Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Thesis (doctoral)--Universiẗat, Göttingen, 2004.

Universiẗat, Diss., 2004--Freiburg (Breisgau).

Untersuchung der Reaktion kultivierter humaner Keratinozyten auf das Binden von Autoantikörpern beim bullösen Pemphigoid. Festgestellt wurde eine erhöhte Freisetzung von t-Pa, sowie eine Umverteilung und Reduktion des Zielantigens unter Calciumeinfluß. / Experiments to the reactions of cultivated keratinocytes after binding of autoantibodies against BP180. We recognizzed elevated levels of t-Pa and an alterated distribution of the target antigen under calcium influence.

Meningokokken sind nach wie vor eine wichtige Ursache für Gehirnhautentzündungen und Sepsen weltweit, vor allem bei Kindern und Jugendlichen. Weil viele Pathomechanismen dieses Erregers bislang noch unvollständig verstanden sind, wurden im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit populationsbiologische und pathogenetische Aspekte von Neisseria meningitidis untersucht. Die Kapsel ist der hauptsächliche Pathogenitätsfaktor von Meningokokken und wichtig für die Besiedelung von neuen Wirten. Isolate von symptomfreien Trägern sind allerdings häufig unbekapselt. Um Ursachen oder Mechanismen für den Verlust der Kapselexpression aufzudecken, wurden insgesamt 166 Isolate der Bayerischen Meningokokkenträgerstudie untersucht. Alle Isolate besaßen sämtliche zur Kapselsynthese notwendigen Gene, exprimierten aber keine Kapsel. Bei 39 Isolaten fanden sich Längenvariationen in homopolymeren Sequenzen (slipped strand mispairing, SSM) in den Genen siaA und siaD. 46 Isolate enthielten Insertionselemente (IS1301, IS1016 und IS1106) in den Genen der Kapselsynthese. Irreversible Mutationen (Deletionen, Insertionen, Basensubstitutionen) wurden bei 47 Isolaten gefunden. Veränderungen der Promotorregion schienen keine Rolle zu spielen. Es wurden bei insgesamt sechs Isolaten zwei nicht-synonyme Mutationen in unmittelbarer Nähe zum putativen aktiven Zentrum der UDP-N- Acetylglukosamin-2-Epimerase entdeckt, die einen Verlust der Kapselsynthese erklären könnten. Insgesamt wurden keine Akkumulationen von Mutationen in defekten Genen gefunden und es gab auch keine Korrelationen zwischen den verschieden Ursachen und bestimmten klonalen Linien. Die erhaltenen Ergebnisse legen nahe, dass die meisten der zur Blockierung der Kapselexpression führenden Ereignisse erst im aktuellen Wirt aufgetreten sind und dass zumindest bei bestimmten klonalen Linien die Verbreitung von der Expression einer Kapsel abhängig ist. Viele pathogene Bakterien nutzen zur Infektion des Menschen die ubiquitär im Körper vorkommende Protease Plasmin. Dazu binden diese Plasmin oder das Proenzym Plasminogen. Auch Meningokokken interagieren mit Plasmin und Plasminogen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten drei Rezeptormoleküle für Plasminogen identifiziert werden. Die drei Proteine Enolase, DnaK und Peroxiredoxin konnten mit verschiedenen Methoden auf der Oberfläche der Erreger nachgewiesen werden. Die Bindung des Plasminogens ist bei Meningokokken ausschließlich über Lysinreste der Rezeptoren vermittelt, die C-terminalen Lysinreste der hier identifizierten Rezeptormoleküle spielen aber, wenn überhaupt, nur eine untergeordnete Rolle. Die Bindung von Plasminogen war durch rekombinante Rezeptorproteine konzentrationsabhängig inhibierbar. Plasminogen konnte von Meningokokken auch aus dem Serum rekrutiert werden. Gebundenes Plasminogen war mit uPA (Urokinase Plasminogen Aktivator) aktivierbar und physiologisch aktiv, was durch die Degradation von Fibrinogen nachgewiesen wurde. Das gebundene Plasmin wurde durch die Bakterien vor der Desaktivierung durch α2- Antiplasmin geschützt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Meningokokken auch mit weiteren Faktoren des Fibrinolyse-Systems (uPA) interagieren. Sie rekrutierten uPA an ihre Oberfläche und gebundenes uPA war physiologisch aktiv. Die erhaltenen Ergebnisse bestärken die These, dass Meningokokken die Faktoren des Fibrinolyse-Systems für ihre Pathogenese nutzen. / Meningococci remain to be one of the major causes for meningitis and septicaemia