A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani. / Plant resistance in transgenic plants has been obtained by expressing genes isolated from bacteria, mycoparasitic fungi and plants. Here we report the employment of a gene from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae as a tool to generate resistance to fungal diseases in plants. The chit1 gene encodes the chitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), belonging to a class of glicosyl-hydrolases able to convert chitin into N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) oligomers. When present in plant tissues, chitinases are supposed to disrupt the invading fungal cell wall specifically, causing hyphae damage and leading to cell lysis. Hence two different groups of transgenic Nicotiana tabacum plants were produced. The first group was named chitplus, in which individuals harbour the chit1 gene under the control of the CaMV 35S promoter . The second group, named chitless, carried a T-DNA not containing the fungal gene. Thirty-four kanamicin resistant plants (17 of each group) were regenerated from leaf discs infected with Agrobacterium tumefaciens. Chitinase production in leaf protein extracts was analysed through zymograms in SDS-PAGE containing glycol-chitin and stained by calcofluor white, as a screening of primary transformants. Transgenic plants were also evaluated by colorimetric assays using synthetic GlcNAc oligomers as specific substrates besides immunoblot and Western blot probed with rabbit anti-chitinase sera. The amount of recombinant enzyme in chitplus plants ranged from no detectable chitinase activity to high levels of enzyme expression. Southern blot hybridisation revealed that chit1 copy number inserted into plant genomes varied from one to four. The first self pollinated generation of transgenic lines bearing two copies of the transgene was tested on inheritance stability and in 43 out of 67 descendants, derived from four independent crosses, the segregation pattern was discovered not to differ from the predicted Mendelian ratios. Resistance assays challenging transgenic plants with the basidiomycete Rhizoctonia solani were performed and a clear decrease in the foliar area containing fungal lesions was observed amongst transgenic lines, though variations in chitinase activity also reflected on the resistance level. Our results suggest a direct relationship between chitinase specific activity and the improvement in the resistance to lesions caused by infection.

A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani. / Plant resistance in transgenic plants has been obtained by expressing genes isolated from bacteria, mycoparasitic fungi and plants. Here we report the employment of a gene from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae as a tool to generate resistance to fungal diseases in plants. The chit1 gene encodes the chitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), belonging to a class of glicosyl-hydrolases able to convert chitin into N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) oligomers. When present in plant tissues, chitinases are supposed to disrupt the invading fungal cell wall specifically, causing hyphae damage and leading to cell lysis. Hence two different groups of transgenic Nicotiana tabacum plants were produced. The first group was named chitplus, in which individuals harbour the chit1 gene under the control of the CaMV 35S promoter . The second group, named chitless, carried a T-DNA not containing the fungal gene. Thirty-four kanamicin resistant plants (17 of each group) were regenerated from leaf discs infected with Agrobacterium tumefaciens. Chitinase production in leaf protein extracts was analysed through zymograms in SDS-PAGE containing glycol-chitin and stained by calcofluor white, as a screening of primary transformants. Transgenic plants were also evaluated by colorimetric assays using synthetic GlcNAc oligomers as specific substrates besides immunoblot and Western blot probed with rabbit anti-chitinase sera. The amount of recombinant enzyme in chitplus plants ranged from no detectable chitinase activity to high levels of enzyme expression. Southern blot hybridisation revealed that chit1 copy number inserted into plant genomes varied from one to four. The first self pollinated generation of transgenic lines bearing two copies of the transgene was tested on inheritance stability and in 43 out of 67 descendants, derived from four independent crosses, the segregation pattern was discovered not to differ from the predicted Mendelian ratios. Resistance assays challenging transgenic plants with the basidiomycete Rhizoctonia solani were performed and a clear decrease in the foliar area containing fungal lesions was observed amongst transgenic lines, though variations in chitinase activity also reflected on the resistance level. Our results suggest a direct relationship between chitinase specific activity and the improvement in the resistance to lesions caused by infection.

