La prévalence croissante du diabète de type II et les risques cardiovasculaires associés, sont maintenant considérés comme un enjeu majeur de santé publique. L'agrégation du polypeptide amyloïde humain des îlots (hIAPP) est liée à une dégénérescence des cel-lules β pancréatiques et à la pathogénèse du diabète de type II. Le mécanisme de la toxi-cité de hIAPP et la nature des espèces concernées (oligomères et/ou fibres) sont loin d'être élucidés, bien que de récentes études ont montré que les oligomères formés lors des étapes précoces du processus pourraient être les plus toxiques. Très peu de tech-niques permettent à l’heure actuelle de suivre cette oligomérisation en temps réel et d’évaluer des inhibiteurs de ce processus pathologique. Au cours de cette thèse, nous avons exploré la CE et l’IMS-MS comme techniques permettant de suivre l’oligomérisation de hIAPP in vitro en temps réel. Une méthode de CE a été développée, permettant d’évaluer de nouveaux inhibiteurs envers cette oligomérisation. Une méthode d’IMS-MS a également été développée pour décrire les interactions formées entre hIAPP et un inhibiteur.Des inhibiteurs peptidomimétiques ont été rationnellement conçus et syn-thétisés afin de déstabiliser les structures β formées lors de l’oligomérisation de hIAPP. L’évaluation de ces composés a permis de mettre en évidence la relation entre leurs structures et leurs activités inhibitrices. Des études de viabilité cellulaire sont en cours afin d’améliorer la compréhension de l’activité de ces molécules. / The rising prevalence of type II diabetes, and associated adverse cardiovascular risks, is now considered as a major public health challenge. The aggregation of human islet amyloid polypeptide (hIAPP) is linked to beta-cell degeneration and to the pathogenesis of type II diabetes. The mechanism of hIAPP toxicity and the species involved (oligomers and/or fibrils) are far to be elucidated, although recent studies have shown that early formed species could be the most toxic species. Very few techniques are currently available to monitor in real time this oligomerization and to evaluate inhibitors of this pathological process. During this PhD project, we investigated CE and IMS-MS as potential techniques to monitor in vitro and in real time the oligomerization of hIAPP. A CE-UV method has been developed, which allows the activity evaluation of new inhibitors. An IMS-MS method has also been developed to investigate the interactions formed between hIAPP and the inhibitors. Peptidomimetics inhibitors have been rationally designed and synthesized in order to destabilize beta-sheets structures formed during the oligomerization process of hIAPP. The evaluation of those compounds revealed a relation between their structures and their inhibitory activities. Cellular viability tests are on-going to get more insights on those molecules activity.

Nous présentons dans cette thèse une étude du comportement hydrodynamique des nanoparticules en suspension dans un ferrofluide et soumises à un gradient de champ magnétique. Le but est de caractériser la séparation magnétique, d'une suspension colloïdale, dans le cadre d'un projet de conception d'un système de traitement des eaux HGMS . Nous développons un modèle mathématique qui décrit le suivi Lagrangien des nanoparticules dans un fluide porteur. Il est basé sur la description de Fokker-Planck et la description de Langevin tout en tenant compte des interactions hydrodynamiques et magnétiques . Le modèle prend aussi en compte la géométrie des agrégats qui se forment. A partir de la simulation numérique, nous constatons que le temps de séparation dépend fortement de la taille et de la longueur des agrégats qui se forment au cours du processus de séparation. L'étude de la cinétique d'agrégation montre l'existence d'une loi d'échelle dynamique. Dans l'agrégation irréversible, des chaînes linéaires de particules se forment et leur taille moyenne évolue dans le temps avec une loi d'échelle à faible puissance. L'exposant de cette variation avec l'équation de coagulation de