cell death in pig retina, show the pathogenesis caused by amyloids by using immunofluorescence and immunohistochemistry, and investigate whether there is correlation between amyloids and cell death. The result showed that amyloids were present in the retina and caused cell death and gathering of aggresomes. Amyloids and the caused pathology could be visualized in the outer layer of the retina.

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), une maladie neurodégénérative de la rétine, est considérée comme la principale cause de perte de vision chez les personnes âgées. Le CD36 est un récepteur éboueur (scavenger) exprimé à la surface des phagocytes mononucléés et de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), qui agit également comme corécepteur de l’hétérodimère des récepteurs de type Toll-like (TLR) 2/6 dans l’induction de l’inflammation. Dans la DMLA, l’activation du CD36 favorise l’internalisation des lipides oxydés par les cellules de l’EPR, le recrutement et l’accumulation des phagocytes mononucléés (microglie, monocytes/macrophages), ainsi que l’induction de la réponse inflammatoire au niveau sous-rétinien. L’identification du CD36 comme récepteur de peptides synthétiques de la famille des sécrétines de l’hormone de croissance (GHRPs) par notre laboratoire, nous a conduit au développement de ligands plus sélectifs pour ce récepteur, qui ont été étudiés dans le contexte des maladies inflammatoires chroniques liées aux macrophages telle que l’athérosclérose. Étant donné les similitudes observées entre la pathologie de l’athérosclérose et de la DMLA, nous avons émis l’hypothèse selon laquelle les azapeptides, comme ligands du CD36, auraient des effets protecteurs contre la DMLA en modulant la réponse inflammatoire. Ainsi, l’objectif général de ce projet de doctorat était d’évaluer les effets anti-inflammatoires et immunomodulateurs des azapeptides, comme ligands du CD36, et d’élucider leurs mécanismes d’action au niveau des macrophages ainsi que dans des modèles murins de DMLA. Le premier objectif spécifique de cette thèse était de déterminer l’effet de l’azapeptide MPE-001 dans la modulation de la réponse inflammatoire cellulaire médiée par le TLR2 et les voies de signalisation associées. Pour ce faire, des macrophages péritonéaux de souris C57BL/6 ou déficientes en Cd36 (Cd36-/-) ont été stimulés avec des agonistes du TLR2. Le traitement avec le MPE-001 a induit une diminution significative de la production de cytokines pro-inflammatoires, tels que le TNFa, l’IL-6, l’IL-12 et l’IL-1b et la chimiokine CCL2, de même qu’une inhibition des voies de signalisation nuclear factor kB (NFkB), c-Jun N-terminal kinase (JNK) et P38. Ce premier objectif nous a permis de mettre en évidence les effets anti-inflammatoires du MPE-001 et son mécanisme d’action, en modulant la réponse inflammatoire médiée par l’hétérodimère TLR2/6. Afin de déterminer les effets du MPE-001 sur la modulation de la réponse inflammatoire chez un modèle murin de DMLA, les souris C57BL/6, Cd36-/-, Cx3Cr1-/- et Cx3Cr1-/-/Cd36-/- ont été soumises à un stress photo-oxydatif induit par la lumière bleue pendant 5 jours. Une journée après le début de l’illumination, les souris ont reçu une injection s.c. de MPE-001 répétée pendant 7 jours. Le modèle murin de Cx3Cr1-/- est connue pour exacerber la réponse inflammatoire et induire l’accumulation de phagocytes mononucléés, plus particulièrement les microglies dans la rétine. Les montages à plat des coupes des yeux prélevés ont montré que le traitement au MPE-001 a engendré une diminution importante de 60% de l’accumulation de phagocytes mononucléés dans l’espace sous-rétinien, de même qu’une diminution des marqueurs inflammatoires (iNOS, IL-12), ainsi que la préservation de l’intégrité et de la fonction des photorécepteurs. Ce deuxième objectif nous a permis de démontrer les effets in vivo du MPE-001, en entraînant une diminution de l’accumulation de phagocytes mononucléés sous-rétiniens et la préservation des photorécepteurs. Étant donné les effets inhibiteurs du MPE-001 sur la sécrétion d’IL-1b, notre troisième objectif était d’investiguer l’effet du MPE-001 sur la régulation de l’inflammasome au niveau des macrophages. Nous avons montré que le MPE-001 entraînait une diminution de la réponse inflammatoire en inhibant la sécrétion