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A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani. / Plant resistance in transgenic plants has been obtained by expressing genes isolated from bacteria, mycoparasitic fungi and plants. Here we report the employment of a gene from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae as a tool to generate resistance to fungal diseases in plants. The chit1 gene encodes the chitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), belonging to a class of glicosyl-hydrolases able to convert chitin into N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) oligomers. When present in plant tissues, chitinases are supposed to disrupt the invading fungal cell wall specifically, causing hyphae damage and leading to cell lysis. Hence two different groups of transgenic Nicotiana tabacum plants were produced. The first group was named chitplus, in which individuals harbour the chit1 gene under the control of the CaMV 35S promoter . The second group, named chitless, carried a T-DNA not containing the fungal gene. Thirty-four kanamicin resistant plants (17 of each group) were regenerated from leaf discs infected with Agrobacterium tumefaciens. Chitinase production in leaf protein extracts was analysed through zymograms in SDS-PAGE containing glycol-chitin and stained by calcofluor white, as a screening of primary transformants. Transgenic plants were also evaluated by colorimetric assays using synthetic GlcNAc oligomers as specific substrates besides immunoblot and Western blot probed with rabbit anti-chitinase sera. The amount of recombinant enzyme in chitplus plants ranged from no detectable chitinase activity to high levels of enzyme expression. Southern blot hybridisation revealed that chit1 copy number inserted into plant genomes varied from one to four. The first self pollinated generation of transgenic lines bearing two copies of the transgene was tested on inheritance stability and in 43 out of 67 descendants, derived from four independent crosses, the segregation pattern was discovered not to differ from the predicted Mendelian ratios. Resistance assays challenging transgenic plants with the basidiomycete Rhizoctonia solani were performed and a clear decrease in the foliar area containing fungal lesions was observed amongst transgenic lines, though variations in chitinase activity also reflected on the resistance level. Our results suggest a direct relationship between chitinase specific activity and the improvement in the resistance to lesions caused by infection.

Hemp (Cannabis sativa L.) is a multi-use crop, able to provide fibre celulose a hurds for industrial treatment seeds for oil preparation biomass for energy conversion and produces secondary metabolites useful for pharmaceutical application. For its resistence to stress ability to accumulate high concentration of heavy metals and low cultivations demands, it can also be used for phytoextractions. Current research is focused on establishment of cultivation protocol, which allows transformation of callus cultures, and their regeneration with high efficiency. In this thesis, several varieties of hemp were transferred to in vitro conditions and were tested for their ability to form callus. The best results were achieved using the hypocotyl segments in a nutrient medium supplemented with 1 mg/L of naphtylacetic acid and one of these two synthetic cytokinins 0,5 mg/L of thidiazuron or 5 mg/L of 6-benzylaminopurine. No significant difference in the use of these two cytokinins were observed. None of the explants on four different test media for regeneration of shoots were able to succesfully regenerate. Transformation of hemp was tested using two different methods. Transformed protoplasts from hemp leafs after agroinfiltration were isolated. This method turn out to be unsuitable for use with hemp due to its...

