[EN] Alfalfa (Medicago sativa L.), is a forage legume with a significant content of protein, being the most widely cultivated forage around the world. In this species, the protein content decreased during growth processes as well as other resources used by the plant during the flowering process. Alfalfa also contains a lower concentration of condensed tannins or proanthocyanidins (PAs), less than required to remedy the digestive disorder of ruminant livestock causing pasture bloat by production of greenhouse gases as result of the microbial fermentation and the excessive desamination of proteins in the rumen (by-pass effect). These defects on nutrition are reflected in the yield and production of ruminants. Both problematics are difficult to improve by conventional methods. The overall objective of this thesis is to develop molecular tools useful for genetic manipulation of certain traits of agronomic interest in alfalfa, to enhance their nutritional value. At a first step, we have developed an Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation protocol via somatic embryogenesis applicable to various genotypes of alfalfa to produce viable embryos in the 50% of the inoculated explants. Chimaeric plants or scapes were almost not detected because most of the transgenic plants contained the T-DNA with all the transgenes incorporated, having thus the indispensable tool to perform the other two objectives. We have isolated two orthologs of the TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) gene from alfalfa (MsTFL1c and MsTFL1a). Both genes were constitutively expressed in A. thaliana, and later on in alfalfa, to evaluate their possible use as biotechnological tool for the improvement of the nutritional value of this forage legume, producing a delay in the flowering time and thereby an increase of vegetative development. MsTFL1a performs the same functions as TFL1 in Arabidopsis y its overexpression in this plant produces a remarkable delay of flowering time. In alfalfa, its constitutive expression also produces a delay in flowering. However, this phenotype was not associated to an increase of vegetative growth, being plants of reduced size that appears tied to a limitation in cell proliferation. Moreover, the limitation in cell proliferation was associated with a reduction in the expression levels of certain cell division effector genes, as it is the case of cyclins. Our results support the hypothesis that TFL1-like genes could also participate in signaling pathways that regulate cell differentiation in plants. M. sativa could be a good model to study the possible range of biochemical diversification of these proteins. On the other hand, we have made a multigenic construct in the modular cloning system GoldenBraid 2.0 (35S::Del::Ros1::MtANR::MtLAR). In a first step, it was functionally validated by transient expression in N. benthamiana. In addition, this construct was introduced by stable transformation in two experimental models (A. thaliana and N. tabacum) and later on in M. sativa, where it has been studied the integration capacity and expression levels of the different transgenes. In N. tabacum it has been achieved the activation of both the anthocyanin and PAs biosynthetic pathways. However, it was not able to activate both routes in alfalfa. The TFs Delila and Rosea1 were not able to activate the genes involved in the regulation of these metabolic pathways in alfalfa, or were not sufficient levels of expression of both TFs for this purpose. Therefore, this multigenic construct does not resulted a good biotechnological tool for the activation of PAs biosynthesis in alfalfa. Our results suggest that the mechanisms of transcriptional control of both biosynthetic pathways could be different between plant species, and that additional specific genetic information on the anthocyanin and PAs biosynthesis in legumes is needed to efficiently activate both pathways in this species. / [ES] La alfalfa (Medicago sativa L.), es una leguminosa forrajera con un importante contenido en proteína, siendo la más cultivada a nivel mundial. En esta especie, los contenidos protéicos se ven mermados por los procesos de crecimiento y los recursos utilizados por la planta en el proceso de floración. Además, la alfalfa contiene una concentración de taninos condensados o proantocianidinas (PAs) muy inferior a la requerida para subsanar el desorden digestivo del ganado rumiante que genera hinchamiento por gases de efecto invernadero o meteorismo y la excesiva desaminación de las