worldwide, especially in children and young adults. Because many of the pathogen’s pathomechanisms still remain unresolved, in the present doctoral thesis population biology and pathogenetic aspects of Neisseria meningitidis were investigated. The capsule is the major virulence-factor of meningococci and important for the dispersal to new hosts. However, isolates extracted from healthy carriers are frequently unencapsulated. To reveal the causes or mechanisms underlying this loss of encapsulation 166 strains of the Bavarian Meningococci Carriage Study were analysed. All these strains possessed all the genes responsible for capsule expression but were acapsulate. Slipped strand mispairing was demonstrated for 39 isolates in the genes siaA and siaD. The insertion elements IS1016, IS1106 and IS1301 were responsible for the loss of encapsulation in other 46 strains and 47 isolates showed irreversible mutations (deletions, insertions and base exchanges) in capsule genes. Sequence alterations in the promoter region seemed not to be responsible for the loss of encapsulation. In close vicinity to the putative active site of the UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase two non-synonymous mutations were detected in altogether six strains. Altogether there was no accumulation of mutations in the uncovered defective genes and no correlation between state of encapsulation and specific clonal lineages could be revealed. The obtained results portray a scenario, were the loss of encapsulation happens in the recent host and where at least some clonal lineages are dependent on the capsule for dissemination. Many bacteria use the protease plasmin for their pathogenesis. For this they recruit plasmin or its precursor plasminogen to their surface. Meningococci were shown to interact with plasminogen, too. In the present thesis three meningococcal receptors for plasminogen were identified. The three receptor proteins enolase, DnaK and peroxiredoxin were shown to be localised extracellularly on the bacterial cell surface by diverse techniques. Binding of plasminogen was demonstrated to occur exclusively to lysine residues of the receptor molecules, but the C-terminal lysine residues of the newly identified receptors were not involved in this process. Recruitment of plasminogen to the bacterial surface could be inhibited by soluble, recombinant receptor proteins in a concentration dependent manner. Furthermore, meningococci were shown to be able to recruit plasminogen from human serum. Receptor bound plasminogen could be activated by uPA (urokinase plasminogen activator) and was physiologically active as demonstrated by degradation of fibrinogen. The bound plasmin was also protected from deactivation by α2-antiplasmin. In addition, Neisseria meningitidis was shown to interact with other components of the fibrinolytic system. The bacteria attached uPA to their surface and the bound uPA was physiologically active. These data provide further evidence for recruitment and usage of factors of the fibrinolytic system in pathogenesis of meningococci.

Techn. Universiẗat, Diss., 2001--Darmstadt.

Die Studie beinhaltet eine biochemisch-molekularbiologische Analyse des 20S-Proteasoms und seiner Aktivierung durch Proteine der PA28-Familie. Das 20S-Proteasom ist die zentrale Epitop-prozessierende cytosolisch-nukleäre Protease des MHC-Klasse-I-Antigenpräsentationsweges. In Mikroglia, wie auch in anderen Zellen, unterliegt das Proteasom einer Interferon-g-(IFN-g)-vermittelten strukturellen Plastizität, d.h. einer Substitution der Untereinheiten der Aktiven Zentren. Durch diesen Austauschmechanismus werden proteolytische Schnittpräferenzen modifiziert, was für die Hierarchie von cytotoxischen T-Zellantworten von Bedeutung ist. Lipopolysaccharide (LPS) bewirken in Mikroglia ebenfalls Veränderungen der proteasomalen Zusammensetzung des 20S-Komplexes und seines PA700-Aktivators. Dies ist ein Hinweis auf die Rolle des Proteasoms auch bei der Prozessierung von Antigenen des endolysosomalen Antigenpräsentationsweges. Die Modulation der Zusammensetzung des 20S-Proteasoms in Mikroglia durch IFN-g und LPS ist ein weiterer Beleg