d’IL-1b au niveau des macrophages, tout en diminuant l’expression de nucleotide-binding domain leucin-rich repeat and pyrin-containing receptor 3 (NLRP3) et de la caspase-1. Ce troisième objectif nous a permis de montrer que le MPE-001 a modulé le profil inflammatoire des macrophages en atténuant l’inflammasome NLRP3. Étant donné que le phénotype des macrophages est régulé par leur métabolisme, notre 4e et dernier objectif était de déterminer si les effets anti-inflammatoires du MPE-001 pouvaient influencer la polarisation des macrophages. Pour ce faire, nous avons utilisé un modèle de bone marrow-derived macrophages (BMDM) induits en phénotype pro-inflammatoire M1 ou anti-inflammatoire M2. Bien que le MPE-001 n’ait eu aucune influence sur les marqueurs de surfaces phénotypiques, nous avons montré que ce dernier induisait un changement métabolique des macrophages pro-inflammatoires M1, en inhibant la glycolyse et en favorisant la phosphorylation oxydative, de façon dépendante du récepteur nucléaire peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ). En conclusion, les travaux de cette thèse ont montré que l’azapeptide MPE-001 possède de puissants effets anti-inflammatoires et immunomodulateurs au niveau des macrophages dans un contexte d’inflammation rétinienne, pouvant constituer une nouvelle approche thérapeutique prometteuse pour le traitement de la DMLA. / Age-related macular degeneration (AMD), a neurodegenerative disease of the retina, is considered to be the main cause of vision loss in the elderly. CD36 is a scavenger receptor expressed on the surface of mononuclear phagocytes and retinal pigment epithelium (RPE), which also acts as a co-receptor for the Toll-like receptor (TLR)-2/6 heterodimer in the induction of inflammation. In AMD, CD36 activation promotes the internalization of oxidized lipids by RPE cells, the recruitment and accumulation of mononuclear phagocytes (microglia, monocytes / macrophages), as well as the induction of the inflammatory response at the subretinal level. The identification of CD36 as a receptor for synthetic peptides of the growth hormone releasing-peptides (GHRP) by our laboratory, led us to the development of more selective ligands for this receptor, which have been studied in the context of chronic inflammatory diseases related to macrophages such as atherosclerosis. Given the similarities observed between the pathology of atherosclerosis and AMD, we hypothesized that azapeptides, as CD36 ligands, protect against AMD by modulating the inflammatory response. Thus, the general objective of this doctoral project was to characterize the anti-inflammatory and immunomodulatory effects of azapeptides, as CD36 ligands, and to elucidate their mechanisms of action on macrophages as well as in murine models of AMD. The first specific objective of this thesis was to determine the effect of the azapeptide MPE-001 in the modulation of the cellular TLR2-mediated inflammatory response and the associated signaling pathways. To do so, peritoneal macrophages from C57BL/6 or Cd36-deficient (Cd36-/-) mice were stimulated with TLR2 agonists. Treatment with MPE-001 induced a significant decrease in the production of pro-inflammatory cytokines, such as TNFa, IL-6, IL-12 and IL-1b and the chemokine CCL2, as well as inhibition of the nuclear factor k B (NF kB), N-terminal c-Jun kinase (JNK) and P38 signaling pathways. This first objective allows us to highlight the anti-inflammatory effects of MPE-001 and its mechanism of action, by modulating the inflammatory response mediated by the TLR2/6 heterodimer. In order to determine the effects of MPE-001 on the modulation of the inflammatory response in a mouse model of AMD, the murine models C57BL/6, Cd36-/-, Cx3Cr1-/- and Cx3xr1-/-/Cd36-/- were subjected to photo-oxidative stress induced by blue light for 5 days. One day after the start of illumination, the mice received a repeated s.c. injection of MPE-001 for 7 days. The mouse model of Cx3Cr1-/- is known to exacerbate the inflammatory response and induce the accumulation of mononuclear phagocytes, more specifically microglia, in the retina. Flat mounts from collected eyes showed that MPE-001 treatment caused a significant 60% decrease in the accumulation of mononuclear phagocytes in the subretinal space, as well as a reduction in inflammatory