Human protein C (HPC) is a vitamin-K dependent plasma glycoprotein which is one of the major components regulating anticoagulation. HPC injection is a promising therapy for several diseases but a heterologous production system would be preferred over purifying HPC from human plasma because of its low concentration (4-5 $ mu$g/ml). A cDNA clone coding for HPC was inserted downstream of the CaMV 35S promoter and of a dimer of the CaMV 35S promoter. Tobacco plants were transformed using Agrobacterium and a binary vector strategy. Kanamycin resistant plants were regenerated and enzyme linked immunosorbent assay determined that HPC, in crude plant extracts, accounted for up to 0.03% of plant soluble proteins. HPC was found to be expressed by R$ sb1$ seedlings suggesting successful integration of the T-DNA into plant genome. A partial protein purification system was developed in order to enrich the protein mixture for HPC. HPC was found to bind tightly at pH 6.0 to Fast Flow Q Sepharose resin.

In this study, optimization of a transformation and regeneration system via indirect organogenesis in cotyledonary petiole tissue of lentil (Lens culinaris Medik.) was investigated. Eight different medium types differing in their plant growth regulator compositions were employed to examine the callus induction potency of cotyledonary petiole. Except two, all other tested medium yielded more than 80% callus induction. Nine different medium types were studied to test the potencies of callus structures for shoot induction. Only the callus induced in medium H (1 mg/L Zeatin riboside + 1 mg/L Naphthalane acetic acid) yielded shoots at 8 to 40 % frequency. The most responsive medium was MS basal medium with no growth regulators. Also five and three different medium types were employed to examine callus induction potency of epicotyl tissues respectively. Each medium type yielded 90% callus induction. Only the callus induced in medium H yielded shoots At 6 to 26% frequency. Preliminary studies were carried out for somatic embryogenesis in cotyledonary petiole. Effects of salicylic acid on somatic embryogenesis were also investigated. Salicylic acid at 200&micro / M was found to enhance the percentage of somatic embryos by 25 % and reduce the necrosis 24 %. However none of the globular and heart shape embryos were able to regenerate. Transient GUS expression efficiencies of roots, shoot tips, and cotyledonary petioles were tested after Agrobacterium-mediated transformation. Transformation frequencies were 26, 74, and 38 % for cotyledonary petiole, shoot tips, and roots respectively.

Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin--Madison, 1935. / Typescript. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references (leaves 34-37).

Stuttgart, Univ., Diss., 2004.

Thesis (Ph. D.)--University of Chicago, Dept. of Chemistry, December 2000. / Includes bibliographical references. Also available on the Internet.

Techn. Universiẗat, Diss., 2003--Berlin.

Thesis (Ph.D. (Biochemistry, Microbiology & Biotechnology)) - Rhodes University, 2007.