für die Rolle der Mikroglia bei der zellulären Immunantwort im Zentralnervensystem. Funktionen des Proteasoms in der MHC-Klasse-I-Antigenpräsentation werden durch den Proteasomaktivator PA28 optimiert. Die PA28-Proteinfamilie besteht aus den Proteinen PA28a, PA28b und PA28g. Diese Studie trägt - basierend auf kinetischen Modellierungen, Mutagenese- und Protein-Protein-Interaktionsstudien und Untersuchungen zur MHC-Klasse-I-Antigen-präsentation in PA28-Transfektanten - zur funktionellen Neubewertung dieser drei Proteine bei. Die drei PA28-Proteine sind autonome Aktivatoren des Proteasoms. Heteromere PA28ab-Komplexe verursachen eine stärkere Aktivierung des Proteasoms als die homomeren PA28a-oder PA28b-Komplexe. Das PA28g-Protein ist in vitro ein schwacher Aktivator verschiedener proteasomaler Peptidaseaktivitäten, der dennoch in unserem in vivo-Modell eine verbesserte MHC-Klasse-I-Antigenpräsentation bewirkt. Kinetische Argumente sprechen für Funktionen der PA28a und PA28b-Proteine als Translokasen für Peptidsubstate und -produkte des Proteasoms. Anhand des HBx-Proteins des Hepatitis B-Virus wird die Möglichkeit illustriert, das vorgestellte Modell zur Analyse viraler Faktoren anzuwenden, die mit der Aktivierung des Proteasoms durch PA28 interferieren. / The 20S proteasome is the proteolytic core complex of the main cytoplasmic and nuclear protein degradation system. One of the numerous functions assigned to the 20S proteasome is the generation of antigenic peptides from intracellular proteins. MHC class I surface presentation of antigenic peptides is one key event of the cellular immune response. The presented study was aimed on the biochemical and molecular-biological analysis of the 20S proteasome and its activation by regulatory proteins of the PA28 family. In the brain, microglial cells are the major antigen presenting cells and they respond sensitive to pathologic events. Cultured mouse microglia was used as a model to study the correlation between microglial activation parameters and structural plasticity of the 20S/26S proteasome. In response to interferon-g , constitutive active site subunits were replaced by inducible subunits as described for other cellular systems. These replacements result in altered proteolytic cleavage preferences, indicating that activated microglia adapts its proteasomal subunit composition to the requirements of an optimized MHC class I epitope processing. Since lipopolysaccharide (LPS), a glycolipid of bacterial pathogens, also alters proteasome subunit composition of the 20S proteasome and its activator PA700, a function of microglial proteasome in processing of antigens of the endolysosomal pathway has been postulated. The modulation of the 20S proteasome subunit composition indicates that microglia is part of the cellular immune response in the central nervous system. The proteasome activator PA28 has been reported to optimize MHC class I antigen presentation. The PA28 protein family is composed of three proteins: PA28a, PA28b and PA28b. Based on kinetic modelling approaches, mutagenesis of activator proteins, protein-protein interaction studies and investigation of MHC class I antigen presentation in PA28-transfected cell lines a evaluation of functions of these three proteins has been performed. In vitro investigations revealed that the recombinant PA28 proteins are activators of peptidase activities of the proteasome. Heteromeric PA28ab complexes are stronger activators than homomeric PA28a o PA28b complexes. Recombinant PA28g is a weak activator of several peptidase activities. Nevertheless, in PA28g transfected B8-fibroblasts preliminary results indicate an improved MHC class I presentation. Based on kinetic evidence, a model has been presented indicating that PA28a and PA28b proteins act as peptide translocases, performing the import of substrates or the export of products into the catalytic chamber of the 20S proteasome. Finally, as examplified with the HBx protein of Hepatitis B virus, the opportunity is presented to use an in vitro reconstitution system of proteasomal activation to examine viral proteins interfering with proteasomal activation.