markers (iNOS, IL-12), with the preservation of photoreceptor integrity and function. This second objective allows us to demonstrate the in vivo effects of MPE-001, leading to a decrease in the accumulation of sub-retinal mononuclear phagocytes and the preservation of photoreceptors. Given the inhibitory effects of MPE-001 on IL-1b secretion, our third objective was to investigate the effect of MPE-001 on inflammasome regulation in macrophages. We have shown that MPE-001 decreases the inflammatory response by inhibiting the secretion of IL-1b in macrophages, while decreasing the expression of nucleotide-binding domain leucin-rich repeat and pyrin-containing receptor 3 (NLRP3) and caspase-1. This third objective allows us to show that MPE-001 modulates the inflammatory profile of macrophages by attenuating the NLRP3 inflammasome. Since macrophage phenotypes are regulated by their metabolism, our fourth and final objective was to determine whether the anti-inflammatory effects of MPE-001 could influence the polarization of macrophages. To do so, we used a bone marrow-derived macrophages (BMDM) model induced to pro-inflammatory M1 or anti-inflammatory M2 phenotype. Although MPE-001 had no influence on phenotypic markers, we have shown that the latter induces a metabolic shift of the pro-inflammatory M1 macrophages, by inhibiting glycolysis and promoting oxidative phosphorylation of macrophages, in a peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-g)-dependent manner. In conclusion, the work conducted in this thesis showed that the azapeptide MPE-001 has powerful anti-inflammatory and immunomodulatory effects on macrophages in a context of retinal inflammation, which could constitute a promising new therapeutic approach for the treatment of AMD.

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Deutschsprachige Zusammenfassung Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. Titel: Mögliche Korrelation zwischen dem Stadium der altersabhängigen Makuladegeneration und der zentralen Hornhautdicke eingereicht von: Christian Koch angefertigt an der: Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde Universität Leipzig betreut von: Professor Dr. med. Peter Wiedemann Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde Universität Leipzig Monat und Jahr: Juni 2015 Annahme: Es soll ein statistischer Zusammenhang zwischen der zentralen Hornhautdicke in der Pupillenmitte mit dem nicht exsudativen frühen Stadium der AMD, dem exsudativen späten Stadium der AMD und einer Kontrollgruppe überprüft werden. Methodik: Die erste Studiengruppe stellten 48 Augen von 48 Patienten mit einer Form der frühen AMD dar (Durchschnittsalter 75,4 Jahre, 70,8% der Probanden waren Frauen). Die zweite Studiengruppe bildeten 49 Augen von 49 Patienten mit einer Form der späten AMD (Durchschnittsalter 79,8 Jahre, 59,2% der Probanden waren Frauen). Als Kontrollgruppe wurden 49 Augen von 49 Individuen ohne retinale oder korneale Erkrankungen genutzt (Durchschnittsalter 68,9 Jahre, 59,2% der Probanden waren Frauen). Die Vermessung der Hornhautdicke in Pupillenmitte im Sinne der Hornhautmittendicke erfolgte als Pachymetrie mit der Oculus Pentacam. Ergebnisse: Die durchschnittliche zentrale Hornhautdicke betrug bei der Kontrollgruppe 552,76 μm (SD 36,27 μm), bei der nicht exsudativen Gruppe 552,19 μm (SD 31,27 μm) und bei der exsudativen Gruppe 553,73 μm (SD 33,11 μm). Die Extrempunkte der Kontrollgruppe lagen bei 483 und 640 μm, der Gruppe der nicht exsudativen AMD bei 480 und 617 μm und Minimum und Maximum der exsudativen Gruppe bei 473 und 617 μm. Es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede im arithmetischen Mittel der zentralen Hornhautdicke in Pupillenmitte bei der Studiengruppe mit früher AMD im Vergleich mit der Studiengruppe mit später AMD und jeweils im Vergleich zur Kontrollgruppe (P > 0,05). Schlussfolgerung: Die Messwerte der zentralen Hornhautdicke bei Patienten mit früher AMD, später AMD und Kontrollindividuen unterscheiden sich nicht. Die Erhebung der Hornhautmittendicke bietet somit keine Screeningmöglichkeit zur Erkennung einer AMD. / English Abstract Central corneal thickness in patients with AMD Koch, C.; Jochmann, C.; Wiedemann, P. University of Leipzig, Department of Ophthalmology and Eye Hospital, Leipzig, Germany Purpose: To evaluate central corneal thickness in patients with AMD in the early and late phase and a control group. Method: The first study group was made up of 48 eyes of 48 patients with early AMD (mean age 75.4 years, 70.8 % women), the second study group was made up of 49 eyes of 49 patients with late AMD (mean age 79.8 years, 59.2 % women). 