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[EN] The knowledge of the key genes which crucially affect the development and stress tolerance of plants is a very important task and indispensable for both, the basic and the applied research. The screening of populations of mutagenized plants permits the identification of mutants and, starting with their analysis, the identification of the genes responsible for a certain trait. Compared to alternative methods (e.g. chemical or physical mutagens) the insertional mutagenesis using T-DNA offers the additional advantage of labeling the altered gene with a piece of known sequence that will facilitate its identification and cloning. On the other hand, the tomato is one of the world¿s economically most important vegetables which over the last few years also gained the status of a model organism for certain traits. In order to identify the relevant genes involved in the response of plants to abiotic stresses and processes related to the vegetative and reproductive development, our laboratory performs in collaboration with Dr. Lozano¿s (University of Almería) and Dr- Bolarín¿s (CEBAS-Murcia) groups a project of insertional mutagenesis in tomato and related wild species, among them Solanum pennellii. The present PhD-thesis is embedded in this context and aims to create a collection of transgenic plants of S. pennellii, design new methods helpful for evaluating the tolerance to salt stress, the identification of traits related to water or salt stress and screen several lines of S. lycopersicum which were pre-selected for showing different aberrations that could be related to the tolerance to abiotic stresses. By tackling these tasks it was possible to obtain the following results. After obtaining more than two thousand diploid transgenic lines of S. pennellii, 887 of them were screened with the different systems developed for detecting mutant plants. Two of the methods designed were based on in vitro culture and one for the short-term evaluation in vivo. With the latter one a total of 68 tomato lines were screened and among them a mutant with alterations in its development which could be interesting for its relation to abiotic stress tolerance identified. In the collection of S. pennellii several plants showing phenotypes with different alterations were detected. Three of them received an advanced examination and it was possible to identify and clone the affected gene in one case. The detected mutants as much as the developed technologies are of great value for deepening the understanding of the processes related to abiotic stress tolerance in a crop with the outstanding importance of the tomato. / [ES] El conocimiento de los genes clave que afectan al desarrollo de las plantas y su tolerancia a estreses abióticos es un aspecto muy importante, tanto desde un punto de vista básico como aplicado. El escrutinio de poblaciones de plantas mutagenizadas permite la identificación de mutantes y, a partir de ellos, conocer los genes responsables de un carácter concreto. Cuando se compara con otras alternativas metodológicas (mutágenos químicos o físicos) la mutagénesis insercional con T-DNA aporta una ventaja adicional, ya que si el gen queda etiquetado por un fragmento de ADN de secuencia conocida su identificación y clonación es más sencilla. Por otro lado, el tomate es una de las especies con mayor importancia económica a nivel mundial que, en los últimos tiempos, se ha considerado también como especie modelo para el estudio de determinados caracteres. Para lograr la identificación de genes clave en la respuesta de las plantas a los estreses de tipo abiótico y en procesos del desarrollo tanto vegetativo como reproductivo, en nuestro laboratorio se está abordando, en colaboración con los grupos del Dr. Lozano (Universidad de Almería) y de la Dra. Bolarín (CEBAS - Murcia), un proyecto de mutagénesis insercional con tomate y especies silvestres relacionadas, entre ellas Solanum pennellii. La tesis doctoral presente se enmarca en este contexto y tiene como objetivos la creación de una colección de plantas transgénicas de S. pennellii, el diseño de nuevos métodos aptos para evaluar la tolerancia al estrés salino, la identificación de caracteres relacionados con el estrés hídrico o salino y el escrutinio de algunas líneas de S. lycopersicum pre-seleccionadas por mostrar diferentes alteraciones que puedan estar relacionadas con la tolerancia a estreses de tipo abiótico. Tras abordar estos objetivos se han obtenido los siguientes resultados. Tras obtener más de dos mil líneas transgénicas diploides de Solanum pennellii se han evaluado 887 líneas con los diferentes sistemas de identificación de mutantes diseñados. Dos de los métodos de evaluación diseñados se basaron en el cultivo in vitro y uno en un sistema de cultivo in vivo a corto plazo. Además, con esta última metodología se evaluaron 68 