proteínas en el rumen producida por las fermentaciones de la flora microbiana ruminal. Ambas problemáticas son difíciles de abordar mediante métodos convencionales de mejora. El objetivo general de esta Tesis es desarrollar herramientas moleculares de utilidad para la manipulación genética de determinados caracteres de interés agronómico en la alfalfa, con objeto de incrementar su valor nutricional. Para ello, hemos puesto a punto un protocolo de transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens vía embriogénes somática aplicable a varios genotipos de alfalfa, que permite la producción de embriones viables capaces de germinar y producir plantas completas en el 50% de los explantes inoculados. Prácticamente no se detectó la presencia de quimeras o escapes ya que la mayoría de las plantas obtenidas contenían el T-DNA con todos los transgenes incorporados, disponiéndose por tanto de la herramienta imprescindible para la realización de los otros dos objetivos. Hemos aislado dos ortólogos del gen TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) de alfalfa (MsTFL1c y MsTFL1a). Ambos genes se sobreexpresaron constitutivamente en A. thaliana y después en alfalfa para su posible uso como herramienta biotecnológica para producir un retraso en el tiempo de floración y con ello un posible aumento del desarrollo vegetativo. MsTFL1a extiende la fase vegetativa e inflorescente y retrasa la floración en Arabidopsis. En alfalfa su expresión constitutiva también produce retraso de la floración. Sin embargo, a este fenotipo no se le asocia un incremento del desarrollo vegetativo, presentando las plantas un tamaño más reducido que parece vinculado a una limitación en la proliferación celular. Hemos comprobado que este hecho se asocia a una reducción en los niveles de expresión de determinados genes efectores de la división celular, como es el caso de las ciclinas. Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que los genes TFL1-like podrían participar adicionalmente en vías de señalización que regulan la diferenciación celular en plantas. También, hemos realizado una construcción multigénica mediante el sistema de clonaje por módulos GoldenBraid 2.0 (35S::Del::Ros1::MtANR::MtLAR). Se ha validado su funcionalidad mediante expresión transitoria en N. benthamiana y se ha introducido de manera estable en dos modelos experimentales: A. thaliana y N. tabacum, y en M. sativa, donde se ha estudiado su capacidad de integración, así como la de expresión de los transgenes. Hemos comprobado que esta construcción multigénica es capaz de activar la ruta de biosíntesis de antocianinas y de PAs en N. tabacum, pero no fue capaz de activar ambas rutas en alfalfa. Los factores transcripcionales Delila y Rosea1 no fueron capaces de activar los genes implicados en la regulación de ambas vías metabólicas en esta especie, o no fueron suficientes sus niveles de expresión para este fin. Por tanto, esta construcción no es una buena herramienta biotecnológica que procure la activación de la ruta de biosíntesis de PAs en la alfalfa. Nuestros resultados sugieren que los mecanismos de control transcripcional de la biosíntesis de antocianinas y PAs son diferentes entre las distintas especies, y que se necesita información genética adicional específica de la biosíntesis de antocianinas y PAs en leguminosas para poder diseñar eficientemente herrami / [CA] L'alfals (Medicago sativa L.), és una lleguminosa farratgera amb un important contingut en proteïna, sent la més cultivada a nivell mundial. En aquesta espècie, els continguts proteics es veuen desfavorits amb els processos de creixement i els requeriments utilitzats per la planta en el procés de floració. A més, l'alfals conté una concentració de tanins condensats o proantocianidines (PAs) molt inferior a la requerida per a esmenar el desorde digestiu del bestiar remugant que genera unflament per gasos o meteorisme per la producció de gasos d'efecte hivernacle, i l'excessiva desaminació de les proteïnes en el rumen produïda per les fermentacions de la flora microbiana. Ambdós problemàtiques són difícils d'abordar per mitjà de mètodes convencionals de millora. L'objectiu general d'aquesta Tesi és desenvolupar ferramentes moleculars d'utilitat per a la manipulació genètica de determinats caràcters d'interés agronòmic en l'alfals, a fi d'incrementar el seu valor nutricional. Per a això, hem posat a punt un protocol de transformació mediada per Agrobacterium tumefaciens via embriogènesi somàtica aplicable a diversos genotips d'alfals que permet la