O objetivo do presente trabalho foi otimizar o sistema de transformação genética de embriões somáticos de soja [Glycine max (L.) Merr.] utilizando a biolística e o sistema Agrobacterium de maneira integrada. Os antibióticos, adicionados ao meio de cultura para supressão da bactéria após a transferência do transgene, foram o alvo do estudo. Inicialmente, comparou-se o efeito de diferentes tratamentos com antibióticos sobre o tecido embriogênico de soja e sua eficiência na supressão da linhagem LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens durante o processo de transformação. A carbenicilina (500 mg/l) apresentou efeitos diferentes sobre o tecido vegetal das duas cultivares testadas. Os tecidos embriogênicos da cv. IAS5 não apresentaram diferenças significativas em relação ao controle, enquanto que a proliferação dos embriões somáticos da cv. Bragg foi três vezes maior com a adição deste antibiótico ao meio de cultura. Contudo, a presença da carbenicilina nas duas concentrações testadas (500 e 1000 mg/l) não foi eficiente para supressão de Agrobacterium. Por outro lado, nos tratamentos com cefotaxima sozinha (350 e 500 mg/l), ou cefotaxima (250 mg/l) + vancomicina (250 mg/l) esta bactéria foi completamente suprimida da superfície dos embriões somáticos após 49 dias de tratamento. No entanto, enquanto a presença de cefotaxima, em qualquer concentração, foi prejudicial à sobrevivência do tecido embriogênico, a combinação de cefotaxima + vancomicina não afetou significativamente os embriões somáticos de soja até os 63 dias de tratamento. Portanto, os resultados indicam que o tratamento com cefotaxima + vancomicina por um período de 49 - 63 dias é o mais adequado para a transformação genética de soja, por suprimir Agrobacterium e apresentar mínimos efeitos sobre o tecido embriogênico. Por fim, conjuntos de embriões somáticos de soja foram transformados e tratados com a combinação recomendada de antibióticos para avaliação da eficiência do método na obtenção de transformantes estáveis. Foram obtidos 48 e 232 clones higromicina-resistentes para Bragg e IAS5, respectivamente. Para cv. Bragg, 26 plantas foram obtidas de um único clone, enquanto 580 plantas foram regeneradas de 105 clones da cv. IAS5. As plantas transgênicas eram férteis e morfologicamente normais. A presença do transgene no genoma destas plantas foi confirmada por análises moleculares. Portanto, a adequação dos antibióticos permitiu o desenvolvimento de um método de transformação altamente eficiente para soja. Os resultados do presente trabalho constituem o primeiro registro (1) do efeito de antibióticos sobre tecidos de soja ou de leguminosas e (2) de obtenção de transformantes estáveis de soja utilizando a biolística e o sistema Agrobacterium de maneira integrada.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-02T14:57:17Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 287684 bytes, checksum: c5eb42af7676e85b16363c3edd753449 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-02T14:57:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 287684 bytes, checksum: c5eb42af7676e85b16363c3edd753449 (MD5) Previous issue date: 2004-02-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A transformação genética está se tornando, cada vez mais, uma ferramenta importante em programas de melhoramento genético de diversas espécies, sendo uma alternativa para a incorporação de gene(s) exógeno(s) no genoma da planta, modificando características de interesse. Para citros, essa ferramenta permite romper barreiras naturais dessa espécie, visto que o desenvolvimento de novas variedades pelo melhoramento convencional possui uma série de limitações impostas pela sua biologia reprodutiva. Entretanto, os protocolos de transformação genética requerem, primariamente, o estabelecimento de um eficiente sistema de morfogênese in vitro para que o sucesso do método de transformação seja alcançado. Portanto, o objetivo deste trabalho foi o estabelecimento das melhores condições de cultivo in vitro para a organogênese e a posterior adequação de uma metodologia eficiente de transformação genética para a variedade de laranja-doce [Citrus sinensis (L.) Osb.] ‘Pêra’. Na avaliação das melhores condições da organogênese in vitro, segmentos de epicótilos foram introduzidos em meio de cultura MT contendo diferentes concentrações de BAP. A concentração de 1,0 mg L -1 de BAP utilizada na fase de indução de brotações assegurou as melhores freqüências de organogênese. Foram também estudados fatores que possam influenciar o processo de transformação genética de citros via Agrobacterium tumefaciens, utilizando epicótilos de laranja ‘Pêra’ como fonte de explante. Os fatores testados foram: tempo de inoculação com Agrobacterium, o período de co-cultivo e a presença de auxina no meio de pré-cultivo. O protocolo otimizado para a transformação genética de laranja ‘Pêra’ foi a imersão do explante em uma solução contendo Agrobacterium, por um tempo de 5 minutos, seguido de um período de co-cultivo de 2 dias em meio de cultura contendo 100 μM de acetoseringona e transferidos para o meio de seleção, constituído do meio MT e ainda de 75 mg L -1 de canamicina, 500 mg L -1 de Timetin ® e 1 mg L -1 de BAP. / Genetic transformation is a technique whose importance is increasing as an important tool for breeding programs of several species, being a reliable alternative for introducing characteristics of interest. For citrus, this tool helps to overcome natural reproductive barriers, the obtention of new cultivars by conventional breeding methods has several constraints, mainly linked to its reproductive biology. However, genetic transformation protocols demand, primarily, the establishment of efficient regeneration systems, in order to guarantee the success of transformation method. The objective of the present work was to establish promotive conditions for a reliable in vitro regeneration system from epicotyl explants, and further adequate an efficient and reproducinle transformation methodology for a sweet orange variety [Citrus sinensis L. (Osb.) ‘Pêra’]. For organogenesis, epicotyl explants were cultured onto a MT medium containing different BAP concentrations. For induction phase, 1.0 mg L -1 BAP enabled higher regeneration frequencies of adventitious shoots. Also, factors affecting Agrobacterium-mediated transformation efficiency were tested, as follows: incubation period with bacteria, co-culture period, and the presence of auxin in the pre-culture step. The following conditions generated and optimized protocol for ‘Pêra’ transformation: immersion for 5 minutes of the explants in a diluted Agrobacterium suspension; a 2-days co-culture period in a 100 μM acetoseryngone-supplemented medium; transfer for a selective regeneration MT-based medium, supplemented with 1.0 mg L -1 BAP, 75 mg L -1 kanamycin, and 500 mg L -1 Timentin ® .