líneas de tomate entre las que se identificó un mutante de desarrollo de elevado interés por su relación con la tolerancia a estreses abióticos. Entre las líneas de Solanum pennellii analizadas se han identificado fenotipos con distintas alteraciones. En tres de estas líneas se llevó a cabo una evaluación más avanzada llegando a identificar y clonar el gen afectado en una de ellas. Tanto los mutantes identificados como las metodologías desarrolladas son de gran valor para seguir profundizando en los procesos relacionados con la tolerancia a estreses abióticos en una especie tan importante como el tomate. / [CA] El coneixement dels gens clau que afecten al desenvolupament de les plantes i la seua tolerància a estressos abiòtics és un aspecte molt important, des d'un punt de vista bàsic com a aplicat. L'escrutini de poblacions mutagenitzades de plantes permet la identificació de mutants i a partir d'ells conèixer els gens d'un caràcter concret. Quan es compara amb altres alternatives metodològiques (mutàgens físics o químics) la mutagènesi amb T-DNA aporta un avantatge addicional, ja que al tindre el gen un fragment etiquetat pel T-DNA de seqüència coneguda la seua identificació i clonació és més senzilla. D'altra banda, la tomaca és una de las espècies de major importància econòmica a nivell mundial que, en els últims temps, s'ha considerat també una espècie model per a l'estudi de determinats caràcters. Per a aconseguir la identificació de gens clau en la resposta de les plantes a estressos abiòtics i processos de desenvolupament tant vegetatiu com reproductiu, en el nostre laboratori s'està abordant amb col·laboració amb els grups del Dr. Lozano (Universitat d'Almeria) i la Dra. Bolarín (CEBAS-Murcia), un projecte de mutagènesi insercional amb tomaca i espècies silvestres relacionades, entre elles Solanum pennellii. La tesi doctoral s'emmarca en aquest context i té com a objectius la creació d'una col·lecció de plantes transgèniques de Solanum pennellii, el disseny de nous mètodes aptes per a avaluar la tolerància a l'estrès salí, la identificació de caràcters relacionats amb l'estrès hídric i salí, l'escrutini d'algunes línies de S. lycopersicum pre-seleccionades per mostrar diferents alteracions que puguen estar relacionades amb la tolerància a estressos de tipus abiòtic. En abordar estos objectius s'han obtingut els següents resultats. Després d'obtindre més de dos mil línies transgèniques diploides de Solanum pennellii s'han avaluat 821 línies amb els diferents sistemes d'identificació de mutants dissenyats. Dos dels mètodes d'avaluació dissenyats es basaren en el cultiu in vitro i un en un sistema de cultiu in vivo a curt termini. A més, amb aquesta última metodologia s'avaluaren 68 línies de tomaca entre les quals s'identificà un mutant de desenvolupament d'elevat interès per la seua relació amb la tolerància a estressos abiòtics. Entre les línies de Solanum pennellii analitzades s'han identificat fenotipus amb diferents alteracions. En tres d'estes línies es va dura a terme una avaluació més avançada arribant a identificar el gen afectat en una de les línies. Tant els mutants identificats com les metodologies desenvolupades són de gran valor per a seguir aprofundint en els processos relacionats amb la tolerància a estressos abiòtics en una espècie tan important como la tomaca. / Schleicher, P. (2017). Mutagenesis insercional en tomate y Solanum pennellii: Identificación de mutantes en inserción alterados en el desarrollo y la tolerancia a la salinidad [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/81860

Cucumber is one of the most important horticultural species at economic level. Despite its agronomic relevance, there is currently no efficient transformation method available. The problems to obtain transgenic cucumber plants are mainly due to the low morphogenetic response in explants of certain genotypes, poor adequacy of selection methods, decrease in regeneration rate as a consequence of the usual treatments in a transformation experiment and, above all, the high rate of 'escape' plants. Taking into account the existing problems, the first objective of the present work has been the evaluation of the morphogenetic response in cucumber explants and the development of regeneration methods potentially useful in transformation experiments. These studies have been carried out with two commercial cultivars, four pure lines and one line that has been frequently used in cucumber breeding programs. Different types of primary explants have been evaluated to determine which may be the most suitable in a transformation experiment. The influence of the ontogenic state of the seedling on the degree of myxoploidy in cotyledon explants has been studied. Likewise, the ploidy level of regenerated plants from these explants has been determined. Regarding the culture medium, the effect of growth regulators, as well as that