<p>UVOD: Akutni ishemijski moždani udar (AIMU) je poremećaj moždane funkcije nastao usled vaskularnih o&scaron;tećenja, uzrokovane okluzijom ili embolijom krvnog suda. Za razliku od standardnog CT pregleda endokranijuma, CT perfuzija (CTP) je napredna dijagnostička procedura koja može u prvim satima od početka simptoma AIMU pružiti precizne informacije o lokalizaciji i veličini infarkta mozga, a u okviru infarkta, razlikovati srž i ishemijsku penumbru. Samim tim, CTP predstavlja svojevrsnu pomoć u selekciji pacijenata za intravensku primenu rekombinantnog tkivnog plazminogen aktivatora (rtPA). CILJ RADA: Cilj istraživanja je bio da se primenom CTP ispita koliko iznosi: optimalna veličina srži, zatim minimalni i optimalan odnos penumbre i srži infarkta pogodnih za primenu rtPA, maligni profil srži infarkta koji je nepogodan za primenu rtPA i % simptomatske hemoragije kao komplikacije nakon rtPA. MATERIJAL I METODE: Istraživanje je obavljeno u Specijalnoj bolnici &bdquo;Sveti Sava&ldquo; u Beogradu kao petogodi&scaron;nja retrospektivna studija. Studija je obuhvatila ukupno 130 pacijenata sa AIMU kod kojih je primenjena CTP. Eksperimentalnu grupu je sačinjavalo 100 pacijenata kojima je aplikovana rtPA, a kontrolnu grupu 30 pacijenata, koji nisu primili rtPA. Svim ispitanicima su načinjeni: standardni CT pregled glave i CT perfuzija odmah nakon prijema i kontrolni standardni CT pregled endokranijuma 24 h nakon prijema u bolnicu. Pregledi su obavljeni sa 16-slajsnom MSCT aparatu, pri čemu je pokrivenost CTP iznosila 2 cm. &bdquo;Mismatch&ldquo; postoji ukoliko je perfuziona lezija na CBF mapi veća od perfuzionog deficita na CBV mapi (srţ infarkta). REZULTATI: Rezultati studije su pokazali da pacijenti oboleli od AIMU sa mismatchom manjim od 20% nisu imali koristi od primenjene rtPA, a pacijenti sa 20% i vi&scaron;e mismatch-om su imali ili umeren ili značajan neurolo&scaron;ki oporavak. Optimalni mismatch, kojim se postiže visoka uspe&scaron;nost nakon rtPA je iznosio ˃ 101% penumbre. Pacijenti sa povr&scaron;inom perfuzionog deficita na CBV mapi manjom od 1175 mm2 su imali bolji neurolo&scaron;ki oporavak, u odnosu na pacijente savećim lezijama, a samim tim su bili pogodni za primenu rtPA. Perfuzioni deficit na CBV mapi veći od 3000 mm2 (60ml) je predstavljao maligni profil infarkta, usled povećanog rizika od nastanka simptomatske hemoragije i smrtnog ishoda. Simptomatska hemoragija u eksperimentalnoj grupi je iznosila svega 3%, &scaron;to predstavlja nizak procenat komplikacija nakon reperfuzione terapije. ZAKLJUČAK: CT perfuzija je urgentna i brza tehnika, koja nam daje jedinstvene informacije o AIMU, pomaže u dono&scaron;enju odluke o terapijskom pristupu i može poslužiti kao surogat biomarker u predikciji kliničkog ishoda.</p> / <p>INTRODUCTION: Acute ischemic stroke (AIS) is functional brain disorder, which is happened due to vascular damaged, caused by vessel occlusion or embolism. Unlike to noncontrast brain CT, CT perfusion (CTP) is advanced diagnostic procedure, which could give accurate information about localization and extent of AIS in the first hours of symptom onset, and also differentiate infarct cor and ischemic penumbra. Thus, CTP helps in selection patients for administration intravenous recombinant tissue plasminogen activator (rtPA) AIM: The aims of study were to estimate: the size of optimal infarct cor, minimal and optimal ratio between penumbra and infarct core which is suitable for rtPA, malignant profile of infarct core which is not suitable for rtPA and percentage of symptomatic intracerebral hemorrhage as compli-cation after rtPA using CTP. MATERIAL AND METHODS: The investigation was performed in Stroke hospital &bdquo;Sveti Sava&rdquo; in Belgrade as five years retrospective study. Study included 130 patients with AIS with performed CT perfusion. One hundred patients from experimental group were treated with rtPA and thirty patients from control group were not treated with rtPA. All patients underwent baseline noncontrast CT of brain, CT perfusion and control 24 hours follow-up noncontrast brain CT. Examinations were done on 16-slice MSCT and CTP covered an area of 20 mm of brain tissue. &bdquo;Mismatch &ldquo;was defined as a perfusion lesion (CBF lesion) larger than the core lesion (CBV). RESULTS: Results of study showed that the patients with AIS and mismatch less than 20%, had no benefit from rtPA, but patients with &ge; 20% of mismatch had good or excellent clinical outcome. Optimal mismatch, which provided favorable response after rtPA, was ˃101% of penumbra. Patients with cor perfusion lesion (CBV) less than 1175 mm2, are suitable for rtPAand had better clinical outcome, then the patients with larger lesions. Perfusion cor lesions (CBV) larger than 3000 mm2 (60ml) was malignantprofile, because of high risk of symptomatic intracerebral hemorrhage and mortality. Symptomatic hemorrhage in experimental group was only 3%, as a low percentage of complications after reperfusion therapy.<br />CONCLUSION: CTP is emergency and rapid technique, which provides unique information about AIS, helps with clinical decision making and could be surrogate biomarker in prediction of clinical outcome.</p>