Smoluchowski avec un noyau homogène. En utilisant le comportement asymptotique, aux temps longs, d'une solution des équations de Smoluchowski, nous mettons en évidence un temps caractéristique de l'agrégation et nous montrons que ce temps est une variable de similarité dont dépend le temps de séparation. Nous montrons aussi que la loi d'échelle est toujours valide pour des nanoparticules dans un écoulement de Poiseuille et que la taille moyenne suit une loi de puissance en fonction du nombre de Reynolds. / We present in this thesis a study of the hydrodynamic behavior of nanoparticles suspended in a ferrofluid and subjected to a magnetic field gradient. The goal is to characterize the magnetic separation of a colloidal suspension in a project to design a water treatment system HGMS (High Gradient Magnetic Separation) that can also have other applications. We develop a mathematical model that describes the Lagrangian tracking of nanoparticles in a carrier fluid. It is based on the Fokker- Planck and Langevin descriptions while taking account of magnetic and hydrodynamic interactions between particles. The model also takes into account the geometry of the formed aggregates. From the numerical simulation, we find that the separation time depends strongly on the size and length of the aggregates formed during the separation process. The study of the kinetics of aggregation shows the existence of a regime with dynamic scaling. In the irreversible aggregation linear chains of particles are formed and their average size changes over time with a scaling law with a low power. The variation exponent of the average size of chains is consistent with the Smoluchowski coagulation equation with a homogeneous kernel. Using the asymptotic, long-time behavior, of a solution of Smoluchowski equations we highlight a characteristic time of aggregation and we show that this time is a similarity variable on which depend the separation time. We also show that the scaling law is still valid for nanoparticles in a Poiseuille flow and the average size follows a power law as a function of Reynolds number.

No description available.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

O soro de leite é o coproduto da produção de queijos e contém proteínas com excelentes propriedades nutricionais e tecnológicas. Dentre essas proteínas, as majoritárias são a β-lactoglobulina (BLG) e a α-lactalbumina (ALA). Embora o soro do leite já seja aproveitado pelas indústrias para a produção de isolados e concentrados proteicos, esses produtos consistem em uma mistura de diversas proteínas e atualmente há um grande interesse em realizar o seu fracionamento a fim de aproveitar melhor as suas propriedades individuais. Entretanto, fracionar essas proteínas é um grande desafio devido às suas massas molares próximas, e uma combinação de diferentes abordagens baseadas nas suas características se torna necessária para possibilitar uma boa separação. A ALA apresenta uma capacidade de formar agregados proteicos em meio ácido e ausência de cálcio, sendo uma estratégia interessante para combinar com processos de separação por membranas. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi realizar o fracionamento da BLG e da ALA a partir da agregação proteica combinada com processos de separação por membranas. O ajuste do pH para 4 e adição de citrato de sódio como agente complexante do íon cálcio possibilitou a formação de agregados proteicos da solução de isolado proteico do soro de leite 6 %, porém ao determinar a pressão de operação dessa solução utilizando membranas cerâmicas de microfiltração (MF) de 0,8 e 0,05 μm para reter os agregados proteicos, o fluxo de permeado foi baixo. O mesmo procedimento foi utilizado para a solução de soro do leite em pó 6 % e membrana de 0,8 μm, resultando, também, em um fluxo de permeado baixo durante a determinação da pressão de operação. Ao combinar a centrifugação com a ultrafiltração (UF), o sobrenadante, contendo a fração que não formou agregados proteicos, apresentou maiores fluxos de permeado em pH 7 e 10, e