producció d'embrions viables capaços de germinar i produir plantes completes en el 50% dels explants inoculats. Pràcticament no es va detectar la presència de fugues, ja que la majoria de les plantes obtingudes contenien el T-DNA amb tots el transgens introduïts, tenint per tant la ferramenta imprescindible per a la realització dels altres dos objectius. Es van aïllar i sobreexpressar constitutivament dos ortòlegs del gen TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) d'alfals (MsTFL1c i MsTFL1a) en A. thaliana i en alfals per al seu possible ús com a ferramenta biotecnològica, procurant un retard en el temps de floració i amb això un augment del desenvolupament vegetatiu. MsTFL1a estén la fase vegetativa i inflorescent i retarda la floració en Arabidopsis. En alfals la seua expressió constitutiva també produïx retard de la floració. No obstant això, a aquest fenotip no se li associa un increment del desenvolupament vegetatiu, sent les plantes d'una grandària més reduït que pareix vinculat a una limitació en la proliferació cel·lular. Hem comprovat que la limitació en la proliferació cel·lular s'associa a una reducció en els nivells d'expressió de determinats gens efectors de la divisió cel·lular, com és el cas de les ciclines. Els nostres resultats recolzen la hipòtesi que els gens TFL1-like podrien participar adicionalment en vies de senyalització que regulen la diferenciació cel·lular en plantes. Hem realitzat una construcció multigénica per mitjà del sistema de clonatge per mòduls GoldenBraid 2.0 (35S::Del::Ros1::MtANR::MtLAR). S'ha validat funcionalment per mitjà d'expressió transitòria en N. benthamiana. A més, s'ha introduït de manera estable en dos models experimentals (A. thaliana amb N. tabacum), i finalment en M. sativa, en els que s'ha estudiat la seua capacitat d'integració, així com la d'expressió dels transgens. Hem mostrat que aquesta construcció multigénica és capaç d'activar la ruta de biosíntesi d'antocianines i de PAs en N. tabacum. No obstant això, no van ser capaços d'activar la ruta de biosíntesi d'antocianines i per tant, la de PAs, en alfals. Els factors transcripcionals Delila i Rosea1 no són capaços d'activar els gens implicats en la regulació d'ambdues vies metabòliques en aquesta espècie, o alternativament no van ser prou els seus nivells d'expressió per a este fi. Per tant, aquesta construcció multigénica no és una bona ferramenta biotecnològica per activar la ruta de biosíntesi de PAs en l'alfals. Els nostres resultats suggerixen que els mecanismes de control transcripcional de la biosíntesi d'antocianines i PAs són diferents entre les distintes espècies, i que es necessita informació genètica addicional específica de la biosíntesi d'antocianines i PAs en lleguminoses per a / Fresquet Corrales, S. (2015). Diseño y validación de herramientas biotecnológicas para la mejora del valor nutricional de la alfalfa (Medicago sativa L.) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/59240

Cucumber is one of the most important horticultural species at economic level. Despite its agronomic relevance, there is currently no efficient transformation method available. The problems to obtain transgenic cucumber plants are mainly due to the low morphogenetic response in explants of certain genotypes, poor adequacy of selection methods, decrease in regeneration rate as a consequence of the usual treatments in a transformation experiment and, above all, the high rate of 'escape' plants. Taking into account the existing problems, the first objective of the present work has been the evaluation of the morphogenetic response in cucumber explants and the development of regeneration methods potentially useful in transformation experiments. These studies have been carried out with two commercial cultivars, four pure lines and one line that has been frequently used in cucumber breeding programs. Different types of primary explants have been evaluated to determine which may be the most suitable in a transformation experiment. The influence of the ontogenic state of the seedling on the degree of myxoploidy in cotyledon explants has been studied. Likewise, the ploidy level of regenerated plants from these explants has been determined. Regarding the culture medium, the effect of growth regulators, as well as that of other components, such as silver nitrate or copper sulphate, has been studied. In the context of the second objective, studies on the different stages of the transformation process by co-cultivation of cucumber explants with Agrobacterium