Das 20S Proteasom ist das Kernelement des Ubiquitin-Proteasom-Systems und baut fehlerhafte, nicht mehr benötigte und oxidierte Proteine ab, wobei drei katalytisch aktive Untereinheiten die Polypeptidkette schneiden. Das proinflammatorische Cytokin IFNg induziert die Expression und Inkorporation der alternativen katalytisch aktiven Immunountereinheiten, was in variablen Isoformen des 20S Proteasoms resultiert. Die zusätzliche Assoziation des 19S Regulators, bzw. des PA28 und des PA200 Aktivators an eine Isoform erweitert das Sortiment an proteasomalen Komplexsubtypen. Der zeitliche Verlauf einer IFNg Stimulation zeigte, dass die Aktivatoren PA28 und PA200 antagonistisch an das 20S Proteasom assoziieren und niedermolekulare Komplexsubtypen bilden, sodass in dieser Studie auch zum ersten Mal eine IFNg abhängige Assoziation des PA200 Monomers an das 20S Proteasom detektiert wurde. Ex vivo Versuche zeigten, dass die Defizienz der Immunountereinheit LMP7 mit der Assoziation des PA28-Aktivators an das 20S-19S Proteasom kompensiert wird, wobei die funktionelle Wirksamkeit aber offen bleibt. In einer monozytären Zelllinie wird ein sehr hochmolekularer, chymotryptisch aktiver Komplex assembliert und massenspektrometrische Analysen detektierten proteasomale Untereinheiten und viele Komponenten der Proteinbiosynthese, was für eine Assoziation des Proteasoms mit dem Polysom spricht. Diese Möglichkeit der kotranslationalen Degradation kann auch die Assoziation des detektieren Chaperonins TriC erklären, wobei dieser Komplex, der ATP abhängig Proteine faltet, möglicherweise auch direkt mit dem Proteasom interagieren könnte, wie elektronenmikroskopische Aufnahmen belegten. Neben den neuen strukturellen Ergebnissen, bestätigte die funktionelle Analyse den Abbau polyubiquitinierter Substrate durch 19S-Regulator assoziierte Komplexsubtypen, doch das 19S-20S-19S Proteasom konnte das Modellsubstrat HA-Ubi-IkBa-flag besser abbauen und deubiquitinieren als das 20S-19S Proteasom. / The 20S proteasome is the core element of the ubiquitin-proteasome-system, which degrades defective, unneeded and oxidized proteins, while three catalytically active subunits hydrolyze the peptide bonds of the polypeptide. The proinflammatory cytokine IFNg induces the expression and incorporation of three alternative, catalytically active immunosubunits resulting in variable isoforms of the 20S proteasome. The additional association of the 19S regulator, or the PA28 and PA200 activator, respectively, expands the range of proteasome complex subtypes. The time course of IFNg stimulation showed that the proteasomal association of PA28 and PA200 occurs antagonistically, forming low molecular weight complex subtypes. Furthermore, this study revealed for the first time an IFNg dependent association of the PA200 monomer to the 20S proteasome. Ex vivo experiments showed that the deficiency of the immunosubunit LMP7 is compensated by the association of the PA28 activator to the 20S-19S proteasome, whereas the functional efficacy remains elusive. In a monocytic cell line, a chymotryptic active complex with a very high molecular weight was detected, and mass spectrometry confirmed proteasomal subunits and components of the protein synthesis machinery, suggesting an association of the proteasome with the polysome. The fact of cotranslational degradation may also explain the association of the chaperonin TriC, an ATP dependent protein folding chaperonin. Electron micrographs could reveal that TriC possibly interacts directly with the proteasome. Next to the new structural results, the functional analysis confirmed the degradation of polyubiquitinated substrates by 19S regulator associated complex subtypes, and in addition to it, the 19S-20S-19S proteasome degraded and deubiquitinated the model substrate HA-Ubi-IkBa-flag better than the 20S-19S proteasome.