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-04-16T17:30:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1704498 bytes, checksum: bd9361caa999676067e272268f557a68 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-16T17:30:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1704498 bytes, checksum: bd9361caa999676067e272268f557a68 (MD5) Previous issue date: 2015-07-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O milho é uma das principais culturas do Brasil e hoje os estudos de transformação genética de plantas estão sendo utilizados como estratégia para obtenção de materiais com resistência a pragas e doenças, tolerância a herbicidas e melhoria na qualidade nutricional. Assim, objetivou-se avaliar meios de cultivo na embriogênese somática de embriões imaturos de milho tropical, estudar metodologias de transformação genética de milho tropical, avaliar promotores de floema PP2 na transformação de milho, avaliar promotores de fruto PCaLTP-S, constitutivo PSulfT0,5, de folha PCit0,4, de senescência PSAG12-like, na transformação genética de milho. Foram conduzidos quatro experimentos em laboratório. Os materiais utilizados foram a linhagem elite L3 de clima tropical para avaliar meios de cultivo na embriogênese somática e na transformação de milho tropical, e o híbrido Hi-II de clima temperado, para os experimentos de avaliação de promotores. Os resultados indicaram que para a embriogênese somática, o meio de cultivo mais eficiente na produção de calos embriogênicos foi o meio M1 (Meio basal N6, 30 g L -1 de sacarose, 100 mg L -1 de caseína hidrolisada, 100 mg L -1 de mio inositol; 2,9 g L -1 de L-prolina e; 15 mg L -1 de nitrato de prata). Para a maturação dos calos embriogênicos, o tratamento sem reguladores de crescimento com adição de CuSO 4 possibilitou maior porcentagem de regeneração. O protocolo desenvolvido apresentou produção de 85% de calos embriogênicos e 45% de plantas regeneradas, podendo, dessa forma, ser utilizado para a produção de plantas transgênicas de milho. A metodologia mais indicada para a transformação genética de milho tropical, foi o método I, visto que a utilização de meios de co-cultivo e repouso com maior concentração de sais foi benéfico para a transferência do T-DNA. Adicionalmente, os resultados indicam que a suplementação do meio de co-cultivo com apenas um antioxidante, a cisteína, é suficiente para a recuperação de células transformadas. No estudo dos promotores de floema em milho, foi gerada uma construção com promotor PP2 heterólogo de milho isolado de uma Cucurbitácea. O promotor PP2 isolado de abóbora dirigiu a expressão do gene repórter gus para o sistema vascular em milho, revelando que pode ser utilizado em estudos futuros de transformação genética de milho. Nas análises de PCR quantitativo dos promotores heterólogos PCaLTP-S, PSulfT0,5, PCit0,4, PSAG12-like, a expressão foi detectada nos tecidos de folha e raiz. Novos estudos devem ser realizados para comprovar a funcionalidade desses promotores heterólogos no milho. / Maize is an important crop in Brazil and today the genetic transformation studies of plants are being used as a strategy to obtain materials with resistance to pests and diseases, herbicide tolerance and improved nutritional quality. Thus aimed to evaluate culture media in somatic embryogenesis of immature embryos of tropical maize, studying methods of genetic transformation of tropical maize, evaluate the phloem promoters PP2 in transforming maize, evaluate promoters PCaLTP-S fruit, PSulfT0,5 constitutive, PCit0,4 leaf and PSAG12-like senescence in genetic transformation of maize. Four experiments were conducted in the laboratory. The materials used were the tropical climate L3 elite line to evaluate culture media in somatic embryogenesis and transformation of tropical maize, and Hi-II hybrid temperate climate for promoters of evaluation experiments. The results indicated that for somatic embryogenesis, the most efficient means of cultivation in the production of embryogenic callus was the M1 medium (N6 basal medium, 30 g L -1 sucrose 100 mg L -1 casein hydrolyzate, 100 mg L - 1 myo-inositol, 2.9 g L -1 L-proline and 15 mg L -1 of silver nitrate). For the maturation of somatic embryogenesis, treatment without growth regulators with the addition of CuSO 4 allowed higher percentage of regeneration. The presented protocol developed production of 85% of embryogenic callus and 45% of regenerated plants and may thus be used for the production of transgenic maize plants. The most suitable method for the genetic transformation of tropical maize was the method I, since the use of means of co- cultivation and resting with a higher salt concentration is beneficial to the transfer of T- DNA. Additionally, the results indicated that supplementation of co-cultivation medium with only the antioxidant cysteine is sufficient to recover transformed cells. In the study of phloem promoters in maize, a construct was generated with PP2 heterologous promoter isolated from a cucurbit. The PP2 pumpkin isolated promoter directed the expression of the GUS reporter gene to the vascular system in maize, revealing that can be used in future studies of genetic transformation of maize. In the quantitative PCR analysis of heterologous promoters PCaLTP-S PSulfT0,5, PCit0,4, PSAG12-like expression was detected in leaf and root tissues. Further studies should be conducted to verify the functionality of these heterologous promoters in maize.