49 eyes of 49 individuals without any retinal or corneal damage (mean age 68.9 years, 59.2 % women) were used as control group. The central corneal thickness was measured with the Oculus Pentacam pachymetry. Results: The mean central corneal thickness in early non-exudative AMD group was found to be 552.19 μm (SD 31.27 μm), while the mean central corneal thickness in the late exudative AMD group was measured as 553.73 μm (SD 33.11 μm). The control group had a mean central corneal thickness of 552.76 μm (SD 36.27 μm). There were no statistically significant differences in the mean central corneal thickness in the early non-exudative AMD group in comparison with the late exudative AMD group and each of them compared to the control group (P > 0,05). Conclusion: The central corneal thickness measurements do not differ in patients with early non-exudative AMD, late exudative AMD and control subjects.

La dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) touche actuellement un million de Canadiens, ce qui en fait la principale cause de perte de vision au Canada. La DMLA cause l’apparition d’une tache aveugle au niveau de la macula – la zone centrale de la vision. Cette tache aveugle affecte la vision centrale rendant les perceptions visuelles floues ou déformées. L’impact de cette condition est considérable puisqu’elle rend impossible la conduite, difficile la lecture et entraîne ultimement une cécité totale. La DMLA a également été identifiée comme facteur de risque de la dépression et de l’isolement sociale, ce qui porte d’autant plus atteinte à la qualité de vie des patients. Une des avenues de réadaptation pour les patients est d’améliorer leur utilisation de leur fonction visuelle résiduelle, notamment la vision périphérique. Le but de la présente recherche est d’investiguer le potentiel réadaptatif d’un entraînement imposant l’utilisation de la vision périphérique chez des participants en bonne santé en présence d’une perte de vision centrale simulée. Une compréhension des changements dans les comportements des mouvements oculaires en présence d'un scotome artificiel central aidera à développer des programmes de réadaptation pour les personnes atteint de DMLA et plus largement les personnes présentant une perte visuelle centrale. Les résultats démontrent une adaptation des stratégies visuelles des participants, entraînant une augmentation de la performance, une réduction des temps de réponse et une meilleure discrimination, suggérant ainsi que l’entraînement est susceptible de contribuer à la réadaptation des personnes atteintes de pertes visuelles centrales. / Age Macular Degeneration (AMD) currently affects one million Canadians, making it the leading cause of vision loss in Canada. AMD causes the appearance of a blind spot on the macula – the central area of vision. This blind spot affects the central vision making visual perceptions blurry or distorted. The impact of this condition is considerable since it impedes driving as well as reading and ultimately leads to total blindness. AMD has also been shown to be a risk factor for depression and social isolation, further compromising quality of life for patients. One of the avenues of rehabilitation for patients is to improve their use of their residual visual function, in particular their peripheral vision. The purpose of the present research is to investigate the rehabilitative potential of training requiring the use of peripheral vision in healthy participants in the presence of a simulated central vision loss. An understanding of changes in eye movement patterns in the presence of a central artificial scotoma will help develop rehabilitation protocols for people with AMD and more broadly people with central visual loss. Results demonstrate an adaptation of visual strategies among participants, resulting in increased performance, reduced response times and better discrimination, suggesting that training is likely to contribute to the rehabilitation of people with central vision loss.

