Orientador: Rosangela Zacarias Machado / Resumo: Anaplasma marginale é uma bactéria, Gram negativa, intracelular obrigatória parasita de eritrócitos e o principal agente da Anaplasmose bovina. Esta doença causa anemia severa, provocando a redução do ganho de peso e da produção de leite e gerando grandes perdas econômicas na pecuária mundial. A diversidade genética desta bactéria vem sendo caracterizada com base na sequência das proteínas de superfície (MSPs), principalmente, na proteína MSP1α, sendo possível identificar as diferentes estirpes geográficas de acordo com as diferenças nas sequências de aminoácidos. O presente estudo teve como objetivo investigar a diversidade genética de A. marginale em bovinos de corte da raça Angus naturalmente infectados durante um surto da enfermidade. Vinte bovinos, com idades entre 6 e 9 meses, oriundos de uma fazenda no município de Itú, estado de São Paulo foram acompanhados por quatro meses e quatro colheitas de sangue foram realizadas. Amostras de soro foram submetidas à Ensaio Imunoenzimático Indireto (iELISA) para detecção de anticorpos IgG anti-A. marginale. As oitenta amostras de sangue total obtidas, foram submetidas à extração de DNA, PCR em tempo real quantitativa (qPCR) para o gene msp1β, semi-nested PCR (snPCR) para o gene msp1α, clonagem do fragmento alvo e sequenciamento pelo método de Sanger. As sequências obtidas foram submetidas à analises de diversidade genética pelo software RepeatAnalyzer. O ensaio Imunoenzimático Indireto (iELISA), utilizando Ag total, revelou baixa... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Anaplasma marginale is a Gram-negative, obligatory intracellular erythrocyte parasite and the main agent of bovine Anaplasmosis. This disease causes severe anemia, causing a reduction in weight gain and milk production and generating major economic losses in livestock worldwide. The genetic diversity of this bacterium has been characterized based on the sequence of surface proteins (MSPs), mainly in the protein MSP1α, making it possible to identify the different geographical strains according to the differences in the amino acid sequences. The present study aimed to investigate the genetic diversity of A. marginale in Angus beef cattle naturally infected during an outbreak of the disease. Twenty cattle, aged 6 to 9 months, from a farm in the city of Itú, state of São Paulo, were followed for four months and four blood samples were taken. Serum samples were subjected to the Indirect Immunoenzymatic Assay (iELISA) to detect antibodies IgG anti-A. marginale. The eighty whole blood samples obtained were subjected to DNA extraction, quantitative real-time PCR (qPCR) for the msp1β gene, semi-nested PCR (snPCR) for the msp1α gene, cloning of the target fragment and sequencing by the Sanger method. The obtained sequences were subjected to genetic diversity analysis using the RepeatAnalyzer software. The Indirect Immunoenzymatic assay (iELISA) revealed low seroprevalence in the sampled animals despite 100% positivity in the qPCR, with quantification between 103 and 107 number of DNA c... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The biossensores constitute analytical important devices for the clinical diagnosis of many diseases, enabling real-time analysis, with high specificity and sensitivity. Accordingly, the aim of this study was to develop a platform functionalized with the poly (3- hydroxybenzoic acid), to detection of nitrogenous bases, oligonucleotides and antibodies against the surface protein (Am1) of Anaplasma marginale.These biological recognition elements were immobilized on the functionalized platform and the biosensor was characterized by electrochemical and spectroscopic techniques. The detections of the antigen-antibody interaction were conducted using the signal obtained from the oxidation of protein interleaver, 4- aminoantipyrine (4 -AAP), using voltammetry technique of differential pulse.Theoretical chemistry studies were employed to analyze the Am1 interactions with the sensor platform and the web server model RaptorX to infer three-dimensional structure of the membrane proteins of A. marginale.The molecular modeling was conducted from methods semi- empirical, DFT and molecular mechanics.The transitions redoxes of polymer were classified as almost reversible, with band gap of 1.2 V, characteristic of semiconductor materials.The detections of poly CT and antibodies of A. marginale, using the graphite electrode functionalized with the probes, poly GA and Am1 respectivamente, were 66% higher than the graphite electrode not functionalized.The protein of superfice Am1 presented a structure stable in beta-sheet, while Am2 presented an unstable structure in α -helix.In electrochemical impedance spectroscopy was possible qualitatively differentiate the functionalized platform with: Am1, IgG+, IgG- and interfering. The time of storage of the immunosensor was satisfactory, with reduced peak current by 