tumefaciens have been carried out. Several factors, such as the Agrobacterium strain, how to carry out the phases of inoculation and co-culture, the suitability of different marker genes in the selection process and the influence of different components of the culture medium have been analyzed. Attempts have also been made to infer the causes of the occurrence of 'escape' plants or the formation of chimeras in cucumber transformation experiments. Finally, based on the results obtained, some solutions that could help to avoid this problem in future experiments are proposed. / El pepino es una de las especies hortícolas más importantes a nivel económico. Pese a su relevancia agronómica, no puede decirse que a día de hoy se disponga de un método de transformación adecuado. Los problemas a la hora de conseguir plantas transgénicas de pepino estriban en la baja respuesta morfogenética en explantes de ciertos genotipos, la escasa adecuación de los métodos de selección, el descenso en la tasa de regeneración debido a los tratamientos habituales en un experimento de transformación y, sobre todo, la alta tasa de escapes. En función de la problemática existente, el primer objetivo del presente trabajo ha sido la evaluación de la respuesta morfogenética en explantes de pepino y el desarrollo de métodos de regeneración potencialmente útiles en experimentos de transformación. Estos estudios se han llevado a cabo con dos cultivares comerciales, cuatro líneas puras y una línea que ha sido utilizada frecuentemente en programas de mejora genética de pepino. Se han empleado distintos tipos de explantes primarios para determinar cuál o cuáles pueden ser los más adecuados en un experimento de transformación. Se ha estudiado la influencia del estado ontogénico de la plántula sobre el grado de mixoploidía en explantes de cotiledón. Asimismo, se ha determinado el nivel de ploidía de las plantas regeneradas a partir de estos explantes. Por lo que respecta al medio de cultivo, además de estudiar el efecto de componentes habituales (e.g. reguladores del crecimiento) se ha evaluado el de otros que no lo son tanto, como el nitrato de plata o el sulfato de cobre. En el contexto del segundo objetivo se han realizado una serie de estudios sobre las etapas del proceso de transformación mediante co-cultivo de explantes de pepino con Agrobacterium tumefaciens. Se han analizado diversos factores, tales como la cepa de Agrobacterium, la forma de llevar a cabo las fases de inoculación y co-cultivo, la adecuación de distintos genes marcadores en el proceso de selección y la influencia de distintos componentes del medio de cultivo. Asimismo, se han tratado de inferir las causas que generan la aparición de escapes o de quimeras en experimentos de transformación de pepino. Por último, sobre la base de los resultados obtenidos, se proponen algunas soluciones que podrían ayudar a evitar este problema en futuros experimentos. / El cogombre és una de les espècies hortícoles més importants a nivell econòmic. A pesar de la seua rellevància agronòmica, no pot dir-se que a hores d'ara es dispose d'un mètode de transformació adequat. Els problemes a l'hora d'aconseguir plantes transgèniques de cogombre consistixen en la baixa resposta morfogenètica en explants de certs genotips, l'escassa adequació dels mètodes de selecció, el descens en la taxa de regeneració degut als tractaments habituals en un experiment de transformació i, sobretot, l'alta taxa de fugues. En funció de la problemàtica existent, el primer objectiu del present treball ha sigut l'avaluació de la resposta en explants de cogombre i el desenvolupament de mètodes de regeneració potencialment útils en experiments de transformació. Estos estudis s'han dut a terme amb dos cultivars comercials de cogombre, tres línies pures i una línia que ha servit de base en programes de millora. S'han empleat distints tipus d'explants primaris per a determinar quin o quins poden ser els més adequats en un experiment de transformació. Pel que fa al mig de cultiu, a més d'estudiar l'efecte de components habituals (e.g. reguladors del creixement) s'ha avaluat el d'altres que no ho són tant, com el nitrat de planta o el sulfat de coure. Així mateix, s'ha analitzat el grau de mixoploidia en alguns explants i l'efecte de certs tractaments sobre el nivell de ploidia de les plantes regenerades. En el context del segon objectiu s'han realitzat una sèrie d'estudis sobre les etapes del procés de transformació per mitjà de co-cultiu d'explants de cogombre amb Agrobacterium tumefaciens. S'han