baixos fluxos em pH 3 e 4. A purificação do sobrenadante em pH 10 com membrana cerâmica de 5 kDa apresentou fluxo de permeado elevado e, quando a diafiltração foi realizada, o fluxo de permeado apresentou um comportamento ascendente e menor tendência ao fouling, variando entre 56,5 e 64,6 %. O sedimentado ressolubilizado em pH 10 também apresentou um fluxo de permeado elevado, porém com comportamento mais estável durante a diafiltração, e tendência ao fouling entre 81,4 e 84,6 %. Contudo, a agregação proteica precisa ser mais bem avaliada para separar as proteínas, bem como a retenção da membrana de 5 kDa, x a qual permitiu a passagem de parte das proteínas tanto do sobrenadante como do sedimentado ressolubilizado, sendo, ainda, verificado um pH mais elevado nos concentrados do que nos permeados e livre passagem dos demais íons mediante análise de condutividade elétrica. Os resultados demonstraram que o ajuste do pH para 10 possibilitou melhorar a performance do fluxo de permeado, provavelmente devido à menor interação proteína-proteína e proteína-membrana, além de ser uma estratégia interessante para minimizar os fatores limitantes em processos de separação por membranas. / Whey is the co-product of cheese production and contains proteins with excellent nutritional and technological properties. Among these proteins, β-lactoglobulin (BLG) and α-lactalbumin (ALA) are the main ones. Although whey is already used by industries to produce protein isolates and concentrates, these products consist of a mixture of several proteins and currently there is a great interest in their fractionation in order to take better advantage of their individual properties. However, fractionating whey proteins is a great challenge because of their similar molecular weight. Due to this, a combination of different approaches based on characteristics of each of these proteins becomes necessary to enable a good separation. ALA has the ability to form protein aggregates in an acidic media and absence of calcium, providing an interesting condition to combine with membrane separation processes. In view of this, the aim of this work was to fractionate BLG and ALA using a combination of protein aggregation procedure and membrane separation processes. Adjustment of pH to 4 and addition of sodium citrate as complexing agent of calcium ion allowed the formation of protein aggregates in whey protein isolate solution, but when microfiltration was carried out with ceramic membranes of 0.8 and 0.05 μm to retain the protein aggregates formed, permeate flux was low during the determination of the operating pressure of the process. The same procedure was used with whey powder solution and 0.8 μm membrane, also resulting in a low permeate flux when determining the operating pressure. By combining centrifugation with ultrafiltration, the supernatant containing the fraction that did not form protein aggregates showed higher permeate flux at pH 7 and 10, and lower permeate flux at pH 3 and 4. Purification of the supernatant at pH 10 with 5 kDa ceramic membrane showed high permeate flux and, when the diafiltration was performed, the permeate flux presented an upward behavior and lower fouling tendency, varying between 56.5 and 64.6 %. The resolubilized sediment at pH 10 also showed a higher permeate flux, but with a more stable behavior during diafiltration and fouling tendency between 81.4 and 84.6 %. Nevertheless, protein aggregation procedure needs to be better evaluated to separate the proteins as well as the retention of the 5 kDa membrane, which allowed passage of part of the proteins of the supernatant and the resolubilized sediment solutions and showed a higher pH in the xii concentrates than in the final permeate and free passage of the other ions evaluated by electrical conductivity analysis. The results showed that adjusting the pH to 10 allowed to improve the perfomance of permeate flux, probably due to the lower protein-protein and protein-membrane interactions, besides being an interesting strategy to minimize the limiting factors in PSM.