35%, after 90 days. These results demonstrate the excelent applicability of functionalized platform for the development of immunosensor for diagnosis of bovine anaplasmosis, leaving only the economic feasibility studies for commercial deployment of the said immunosensor. / Os biossensores constituem-se como dispositivos analíticos importantes para o diagnóstico clínico de inúmeras doenças, por permitirem uma análise em tempo real, além de suas altas especificidades e sensibilidades. Nesse sentido, o objetivo desse estudo foi desenvolver uma plataforma funcionalizada com o poli (ácido 3-hidroxibenzóico), para a detecção de bases nitrogenadas, oligonucleotídeos e anticorpos contra a proteína de superfície (Am1) da Anaplasma marginale. Esses elementos de reconhecimento biológico foram imobilizados na plataforma funcionalizada e o biossensor foi caracterizado por técnicas eletroquímicas e espectroscópicas. As detecções da interação antígeno-anticorpo foram realizadas através do sinal obtido da oxidação do intercalador de proteína, 4-aminoantipirina (4-AAP), utilizando a técnica de voltametria de pulso diferencial. Estudos de química teórica foram empregados para análise das interações da Am1 com a plataforma sensora e o modelo web server RaptorX para inferência da estrutura tridimensional das proteínas de membrana da A. marginale. A modelagem molecular foi realizada a partir de métodos semi-empíricos, DFT e mecânica molecular. As transições redoxes do polímero foram classificadas como quase reversíveis, com band gap de 1,2 V característico de materiais semicondutores. As detecções de poli CT e anticorpos da A. marginale, empregando o eletrodo de grafite funcionalizado com as sondas, poli GA e Am1 respectivamente, foram 66 % superior a do eletrodo de grafite não funcionalizado. A proteína de superfície Am1 apresentou uma estrutura estável em folha-beta e a Am2 uma estrutura instável em α-hélice. Na espectroscopia de impedância eletroquímica foi possível diferenciar qualitativamente a plataforma funcionalizada com: Am1, IgG+, IgG- e interferente. O tempo de estocagem do imunossensor mostrou-se satisfatório, com redução do pico de corrente em 35 %, após 90 dias. Esses resultados demonstraram a excelente aplicabilidade da plataforma funcionalizada para o desenvolvimento de imunossensor para diagnóstico da anaplasmose bovina, restando apenas os estudos de viabilidade econômica para implantação comercial do referido imunossensor. / Doutor em Química

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In this study we investigated the electropolymerization isomers hydroxyphenylacetic acid, for their application in the construction of polymeric systems, by immobilizing synthetics molecules for development of biological sensors. The graphite electrodes electrochemically modified were characterized for morphology and electrochemical behavior showing that the poly(2-hydroxyphenylacetic acid), poly(3-hydroxyphenylacetic acid) and poly(4-hydroxyphenylacetic) are electroactive, and the latter showed a lower yield in electrosynthesis in agreement with the images of atomic force microscopy showed that the surface of graphite electrodes were changed less with this material compared to its isomers. The electrochemical impedance spectra of poly (4-hydroxyphenylacetic acid) showed that this material is more resistive with respect to its other isomers which are more conductive in accordance with the values of current and voltage shown by tests ion exchange the probes positive and negative. The ratio between the masses electrodeposited and the loads required to carry out the redox process these materials remained constant demonstrating that the same number of electrons are involved in reduction and oxidation of these materials according to the diagnostic reversibility applied by cyclic voltammetry are unanimously reversible systems, however poly(3-hydroxyphenylacetic acid) was more stable during repeated cycling electrochemically in perchloric acid. The optimized tridimensional structures justify the electrochemical and morphologic behavior of these three platforms, wherein the poly(2-hydroxyphenylacetic acid) and poly(3-hydroxyphenylacetic acid) have structures with a more ordered arrangement, unlike poly(4-hydroxyphenylacetic acid), which has a rather more disordered structure and therefore more resistive, while isomers are more conductors. The mechanistic proposal begins with the anodic oxidation of monomers whose square wave voltammetry experiments showed the loss of an electron. The couplings between cation radicals promote a formation of ether leaving the acetate groups exposed on the structure. The pairing occurs between the phenolic oxygen and carbon of the aromatic ring whose potential were studied by spin density and consistent with the resonance structures of the cation-radical that are in the suggested mechanisms. In tests incorporation of nitrogenous bases found that poly(3-hydroxyphenylacetic acid) also proved