of other components, such as silver nitrate or copper sulphate, has been studied. In the context of the second objective, studies on the different stages of the transformation process by co-cultivation of cucumber explants with Agrobacterium tumefaciens have been carried out. Several factors, such as the Agrobacterium strain, how to carry out the phases of inoculation and co-culture, the suitability of different marker genes in the selection process and the influence of different components of the culture medium have been analyzed. Attempts have also been made to infer the causes of the occurrence of 'escape' plants or the formation of chimeras in cucumber transformation experiments. Finally, based on the results obtained, some solutions that could help to avoid this problem in future experiments are proposed. / El pepino es una de las especies hortícolas más importantes a nivel económico. Pese a su relevancia agronómica, no puede decirse que a día de hoy se disponga de un método de transformación adecuado. Los problemas a la hora de conseguir plantas transgénicas de pepino estriban en la baja respuesta morfogenética en explantes de ciertos genotipos, la escasa adecuación de los métodos de selección, el descenso en la tasa de regeneración debido a los tratamientos habituales en un experimento de transformación y, sobre todo, la alta tasa de escapes. En función de la problemática existente, el primer objetivo del presente trabajo ha sido la evaluación de la respuesta morfogenética en explantes de pepino y el desarrollo de métodos de regeneración potencialmente útiles en experimentos de transformación. Estos estudios se han llevado a cabo con dos cultivares comerciales, cuatro líneas puras y una línea que ha sido utilizada frecuentemente en programas de mejora genética de pepino. Se han empleado distintos tipos de explantes primarios para determinar cuál o cuáles pueden ser los más adecuados en un experimento de transformación. Se ha estudiado la influencia del estado ontogénico de la plántula sobre el grado de mixoploidía en explantes de cotiledón. Asimismo, se ha determinado el nivel de ploidía de las plantas regeneradas a partir de estos explantes. Por lo que respecta al medio de cultivo, además de estudiar el efecto de componentes habituales (e.g. reguladores del crecimiento) se ha evaluado el de otros que no lo son tanto, como el nitrato de plata o el sulfato de cobre. En el contexto del segundo objetivo se han realizado una serie de estudios sobre las etapas del proceso de transformación mediante co-cultivo de explantes de pepino con Agrobacterium tumefaciens. Se han analizado diversos factores, tales como la cepa de Agrobacterium, la forma de llevar a cabo las fases de inoculación y co-cultivo, la adecuación de distintos genes marcadores en el proceso de selección y la influencia de distintos componentes del medio de cultivo. Asimismo, se han tratado de inferir las causas que generan la aparición de escapes o de quimeras en experimentos de transformación de pepino. Por último, sobre la base de los resultados obtenidos, se proponen algunas soluciones que podrían ayudar a evitar este problema en futuros experimentos. / El cogombre és una de les espècies hortícoles més importants a nivell econòmic. A pesar de la seua rellevància agronòmica, no pot dir-se que a hores d'ara es dispose d'un mètode de transformació adequat. Els problemes a l'hora d'aconseguir plantes transgèniques de cogombre consistixen en la baixa resposta morfogenètica en explants de certs genotips, l'escassa adequació dels mètodes de selecció, el descens en la taxa de regeneració degut als tractaments habituals en un experiment de transformació i, sobretot, l'alta taxa de fugues. En funció de la problemàtica existent, el primer objectiu del present treball ha sigut l'avaluació de la resposta en explants de cogombre i el desenvolupament de mètodes de regeneració potencialment útils en experiments de transformació. Estos estudis s'han dut a terme amb dos cultivars comercials de cogombre, tres línies pures i una línia que ha servit de base en programes de millora. S'han empleat distints tipus d'explants primaris per a determinar quin o quins poden ser els més adequats en un experiment de transformació. Pel que fa al mig de cultiu, a més d'estudiar l'efecte de components habituals (e.g. reguladors del creixement) s'ha avaluat el d'altres que no ho són tant, com el nitrat de planta o el sulfat de coure. Així mateix, s'ha analitzat el grau de mixoploidia en alguns explants i l'efecte de certs tractaments sobre el nivell de ploidia de les plantes regenerades. En el context del segon objectiu s'han realitzat una sèrie d'estudis sobre les etapes del procés de transformació per mitjà de co-cultiu d'explants de cogombre amb Agrobacterium tumefaciens. S'han analitzat diversos factors, com ara el cep d'Agrobacterium, la forma de dur a terme les fases d'inoculació i co-cultiu, l'adequació de distints gens marcadors en el procés de selecció i la influència de distints components del mig de cultiu. Així mateix, s'han tractat d'inferir les causes que generen l'aparició de plantes no transgèniques (escape plants) o de quimeres en experiments de transformació de cogombre. Finalment, sobre la base dels resultats obtinguts es plantegen algunes solucions que ajuden a evitar estos problemes en futurs experiments. / Fonseca Miguel, JA. (2017). Estudios sobre regeneración y transformación genética en pepino (Cucumis sativus L) vía Agrobacterium tumefaciens [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90405