L'agrégation protéique induite par la surface des matériaux est un phénomène important dans la stabilité des protéines thérapeutiques. En utilisant l'insuline humaine, nous avons étudié les phénomènes agrégation en présence de surfaces neutres hydrophobes ou hydrophiles et avons montré que la nucléation a lieu sur les surfaces hydrophobes que l'on soit à pH 2.5 ou 7.3. Nous avons montré que l'énergie d'activation de la nucléation est abaissée sur surface hydrophobe. De plus, il apparait que l'agitation de la solution a des effets antagonistes. En particulier, les forces hydrodynamiques de cisaillement détachent de la surface les fibres. Par Résonance Plasmonique de Surface, spectroscopie infrarouge et microscopie à fluorescence, nous avons pu définir les étapes moléculaires ayant lieu à l'interface matériaux hydrophobe/solution. L'insuline s'adsorbe tout d'abord rapidement sur la surface, puis s'accumule lentement parallèlement à une transition de la structure α initiale vers une structure β, aboutissant à la formation de fibres amyloïdes. Par la suite, nous avons étudié le mécanisme d'action d'un peptide connu pour accélérer l'agrégation de l'insuline (LVEALYL). Ce peptide s'adsorbe de façon stable sur la surface hydrophobe en structure β et facilite l'accumulation d'insuline. De plus, il apparait que la séquence du peptide n'est pas essentielle à son action car différents peptides adoptant une structure β sur la surface sont également capables d'induire l'agrégation de l'insuline. La présence de prolines aboli cette action. Ces résultats apportent d'importantes informations sur les mécanismes moléculaires d'auto-association de l'insuline. L'hydrophobicité du matériau facilite le dépliement de l'insuline adsorbée, aboutissant à l'exposition du segment LVEALYL. Cette séquence facilite la propagation du changement de conformation vers les molécules nouvellement adsorbées. Agir contre ce phénomène pourrait permettre de stabiliser les solutions protéiques. / Material surface-induced protein aggregation is important for the stability of therapeutic proteins. Using human insulin, we first study its amyloidal aggregation on neutral hydrophobic or hydrophilic surfaces and show that nucleation takes place on the hydrophobic surfaces at both pH 2.5 and 7.3. We show that the activation energy for nucleation is lower on hydrophobic surfaces than in solution. We observed that agitating the solution has several antagonistic effects. In particular, the hydrodynamic shear stress detaches surface-borne fibrils. Using Surface Plasmon Resonance imaging, infrared spectroscopy and fluorescence microscopy we then define the sequence of molecular events that happen at the interface between hydrophobic materials and fluid phase. Insulin first adsorbs rapidly on the surface and then continues to accumulate, in parallel with an alpha-to beta-structural transition leading to amyloid fibril formation. Hereafter, we study the mechanism of action of a small peptide known to accelerate insulin aggregation (LVEALYL). This peptide stably adsorbs in β-conformation on the surface and helps accumulating insulin on the surface. Moreover, it appears that its sequence is not essential for its effectiveness, since several peptides, having a β-sheet structure on the surface, induce insulin aggregation. The presence of prolines abolishes its pro-aggregative activity. These results shed light on the molecular details of insulin self-association. The hydrophobic nature of material surfaces facilitates the unfolding of adsorbed insulin, resulting in the exposure of the LVEALYL peptide segment. This peptide promotes the propagation of conformational changes among incoming proteins. Counteracting this propagation could help stabilizing protein solutions.

O soro de leite é o coproduto da produção de queijos e contém proteínas com excelentes propriedades nutricionais e tecnológicas. Dentre essas proteínas, as majoritárias são a β-lactoglobulina (BLG) e a α-lactalbumina (ALA). Embora o soro do leite já seja aproveitado pelas indústrias para a produção de isolados e concentrados proteicos, esses produtos consistem em uma mistura de diversas proteínas e atualmente há um grande interesse em realizar o seu fracionamento a fim de aproveitar melhor as suas propriedades individuais. Entretanto, fracionar essas proteínas é um grande desafio devido às suas massas molares próximas, e uma combinação de diferentes abordagens baseadas nas suas características se torna necessária para possibilitar uma boa separação. A ALA apresenta uma capacidade de formar agregados proteicos em meio ácido e ausência de cálcio, sendo uma estratégia interessante para combinar com processos de separação por membranas. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi realizar o fracionamento da BLG e da ALA a partir da agregação proteica combinada com processos de separação por membranas. O ajuste do pH para 4 e adição de citrato de sódio como agente complexante do íon cálcio possibilitou a formação de agregados proteicos da solução de isolado proteico do soro de leite 6 %, porém ao determinar a pressão de operação dessa solução utilizando membranas cerâmicas de microfiltração (MF) de 0,8 e 0,05 μm para reter os agregados proteicos, o fluxo de permeado foi baixo. O mesmo procedimento foi utilizado para a solução de soro do leite em pó 6 % e membrana de 0,8 μm, resultando, também, em um fluxo de permeado baixo durante a determinação da pressão de operação. Ao combinar a centrifugação com a ultrafiltração (UF), o sobrenadante, contendo a fração que não formou agregados proteicos, apresentou maiores fluxos de permeado em pH 7 e 10, e baixos fluxos em pH 3 e 4. A purificação do sobrenadante em pH 10 com membrana cerâmica de 5 kDa apresentou fluxo de permeado elevado e, quando a diafiltração foi realizada, o fluxo de permeado apresentou um comportamento ascendente e menor tendência ao fouling, variando entre 56,5 e 64,6 %. O sedimentado ressolubilizado em pH 10 também apresentou um fluxo de permeado elevado, porém com comportamento mais estável durante a diafiltração, e tendência ao fouling entre 81,4 e 84,6 %. Contudo, a agregação proteica precisa ser mais bem avaliada para separar as proteínas, bem como a retenção da membrana de 5 kDa, x a qual permitiu a passagem de parte das proteínas tanto do sobrenadante como do sedimentado ressolubilizado, sendo, ainda, verificado um pH mais elevado nos concentrados do que nos permeados e livre passagem dos demais íons mediante análise de condutividade elétrica. Os resultados demonstraram que o ajuste do pH para 10 possibilitou melhorar a performance do fluxo de permeado, provavelmente devido à menor interação proteína-proteína e proteína-membrana, além de ser uma estratégia interessante para minimizar os fatores limitantes em processos de separação por membranas. / Whey is the co-product of cheese production and contains proteins with excellent nutritional and technological properties. Among these proteins, β-lactoglobulin (BLG) and α-lactalbumin (ALA) are the main ones. Although whey is already used by industries to produce protein isolates and concentrates, these products consist of a mixture of several proteins and currently there is a great interest in their fractionation in order to take better advantage of their individual properties. However, fractionating whey proteins is a great challenge because of their similar molecular weight. Due to this, a combination of different approaches based on characteristics of each of these proteins becomes necessary to enable a good separation. ALA has the ability to form protein aggregates in an acidic media and absence of calcium, providing an interesting condition to combine with membrane separation processes. In view of this, the aim of this work was to fractionate BLG and ALA using a combination of protein aggregation procedure and membrane separation processes. Adjustment of pH to 4 and addition of sodium citrate as complexing agent of calcium ion allowed the formation of protein aggregates in whey protein isolate solution, but when microfiltration was carried out with ceramic membranes of 0.8 and 0.05 μm to retain the protein aggregates formed, permeate flux was low during the determination of the operating pressure of the process. The same procedure was used with whey powder solution and 0.8 μm membrane, also resulting in a low permeate flux when determining the operating pressure. By combining centrifugation with ultrafiltration, the supernatant containing the fraction that did not form protein aggregates showed higher permeate flux at pH 7 and 10, and lower permeate flux at pH 3 and 4. Purification of the supernatant at pH 10 with 5 kDa ceramic membrane showed high permeate flux and, when the diafiltration was performed, the permeate flux presented an upward behavior and lower fouling tendency, varying between 56.5 and 64.6 %. The resolubilized sediment at pH 10 also showed a higher permeate flux, but with a more stable behavior during diafiltration and fouling tendency between 81.4 and 84.6 %. Nevertheless, protein aggregation procedure needs to be better evaluated to separate the proteins as well as the retention of the 5 kDa membrane, which allowed passage of part of the proteins of the supernatant and the resolubilized sediment solutions and showed a higher pH in the xii concentrates than in the final permeate and free passage of the other ions evaluated by electrical conductivity analysis. The results showed that adjusting the pH to 10 allowed to improve the perfomance of permeate flux, probably due to the lower protein-protein and protein-membrane interactions, besides being an interesting strategy to minimize the limiting factors in PSM.

