Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les glioblastomes sont des tumeurs du système nerveux central hautement létaux. Ils se caractérisent par leur grande infiltration dans les tissus avoisinants. Ils modifient les vaisseaux sanguins préexistants et ils migrent d’une façon perivasculaire. Cette cooption vasculaire est un processus entraînant l’expression d’Angiopoietine-2 (Angpt2) par des cellules endothéliales et sa liaison au récepteur Tie2. Le premier objectif de cette étude était d’examiner le potentiel thérapeutique de deux protéines qui pourraient interférer avec Angpt2, à savoir Angpt3 et la partie soluble extracellulaire du récepteur Tie2 (sTie2). Le deuxième objectif était de développer des vecteurs lentiviraux capables d’exprimer ces protéines, tout en offrant la possibilité d’identifier et détruire les cellules génétiquement modifiées. À cette fin, nous avons construit un vecteur contenant une cassette bicistronique qui exprime le marqueur amélioré de la protéine fluorescente verte (EGFP) fusionnée au gène suicide provenant du virus herpès simplex de type I-thymidine kinase (HSVtk). Les cellules du gliome GL261 transduites avec ce vecteur pourraient être suivies et tuées sur demande par l’administration de la prodrogue ganciclovir, soit in vitro, soit après l'implantation dans le cerveau des souris. Malgré l’expression des hauts niveaux d’Angpt3 et de sTie2 obtenus avec ce vecteur, nous avons observé qu’Angpt3 augmente la déstabilisation capillaire et la croissance de gliomes, alors que sTie2 n’exerce aucun effet. Globalement, cette étude a permis de comprendre l’importance de la voie de signalisation de Tie2 dans le développement des gliomes et le rôle d’Angpt3, mais suggère que ni cette molécule ni sTie2 soient des agents efficaces contre les gliomes malins. Cette étude fournit également le prototype d’un vecteur lentiviral pour la thérapie génique plus sécuritaire. / Glioblastomas are highly lethal tumors of the central nervous system characterized by large spread into the surrounding tissues. They modify and migrate along pre-existing blood vessels. This vascular cooption is a process involving the release of angiopoietin-2 (Angpt2) from endothelial cells and binding to the Tie2 receptor. The first goal of this study was to examine the therapeutic potential of two proteins that could interfere with Angpt2, namely Angpt3 and the soluble extracellular domain of Tie2 (sTie2). The second goal was to develop a lentiviral vector capable of delivering such proteins while offering the possibility to identify and destroy the genetically modified cells. To this end, we designed a bicistronic construct expressing the marker enhanced green fluorescent protein (EGFP) fused to the suicide gene herpes simplex virus 1-thymidine kinase (HSVtk). GL261 glioma cells transduced with this vector could be tracked and killed on command by the administration of the prodrug ganciclovir, either in vitro or after implantation into mouse brains. High levels of Angpt3 or sTie2 could be achieved with this vector; however, Angpt3 increased capillary destabilization and glioma growth, whereas sTie2 exerted no effect. Overall, this study helps to understand the importance of the Tie2 signaling pathway in glioma development and the role of Angpt3, but suggests that neither this molecule nor sTie2 are effective agents against malignant gliomas. This study also provides a lentiviral vector design for safer gene therapy.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La dérégulation de la formation et l'intégrité des vaisseaux sanguins peut conduire à un état pathologique tel qu’observé dans de nombreuses maladies ischémiques telles que: la croissance de tumeur solide, l’arthrite rhumatoïde, le psoriasis, les rétinopathies et l'athérosclérose. Par conséquent, la possibilité de moduler l'angiogenèse régionale chez les patients souffrant d'ischémie est cliniquement pertinente. Un élément clé dans l'induction de l'angiogenèse pathologique est une inflammation qui précède et accompagne la formation des nouveaux vaisseaux. Ce phénomène est démontré par l'augmentation de la perméabilité vasculaire et le recrutement de monocytes/ macrophages et cellules polynucléaires (neutrophiles). En collaboration avec d'autres groupes, nous avons montré que différents facteurs de croissance tels que le facteur de croissance endothélial vasculaire et les angiopoïétines peuvent non seulement promouvoir l'angiogenèse mais aussi induire diverses étapes connexes au processus de la réaction inflammatoire, y compris la synthèse et la libération des médiateurs inflammatoires et la migration des neutrophiles. Les objectifs de notre étude étaient d'adresser si le vascular endothelial growth factor (VEGF) et les angiopoïétines (Ang1 et Ang2) sont capables de promouvoir la formation des nouveaux vaisseaux sanguins au fil du temps et d'identifier la présence de différentes cellules inflammatoires dans ce processus. Des éponges d'alcool polyvinylique stérilisées et imbibées de Matrigel appauvri en facteur de croissance (contenant PBS, VEGF, Ang1 ou Ang2 (200 ng/200 μl)) ont été insérées sous la peau de souris C57/Bl6 anesthésiées. Les éponges ont ensuite été retirées aux jours 4, 7, 14 ou 21 après la procédure pour des analyses histologiques, immunohistologiques et cytométriques. La formation des nouveaux vaisseaux a été validée par la coloration au Trichrome de Masson et des analyses histologiques et immunohistologiques contre les cellules endothéliales (anti-CD31). De plus, la maturation des vaisseaux a été démontrée par la coloration séquentielle contre les cellules endothéliales (anti-CD31) et musculaires lisses (anti-alpha-actine). Nous avons effectué la même