Für den Zusammenbau des HBV-Partikels ist die Interaktion zwischen Oberflächenproteinen und dem Nukleokapsid notwendig. Sich überlappende synthetische Peptide aus dem Bereich der HBcAg-Bindungsdomäne im C-Terminus der PreS1-Region und dem TLM, sind nach Internalisierung vor allem im Kern lokalisiert. Die Aminosäuren 101-115 der PreS1-Region interagieren mit dem Nukleokapsid, während die PreS2-Domäne keine Interaktion mit dem Nukleokapsid eingeht. Mit den synthetischen Peptiden konnte Einfluss auf die Sekretion viraler Partikel genommen werden. Die Lokalisation von HBcAg als Interaktionspartner in HBV-produzierenden Zellen verändert sich bei Inkubation mit den synthetischen Peptiden, es tritt vermehrt im Kern auf. Rekombinante Proteine ähnlich den synthetischen Peptiden aber mit der vollständigen PreS2-Region, sind nach Internalisierung im Zytosol nachweisbar. Die Sekretion viraler Partikel wurde partiell inhibiert. Das HBV-Genom kodiert zwei virale Aktivatoren, das HBx und die PreS2-Region im LHBs. Beide aktivieren den c-Raf-1/MEK-Signalweg. Durch die selektive Inhibierung der Effektoren (Ras oder Proteinkinase C) von HBx oder PreS2 im LHBs konnte kein Effekt auf die Genexpression/ Sekretion nachgewiesen werden. Durch simultane Inhibierung der Signalkaskade so kommt die Virussekretion fast vollständig zum Erliegen. Die Ursache hierfür ist in einer reduzierten Neusynthese von viralen Proteinen zu finden und nicht in der Akkumulation der Proteine in der Zelle. Zur Untersuchung des Einflusses der Funktionalität der beiden Aktivatoren wurden HBx- bzw. PreS2- und HBx/PreS2-defiziente HBV-Expressionsplasmide generiert. Die Einzelmutanten zeigten nur einen geringen reduzierenden Einfluss auf die Genexpression/Virussekretion. Beim Einsatz der Doppelmutante wurde die Genexpression/Virussekretion fast vollständig inhibiert. HBx und PreS2 im LHBs sind für die Virusreplikation von Bedeutung aber sie können einander ersetzen. / Assembly of HBV particles and subsequent secretion of mature virus requires the interaction of the nucleocapsid with defined domains of the surface proteins. Overlapping synthetic peptides covering the C-terminal part of the PreS1 domain and the cell permeable domain of PreS2 (TLM) were shown to localize most of all in the nucleus. Based on these peptides aa 101-115 of PreS1 were found to be essential for the interaction with the nucleocapsid, while the PreS2 domain does not interact with the nucleus. Presence of the peptides that compete the nucleocapsid surface protein interaction a block of HBV and antigen secretion was achieved. HBcAg as natural interaction partner of the surface proteins then arises increased in the nucleus. Recombinant proteins similar to the synthetic peptides but with the whole PreS2 domain localize in the cytoplasm and block HBV and antigen secretion. The genome of HBV encodes two transcriptional activators: the HBx protein and the PreS2 activator LHBs. Both trigger activation of c-Raf-1/MEK kinase cascade. To evaluate the importance of both activators for viral replication selective inhibitions of signal transduction cascades were performed and do not result in a decrease of viral replication. Simultaneous inhibition of both activators abolished viral secretion. It is due to a reduced de novo synthesis and not to an accumulation of viral proteins in cells. The relevance of activator function was tested by mutated HBV genome defective for HBx and / or PreS2 activator function. After transfection single mutants show no significant reduced HBV expression whereas at the double mutated HBV genome a strong reduced virus expression could be observed. The HBx protein and the PreS2 activator LHBs are important for viral replication but they can replace each other.