more effective in the retention of the same and for this reason associated with their better electrochemical behavior described above, it was selected among others for applying isomers polimeric systems by immobilizing synthetics molecules by physical adsorption. In the first system froze synthetic oligonucleotides that mimic fragments of DNA from the bacterium Neisseria meningitidis able to recognize their genomic DNA in samples of pure cultures by differential pulse voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy, and this latter showed a better response sensitivity signal in relation to the increasing concentration of the target. In the second system, there immobilization of synthetic peptides compatible to the cell membrane of Anaplasma marginale able to selectively recognize antibodies in their sera samples from cattle. The images made by atomic force microscopy of the two procedures backing the effective recognition of both polimeric systems developed for the detection of Neisseria meningitidis and Anaplasma marginale bacteria causing bacterial meningitis and bovine anaplasmosis, respectively. / Neste trabalho foi investigada a eletropolimerização dos isômeros do ácido hidroxifenilacético, visando sua aplicação na construção de sistemas poliméricos, através da imobilização de moléculas sintéticas para o desenvolvimento de sensores biológicos. Os eletrodos de grafite eletroquimicamente modificados foram caracterizados quanto à morfologia e o comportamento eletroquímico, evidenciando que o poli(ácido 2-hidroxifenilacético), poli(ácido 3-hidroxifenilacético) e poli(ácido 4-hidroxifenilacético) são eletroativos, sendo que este último apresentou um menor rendimento em massa na eletrossíntese, em concordância com as imagens de microscopia de força atômica, que mostraram que a superfície dos eletrodos de grafite foram menos alteradas com este material em relação aos seus isômeros. Os espectros de impedância eletroquímica do poli(ácido 4-hidroxifenilacético), mostraram que esse material é mais resistivo em relação aos seus outros isômeros que são mais condutores em concordância com os valores de corrente e potencial evidenciados nos ensaios de troca iônica nas sondas positiva e negativa. A relação entre as massas eletrodepositadas e as cargas necessárias para realizar o processo redox nestes materiais foi constante, indicando que o mesmo número de elétrons está envolvido na oxidação e redução destes materiais, que se comportaram como sistemas reversíveis segundo os diagnósticos de reversibilidade aplicados por voltametria cíclica, todavia o poli(ácido 3-hidroxifenilacético) mostrou-se mais estável eletroquimicamente durante sucessivas ciclagens em ácido perclórico. As estruturas tridimensionais otimizadas justificam o comportamento eletroquímico e morfológico destas três plataformas, em que os poli(ácido 2-hidroxifenilacético) e poli(ácido 3-hidroxifenilacético) apresentam estruturas com um arranjo mais ordenado e por isso são mais condutores ao contrário do poli(ácido 4-hidroxifenilacético) que tem uma estrutura mais desordenada, e por isso mais resistiva. A proposta mecanística inicia-se com a eletrooxidação dos monômeros, cujas investigações experimentais por voltametria de onda quadrada, mostraram a perda de um elétron. Os acoplamentos entre os cátions radicais promovem uma formação de éter deixando os grupos acetato expostos na estrutura. O emparelhamento ocorre entre o oxigênio fenólico e carbonos do anel aromático, cujas possibilidades foram estudadas pela densidade de spin e concordantes com as estruturas de ressonância dos cátions-radicais que estão nos mecanismos sugeridos. Nos testes de incorporação de bases nitrogenadas, verificou-se que o poli(ácido 3-hidroxifenilacético) mostrou-se mais eficiente na retenção das mesmas e por este motivo associado ao seu melhor comportamento eletroquímico, foi selecionado dentre os outros isômeros como o sistema polimérico mais adequado para aplicação nas detecções, através da imobilização por adsorção física de moléculas sintéticas de reconhecimento. No primeiro sistema, imobilizou-se oligonucleotídeos sintéticos compatíveis a fragmentos de DNA da bactéria Neisseria meningitidis, capazes de reconhecer seu DNA genômico em amostras por voltametria de pulso diferencial e espectroscopia de impedância eletroquímica, sendo que esta última mostrou uma melhor sensibilidade de resposta de sinal em relação ao aumento de concentração do alvo. No segundo sistema, ocorreu a imobilização de peptídeos sintéticos compatíveis à membrana celular da Anaplasma marginale, capazes de reconhecer seletivamente seus anticorpos em amostras de soros sanguíneos bovinos. As imagens feitas por microscopia de força atômica, respaldam o reconhecimento eficaz de ambos os sistemas poliméricos desenvolvidos para detecção das bactérias Neisseria meningitidis e Anaplasma marginale, causadores de meningite bacteriana e anaplasmose bovina, respectivamente. / Doutor em Química