analitzat diversos factors, com ara el cep d'Agrobacterium, la forma de dur a terme les fases d'inoculació i co-cultiu, l'adequació de distints gens marcadors en el procés de selecció i la influència de distints components del mig de cultiu. Així mateix, s'han tractat d'inferir les causes que generen l'aparició de plantes no transgèniques (escape plants) o de quimeres en experiments de transformació de cogombre. Finalment, sobre la base dels resultats obtinguts es plantegen algunes solucions que ajuden a evitar estos problemes en futurs experiments. / Fonseca Miguel, JA. (2017). Estudios sobre regeneración y transformación genética en pepino (Cucumis sativus L) vía Agrobacterium tumefaciens [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90405

El empleo de herramientas genómicas ayudará a superar dos de los retos que todavía subsisten en el campo de la mejora molecular (i.e., vía transformación): la identificación de los genes que realmente controlan los caracteres de interés agronómico y la detección de señales de regulación que permitan modular la expresión de los transgenes a nivel espacial y temporal. Entre las vías para lograr tales objetivos, destaca la mutagénesis insercional por T-DNA, que en los últimos años se ha convertido en una herramienta básica para la identificación y etiquetado de genes, así como para el análisis de su función. En efecto, la disrupción de un gen endógeno o la integración del T-DNA en la vecindad del mismo pueden ocasionar la anulación o alteración de función, dando una valiosa información sobre el papel de un cierto gen en un carácter dado. Otra aplicación de la mutagénesis insercional por T-DNA estriba en la detección de elementos de regulación mediante el empleo de los denominados "sistemas trampa" (trapping) que permiten detectar secuencias reguladoras y asignar una función a partir de datos de expresión del delator que mimetiza la expresión del gen endógeno. El aspecto más relevante de estas aproximaciones es que, tras la identificación de un cierto gen, éste queda etiquetado por el T-DNA, lo que facilita su clonación. El principal objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido la generación una colección de líneas de inserción por T-DNA en tomate y la identificación de mutantes afectados en caracteres relacionados con el desarrollo. En concreto, se han generado más de 1200 líneas T-DNA y se han obtenido sus descendencias TG2. La caracterización de estas líneas en TG1 ha conducido a la detección de 255 mutantes (de tipo dominante, semidominante o aditivo) afectados en caracteres vegetativos y/o reproductivos. Asimismo, se ha caracterizado una pequeña muestra de progenies TG2 (en concreto 37) lo que ha permitido la identificación de 6 mutantes recesivos. / Angarita Díaz, MDP. (2009). Generación de líneas T-DNA de tomate (Solanum Lycopersicon cv.p73) e identificación de mutantes de inserción [Tesis doctoral]. Editorial Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/14718

[ES] El calcio (Ca2+) es un catión esencial que juega un papel fundamental en todos los organismos vivos. Desde el punto de vista funcional, el Ca2+ actúa como un segundo mensajero que regula distintos procesos celulares. Trabajos anteriores indican que la señalización mediante Ca2+ podría estar implicada en las primeras etapas de la inducción de la embriogénesis in vitro de las plantas, pero el verdadero papel del Ca2+ en este proceso es aún desconocido. Por eso, el principal objetivo de la presente Tesis es el estudio del papel del Ca2+ en la embriogénesis in vitro mediante dos sistemas in vitro: la embriogénesis somática y la embriogénesis de microsporas. Para determinar la importancia de la homeostasis del Ca2+ en la inducción de la embriogénesis y las dinámicas de los niveles de Ca2+ durante la inducción y el establecimiento de embriones somáticos y derivados de microsporas, se utilizaron tratamientos químicos y se detectaron los niveles de Ca2+ mediante sondas fluorescentes y sensores cameleon codificados genéticamente, visualizados con microscopía fluorescente y confocal. Observamos que el aumento de Ca2+ es un marcador temprano en la inducción de la embriogénesis in vitro y que los niveles de Ca2+ durante la embriogénesis in vitro son dinámicos en todos los sistemas estudiados. Además, las oscilaciones en los niveles de Ca2+ podrían estar relacionadas con los procesos de diferenciación que ocurren en las células inducidas una vez une el Ca2+ a la calmodulina. Mostramos que un aumento de Ca2+ dentro de un rango definido de