O soro de leite é o coproduto da produção de queijos e contém proteínas com excelentes propriedades nutricionais e tecnológicas. Dentre essas proteínas, as majoritárias são a β-lactoglobulina (BLG) e a α-lactalbumina (ALA). Embora o soro do leite já seja aproveitado pelas indústrias para a produção de isolados e concentrados proteicos, esses produtos consistem em uma mistura de diversas proteínas e atualmente há um grande interesse em realizar o seu fracionamento a fim de aproveitar melhor as suas propriedades individuais. Entretanto, fracionar essas proteínas é um grande desafio devido às suas massas molares próximas, e uma combinação de diferentes abordagens baseadas nas suas características se torna necessária para possibilitar uma boa separação. A ALA apresenta uma capacidade de formar agregados proteicos em meio ácido e ausência de cálcio, sendo uma estratégia interessante para combinar com processos de separação por membranas. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi realizar o fracionamento da BLG e da ALA a partir da agregação proteica combinada com processos de separação por membranas. O ajuste do pH para 4 e adição de citrato de sódio como agente complexante do íon cálcio possibilitou a formação de agregados proteicos da solução de isolado proteico do soro de leite 6 %, porém ao determinar a pressão de operação dessa solução utilizando membranas cerâmicas de microfiltração (MF) de 0,8 e 0,05 μm para reter os agregados proteicos, o fluxo de permeado foi baixo. O mesmo procedimento foi utilizado para a solução de soro do leite em pó 6 % e membrana de 0,8 μm, resultando, também, em um fluxo de permeado baixo durante a determinação da pressão de operação. Ao combinar a centrifugação com a ultrafiltração (UF), o sobrenadante, contendo a fração que não formou agregados proteicos, apresentou maiores fluxos de permeado em pH 7 e 10, e baixos fluxos em pH 3 e 4. A purificação do sobrenadante em pH 10 com membrana cerâmica de 5 kDa apresentou fluxo de permeado elevado e, quando a diafiltração foi realizada, o fluxo de permeado apresentou um comportamento ascendente e menor tendência ao fouling, variando entre 56,5 e 64,6 %. O sedimentado ressolubilizado em pH 10 também apresentou um fluxo de permeado elevado, porém com comportamento mais estável durante a diafiltração, e tendência ao fouling entre 81,4 e 84,6 %. Contudo, a agregação proteica precisa ser mais bem avaliada para separar as proteínas, bem como a retenção da membrana de 5 kDa, x a qual permitiu a passagem de parte das proteínas tanto do sobrenadante como do sedimentado ressolubilizado, sendo, ainda, verificado um pH mais elevado nos concentrados do que nos permeados e livre passagem dos demais íons mediante análise de condutividade elétrica. Os resultados demonstraram que o ajuste do pH para 10 possibilitou melhorar a performance do fluxo de permeado, provavelmente devido à menor interação proteína-proteína e proteína-membrana, além de ser uma estratégia interessante para minimizar os fatores limitantes em processos de separação por membranas. / Whey is the co-product of cheese production and contains proteins with excellent nutritional and technological properties. Among these proteins, β-lactoglobulin (BLG) and α-lactalbumin (ALA) are the main ones. Although whey is already used by industries to produce protein isolates and concentrates, these products consist of a mixture of several proteins and currently there is a great interest in their fractionation in order to take better advantage of their individual properties. However, fractionating whey proteins is a great challenge because of their similar molecular weight. Due to this, a combination of different approaches based on characteristics of each of these proteins becomes necessary to enable a good separation. ALA has the ability to form protein aggregates in an acidic media and absence of calcium, providing an interesting condition to combine with membrane separation processes. In view of this, the aim of this work was to fractionate BLG and ALA using a combination of protein aggregation procedure and membrane separation processes. Adjustment of pH to 4 and addition of sodium citrate as complexing agent of calcium ion allowed the formation of protein aggregates in whey protein isolate solution, but when microfiltration was carried out with ceramic membranes of 0.8 and 0.05 μm to retain the protein aggregates formed, permeate flux was low during the determination of the operating pressure of the process. The same procedure was used with whey powder solution and 0.8 μm membrane, also resulting in a low permeate flux when determining the operating pressure. By combining centrifugation with ultrafiltration, the supernatant containing the fraction that did not form protein aggregates showed higher permeate flux at pH 7 and 10, and lower permeate flux at pH 3 and 4. Purification of the supernatant at pH 10 with 5 kDa ceramic membrane showed high permeate flux and, when the diafiltration was performed, the permeate flux presented an upward behavior and lower fouling tendency, varying between 56.5 and 64.6 %. The resolubilized sediment at pH 10 also showed a higher permeate flux, but with a more stable behavior during diafiltration and fouling tendency between 81.4 and 84.6 %. Nevertheless, protein aggregation procedure needs to be better evaluated to separate the proteins as well as the retention of the 5 kDa membrane, which allowed passage of part of the proteins of the supernatant and the resolubilized sediment solutions and showed a higher pH in the xii concentrates than in the final permeate and free passage of the other ions evaluated by electrical conductivity analysis. The results showed that adjusting the pH to 10 allowed to improve the perfomance of permeate flux, probably due to the lower protein-protein and protein-membrane interactions, besides being an interesting strategy to minimize the limiting factors in PSM.