Pseudozyma flocculosa is a biological control agent related to anamorphs of the Ustilaginales. Its mode of action against powdery mildew fimgi is antibiosis, and the metabolite flocculosin is believed to be a key factor in its biocontrol properties. In order to identify genes involved in the control of these properties, random insertional mutagenesis had previously been attempted, but a genetic transformation method yielding single genomic insertions was required. To this end, genetic transformation by Agrobacterium tumefaciens was optimized in the related species P. antarctica, in the hope of eventually adapting this method to P. flocculosa. However, the type of genomic insertions obtained in P. antarctica differed from expectations, and thus the emphasis was rather placed on identification of specific genes. To this end, we searched for homologs of genes identified in Ustilago maydis as involved in the biosynthesis of ustilagic acid, a molecule of very similar chemical structure to flocculosin. Homologs of U. maydis cypl, catalyzing the terminal hydroxylation of palmitic acid prior to its incorporation to the cellobiose via a Oglycosidic bond, were isolated and sequenced in P. flocculosa and P. fusiformata. Furthermore, a homolog of U. maydis uatl, involved in acetylation of ustilagic acid, was partially sequenced from P. flocculosa. Ail three newly sequenced genes showed strong séquence similarity to their counterparts in U. maydis. Cypl expression followed a similar pattern of down-regulation when P. flocculosa was actively growing in vitro and in vivo, thereby suggesting that the molecule was preferentially synthesized early in the process of searching for a growth substrate. Also, an attempt was made to generate a P. flocculosa knockout mutant of cypl, although no transformant obtained showed disruption of the cypl genomic locus. This study provides the first évidence of genes potentially involved in the production of flocculosin, a molecule associated with the biocontrol properties of P. flocculosa. / Pseudozyma flocculosa est un agent de lutte biologique contre le blanc des cultures apparenté aux anamorphes des Ustilaginales. Son mode d'action contre le blanc est l'antibiose, et la flocculosine serait la molécule antifongique lui conférant cette action. Dans le but d'identifier des gènes impliqués dans le contrôle de l'antibiose, des essais de mutagenèse insertionnelle aléatoire avaient déjà été entrepris. Afin de faciliter ces travaux, une méthodologie de transformation génétique générant des insertions uniques devait être mise au point. Dans ce but, la transformation génétique par Agrobacterium iumefaciens a été appliquée chez l'espèce voisine P. antarcîica dans le but éventuel de pouvoir l'adapter à P. flocculosa. Toutefois, le type d'insertions obtenues dans le génome ne correspondait pas aux attentes chez P. antarcîica. L'approche a ainsi été redirigée vers l'identification de gènes spécifiques, dont les homologues caractérisés chez Ustilago maydis sont impliqués dans la synthèse de l'acide ustilagique, une molécule dont la structure chimique est très similaire à celle de la flocculosine. Des homologues du gène cypl d'U. maydis, dont le produit serait impliqué dans l'hydroxylation terminale de l'acide palmitique avant son incorporation au cellobioside via un lien O-glycoside, ont été isolés et séquences chez P. flocculosa et P. fusiformata. De plus, un homologue du gène uatl d'U. maydis, dont le produit serait impliqué dans l'acétylation de la molécule, a été partiellement séquence chez P. flocculosa. L'expression de cypl a montré un patron de sous-expression similaire lorsque P. flocculosa était en croissance active in vitro et in vivo, suggérant donc que la flocculosine est synthétisée principalement au début du processus de recherche d'un nouveau substrat de croissance. Par ailleurs, un essai de génération d'un mutant de P. flocculosa contenant une délétion du gène cypl a été effectué, mais le locus génomique cypl était intact chez tous les transformants obtenus. Cette étude représente la première découverte de gènes dont les produits sont potentiellement impliqués dans la production de la flocculosine, une molécule associée au potentiel de lutte biologique de P. flocculosa.