concentración tiene un efecto positivo, dependiendo del sistema, en la producción de embriones, siendo más sensibles aquellos sistemas basados en suspensiones de células aisladas que aquellos que usan tejidos como explantes. Finalmente, estudiamos el papel de la calosa durante la embriogénesis somática, observando que la inhibición de la deposición de calosa impide el desarrollo embrionario, lo que sugiere una relación entre la formación de una barrera de calosa y el establecimiento de la identidad embrionaria en las células somáticas. / [CAT] El calci (Ca2+) és un catió essencial que juga un paper fonamental en tots els organismes vius. Des del punt de vista funcional, el Ca2+ actua com a un segon missatger que regula diferents processos cel·lulars. Treballs anteriors indiquen que la senyalització mitjançant el Ca2+ podria estar implicada en les primeres etapes de la inducció de l'embriogènesi in vitro de les plantes, però el paper real del Ca2+ en aquest procés encara és desconegut. Per això, el principal objectiu de la present Tesi és l'estudi del paper del Ca2+ en l'embriogènesi in vitro mitjançant dos sistemes in vitro: l'embriogènesi somàtica i l'embriogènesi de micròspores. Per tal de determinar la importància de l'homeòstasi del Ca2+ en la inducció de l'embriogènesi i les dinàmiques dels nivells de Ca2+ durant la inducció i l'establiment d'embrions somàtics i derivats de micròspores, es van utilitzar tractaments químics i es van detectar els nivells de Ca2+ mitjançant sondes fluorescents i sensors de cameleon codificats genèticament, visualitzats amb microscòpia fluorescent i confocal. Vam observar que l'augment de Ca2+ és un marcador primerenc en la inducció de l'embriogènesi in vitro i que els nivells de Ca2+ durant l'embriogènesi in vitro són dinàmics en tots els sistemes estudiats. A més, les oscil·lacions en els nivells de Ca2+ podrien estar relacionades amb els processos de diferenciació que tenen lloc en les cèl·lules induïdes una vegada uneix el Ca2+ a la calmodulina. Vam mostrar que un augment de Ca2+ dins d'un rang definit de concentració té un efecte positiu, depenent del sistema, en la producció d'embrions, essent més sensibles aquells sistemes basats en suspensions de cèl·lules aïllades que aquells que usen teixits com a explants. Finalment, vam estudiar el paper de la cal·losa durant l'embriogènesi somàtica, i vam observar que la inhibició de la deposició de cal·losa impedeix el desenvolupament embrionari, la qual cosa suggereix una relació entre la formació d'una barrera de cal·losa i l'establiment de la identitat embrionària en les cèl·lules somàtiques. / [EN] Calcium (Ca2+) is an essential cation that plays fundamental roles in all living organisms. From a functional point of view, Ca2+ acts as a second messenger that regulates different cellular processes. Previous works point to the fact that Ca2+ signaling may be involved in the early stages of induction of in vitro plant embryogenesis, but the actual role of Ca2+ in this process remained unveiled. Thus, the main goal of the present Thesis is to study the role of Ca2+ in in vitro embryogenesis using two in vitro systems: somatic embryogenesis and microspore embryogenesis. Chemical treatments and detection of Ca2+ with fluorescent probes and genetically-encoded cameleon sensors imaged by fluorescence and confocal microscopy were performed to determine the importance of Ca2+ homeostasis for induction of embryogenesis and the dynamics of Ca2+ levels during the induction and establishment of somatic and microspore-derived embryos. We observed that Ca2+ increase is an early marker of induction of in vitro embryogenesis and Ca2+ levels during in vitro embryogenesis are dynamic in all the systems we studied. Moreover, Ca2+ oscillations might be related to the differentiation processes that take place in the induced cells upon binding to calmodulin. We showed that Ca2+ increase within a defined range has system-specific positive effects in embryo yield, being more sensitive those systems using isolated cell suspensions rather than those using tissues as explants. Finally, we studied the role of callose during somatic embryogenesis, and we observed that inhibiting callose deposition prevents embryo development, which suggests a relationship between the formation of a callose barrier and the establishment of embryo identity in somatic cells. / Calabuig Serna, A. (2023). Multidisciplinary study of the role of calcium in plant in vitro embryogenesis [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/196022