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T11:46:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_SimoneCristinaBuzzo_M.pdf: 2132823 bytes, checksum: b98ccca4e06a6ca0155f84135393b9b5 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Lectinas são proteínas que se ligam de forma específica e reversível a carboidratos. Estão distribuídas pelos mais diversos organismos e apresentam atividades de interesse em pesquisas biológicas e médicas. Neste trabalho, duas isoformas de lectina da alga marinha vermelha Bryothamnion triquetrum foram purificadas por cromatografia de troca iônica seguida por uma de fase reversa. As frações foram nomeadas de BTLD1 e BTLD2 e ambas apresentaram massa molecular aparente em SDSPAGE de aproximadamente 9,0 kDa. A análise dos aminoácidos de ambas as lectinas revelaram moléculas de caráter básico e as regiões Nterminal das lectinas foram seqüenciadas e comparadas entre si e com lectinas de outras algas, apresentando grande similaridade com hypninA1, hypninA2 e BTL. Além disso, o dicroísmo circular revelou que a estrutura secundária das proteínas é predominantemente de arranjo aleatório. A lectina BTLD2, a isoforma mais abundante do extrato da alga, apresentou ação antibacteriana contra a bactéria grampositiva Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), mas não foi eficiente contra a bactéria gramnegativa Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Xap). Também foram utilizados dois modelos de fosfolipases A2, uma isolada do veneno total de Crotalus durissus cascavella que é cataliticamente ativa do tipo Asp 49 (D49), e uma outra PLA2 cataliticamente não ativa do tipo Lys49 (K49), isolada do veneno de Bothrops jararacussu, para ensaios biológicos. A atividade farmacológica e biológica de ambas as PLA2s foi significativamente afetada pela coincubação das mesmas com BTLD2. A formação de heterodímeros de BTLD2 com a PLA2 de Crotalus durissus cascavella ou com a PLA2 de Bothrops jararacussu sugere a formação de um complexo estável em solução com uma massa molecular de aproximadamente 23,0 kDa. A BTLD2 também foi capaz de aumentar significativamente a atividade enzimática da PLA2 de C. d. ascavella em comparação com a PLA2 cataliticamente ativa isolada. As PLA2s de C. d. cascavella e B. jararacussu mostraram forte atividade antibacteriana contra bactérias Cmm e tiveram pouco efeito contra a bactéria Xap. Entretanto, o complexo BTLD2: PLA2 D49 ou K49 mostram um aumento da atividade antibacteriana, principalmente contra a bactéria Xap. As PLA2s induziram atividade edematogênica em pata de ratos e também foram capazes de induzir uma forte agregação plaquetária usando o sistema de plaquetas lavadas. Em ambos os sistemas, o complexo BTLD2: PLA2 mostrou uma atividade menor do que os respectivos controles. Concluindo, os resultados apresentados mostram que esta nova lectina isolada de alga vermelha possui uma evidente capacidade de interação com moléculas de PLA2, tanto cataliticamente ativas quanto inativas, com a formação de heterodímeros. Portanto, esta interação é capaz de modificar significativamente a estrutura terciária da PLA2, uma vez que o complexo mostrou atividade enzimática aumentada além de possivelmente alterar a estrutura de outras regiões moleculares da enzima. É importante verificar que a atividade farmacológica das PLA2s não tem uma correlação direta com a atividade catalítica das mesmas, envolvendo outras regiões que permitem a sua interação com receptores cuja região está distante do sítio catalítico da PLA2 / Abstract: Lectins are proteins that bind specifically and reversibly to carbohydrates. They are widely distributed among living organisms and show many activities of biological and medical interest. In this work, two isoforms of lectins isolated from the red marine alga Bryothamnion triquetrum were purified by ion exchange followed by