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Purpose: The main objective of the present study was the investigation of possible influence of lens opacification on macular pigment optical density (MPOD) measurements. Methods: 86 eyes of 64 patients (mean age 73.4(±8.3)years) were included in the study. MPOD was prospectively measured using one-wavelength reflection method (Visucam500, Carl Zeiss Meditec AG) before and after cataract extraction with implantation of a blue-light filtering intraocular lens (AlconSN60WF). The median of the maximum optical density (MaxOD) and the median of the mean optical density (MeanOD) measurements of macular pigment across the subject group were evaluated. Results: Statistically significant differences were noticed between pre-operative and post-operative measurements, the absolute values were generally lower after cataract extraction. The following median(lower/upper quartile) differences across the group were determined: MaxOD -33.8%(-46.2%/-19.1%), MeanOD -44.0%(-54.6%/-26.6%). Larger changes were observed in elderly patients (<70years of age: (n=25eyes) MaxOD -13.4%(-20.5%/3.6%), MeanOD -23.6%(-30.5%/-15.3%) versus patients ≥70years: (n=61eyes) MaxOD -40.5%(-53.2%/-30.1%), MeanOD -47.2%(-57.8%/-40.1%)) and in patients with progressed stage of cataract. MaxOD for lens opacification grade 1:(n=9eyes) -27.4%(-42.1%/-19.6%), 2:(n=26eyes) -35.0%(-44.2%/-25.3%), 3:(n=21eyes) -34.4%(-45.4%/-11.4%), 4:(n=25eyes) -32.6%(-53.2%/-6.4%) and 5:(n=5eyes) -53.5%(-61.7%/-38.7%) and MeanOD for cataract stage 1:(n=9eyes) -42.6%(-46.0%/-26.0%), 2:(n=26eyes) -44.1%(-51.8%/26.2%), 3:(n=21eyes) -45.7%(-54.7%/-24.7%), 4:(n=25eyes) -39.5%(-59.4%/-26.1%), 5:(n=5eyes) -57.0%(-66.1%/-51.4%). Conclusions: As established by comparison of pre- to post-operative measurements, cataract presented a strong effect on MPOD measured by one-wavelength reflection method. Particular care should therefore be taken when evaluating MPOD using this method in elderly patients with progressed stage of cataract. Future optimization of correcting parameters of scattered light and consideration of cataract influence may allow more precise evaluation of MPOD.

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Immunosenescence is considered a possible factor in the development of age-related macular degeneration and choroidal neovascularization (CNV). However, age-related changes of myeloid cells (MCs), such as microglia and macrophages, in the healthy retina or during CNV formation are illdefined. In this study, Cx3cr1-positive MCs were isolated by fluorescence-activated cell sorting from six-week (young) and two-year-old (old) Cx3cr1GFP/+ mice, both during physiological aging and laser-induced CNV development. High-throughput RNA-sequencing was performed to define the age-dependent transcriptional differences in MCs during physiological aging and CNV development, complemented by immunohistochemical characterization and the quantification of MCs, as well as CNV size measurements. These analyses revealed that myeloid cells change their transcriptional profile during both aging and CNV development. In the steady state, senescent MCs demonstrated an upregulation of factors contributing to cell proliferation and chemotaxis, such as Cxcl13 and Cxcl14, as well as the downregulation of microglial signature genes. During CNV formation, aged myeloid cells revealed a significant upregulation of angiogenic factors such as Arg1 and Lrg1 concomitant with significantly enlarged CNV and an increased accumulation of MCs in aged mice in comparison to young mice. Future studies need to clarify whether this observation is an epiphenomenon or a causal relationship to determine the role of immunosenescence in CNV formation.

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