reverse phase chromatographies. The fractions named BTLD1 and BTLD2 showed apparent molecular mass of approximately 9.0 kDa in SDSPAGE. Both lectins probably have a basic character, as indicated the amino acid analyses using the Compute pI/Mw tool at the ExPASy server. The Nterminal sequences were compared between both lectins and also to other lectins, showing similarity with hypninA1, hypninA2 and BTL. The circular dichroism indicated that the secondary structure of the proteins are predominantly random coiled. Additionaly, BTLD2 (the more abundant lectin isoform in the alga extract) showed antibacterial activity against the grampositive bacteria Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) but was not effective against the gramnegative bacteria Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Xap). A possible modulation of phospholipase activity by BTLD2 was also studied using two phospholipases A2, one isolated from Crotalus durissus cascavella venom that is Asp49 (D49) catalytically active, and other PLA2 Lys49 (K49) catalytically non active from Bothrops jararacussu venom. The pharmacological and biological activities of PLA2s were significantly change by incubation with BTLD2. The heterodimer formation of BTLD2 with Crotalus durissus cascavella or Bothrops jararacussu PLA2s appears to be a stable complex in solution with a molecular mass of approximately 23 kDa. BTLD2 significantly increased the enzymatic activity of the PLA2 from C.d. cascavella compared to the PLA2 alone. Both PLA2s (catalytically active and nonactive) showed strong antibacterial activity against Cmm with little effect against Xap. However, the BTLD2: PLA2 D49 or K49 complexes showed increase in antibacterial activity, particularly against Xap. Moreover, both PLA2s induced edematogenic activity in rat paw and strong platelet aggregation in washed platelets system. Interestingly, addition of BTLD2 with consequent formation of the BTLD2: PLA2 complex decreased both PLA2induced edema and platelet aggregation. Taken toghether, these results show that this new lectin isolated from a red alga and named BTLD2 has the capacity to interact with catalytic or noncatalytic PLA2, forming heterodimers. Therefore, this interaction possibly modify the PLA2 tertiary structure; as the complex BTLD2: PLA2 increase the enzymatic activity of PLA2 (i.e., the phospholipase activity) but at the same time decrease pharmacological and biological PLA2 activities not related to catalysis (i.e., platelet aggregation and edema). This suggests that the PLA2 structure is possibly modified in other sites of the enzyme rather than in the catalytic site. It can be concluded that the PLA2s has several binding sites for different molecules comprising the catalytic site responsible for the phospholipase activity and at least one more pharmacological site responsible for the effects observed after interaction with BTLD2. Therefore, the pharmacological activity of PLA2s has no direct correlation with the catalytic activity, involving other binding sites that allow receptor interaction whose position might be far from the catalytic site of PLA2 / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

This work is about Hierarchical agregation and it describes its parts in the rst part of this work. Next is described its parts, main features and properties in this rst part. Document describes the possibilities of realization. Second part describes an analysis of the stability problem. Realizes the detection of failures of the Feedback target stations by the implemented protocol. The protocol is programaticly realized in JAVA language and tested in the real enviroment. In this document it is described an function of bandwidth on the speed of failure detection. The issues of detection of failure on the feedback target manager machine are discussed in this document.