procédure pour caractériser le recrutement de neutrophiles (anti-MPO), et de macrophages (anti-F4/80). Afin de mieux délimiter la présence de différents sous-ensembles de leucocytes recrutés dans les éponges, nous avons utilisé une technique de cytométrie en flux sur des préparations de cellules isolées à partir de ces éponges. Nous avons observé que le VEGF et les angiopoïétines favorisent le recrutement de cellules endothéliales et la formation de nouveaux vaisseaux plus rapidement qu’en présence de PBS. Une fois formé au jour 7, ces nouveaux vaisseaux restent stables en nombre, et ne subissent pas une réorganisation importante de leur surface. Ces vaisseaux maturent grâce au recrutement et au recouvrement par les cellules musculaires lisses des néovaisseaux. En outre, le microenvironnement angiogénique est composé de cellules inflammatoires, principalement de neutrophiles, macrophages et quelques cellules de type B et T. Donc, le VEGF, l’Ang1 et l’Ang2 induisent séparément la formation et la stabilisation de nouveaux vaisseaux sanguins, ainsi que le recrutement de cellules inflammatoires avec des puissances différentes et une action temps-dépendante dans un modèle d’éponge/Matrigel. / A deregulation in blood vessel formation and integrity can lead to a pathological state as seen in many ischemic diseases such as tumor growth, rheumatoid arthritis, psoriasis, retinopathies and atherosclerosis. Therefore, the possibility to modulate regional angiogenesis in patients suffering from ischemia is clinically relevant. One key feature in the induction of pathological angiogenesis is that inflammation precedes and accompanies the formation of neovessels as evidenced by increased vascular permeability and the recruitment of monocytes/macrophages and neutrophils. Along with other groups, we have previously shown that selected growth factors, namely vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiopoietins (Ang1 and Ang2) can not only promote angiogenesis but can also induce inflammatory responses, including the synthesis/release of inflammatory mediators and neutrophil migration. The objectives of our study were to address how VEGF and angiopoietins are capable of promoting the formation of neovessels over time and to identify the presence of different inflammatory cells in this event. Sterilized polyvinyl alcohol (PVA) sponges soaked in growth factor-depleted Matrigel containing PBS, VEGF, Ang1 or Ang2 (200 ng/200 μl) were subcutaneously inserted into anesthetized C57/Bl6 mice. The sponges were then removed at day 4, 7, 14 or 21 post-procedure for histological, immunohistological (IHC) and flow cytometric analyses. The formation of neovessels was validated by Masson’s Trichrome staining and by IHC against endothelial cells (anti-CD31) and its maturation was elucidated by sequential IHC staining against endothelial cells and smooth muscle cells (anti-alpha-actin). Likewise, we performed IHC to characterize the recruitment of neutrophils (anti-MPO), and macrophages (anti-F4/80). To better delineate the presence of different leukocyte subsets recruited in the sponges, we utilized multicolor flow cytometry procedure on single cell preparation from the sponges. We observed that both VEGF and angiopoietins favors the recruitment of endothelial cells and the formation of new vessels more rapidly as compared to PBS. Once formed by day 7, these neovessels remain stable in number, do not undergo reorganization in their cross sectional area and mature through the recruitment and ensheathing of smooth muscle cells. In addition, the angiogenic microenvironment is comprised of inflammatory cells, mainly neutrophils, macrophages, and sparsly T and B cells. Hence, VEGF, Ang1 and Ang2 individually promote the formation and stabilisation of neovessels and the venue of inflammatory cells with different potency in a temporal dependant manner in a sponge/Matrigel model.

Nous avons identifié l’expression du récepteur des angiopoïétines, le récepteur Tie2, à la surface des neutrophiles humains. De plus, nous avons démontré qu’Ang1 et Ang2 induisent des activités pro-inflammatoires sur les neutrophiles, comme l’adhésion aux cellules endothéliales (CEs) et la synthèse du facteur d’activation plaquettaire (PAF). Puisque le PAF augmente la viabilité des neutrophiles et que les angiopoïétines modulent la survie des CEs, nous avons voulu évaluer l’effet des angiopoïétines sur la survie des neutrophiles. Des neutrophiles humains ont été isolés à partir du sang de donneurs sains en accord avec le comité d’éthique de l’Institut de cardiologie de Montréal. La viabilité des neutrophiles a été mesurée par cytométrie en flux à l’aide de marqueurs d’apoptose et de nécrose. Un traitement avec des témoins positifs, soit l’interleukine 8 (IL-8; 25 nM) ou le PAF (100 nM), a augmenté la survie basale des neutrophiles de 34 et 27%, respectivement. De plus, un traitement avec Ang1 (1 pM – 10 nM) a augmenté la survie des neutrophiles jusqu’à 35%, alors qu’Ang2 n’a eu aucun effet. La combinaison de l’IL-8 ou du PAF avec Ang1 (10 nM) a eu un effet additif sur la viabilité des neutrophiles et a augmenté la survie de 56 et 60%, respectivement. Un prétraitement avec des anticorps bloquants contre l’IL-8 a permis d’inhiber l’activité anti-apoptotique de l’IL-8 et d’Ang1 de 92 et 80%, respectivement. Ainsi, notre étude est la première à démontrer la capacité d’Ang1 à prolonger la viabilité des neutrophiles, qui est principalement causée par la relâche d’IL-8. / We reported the expression of angiopoietin receptor Tie2 on the surface of human neutrophils. In addition, we reported that Ang1 and Ang2 are both capable to promote pro-inflammatory activities in neutrophils, namely their adhesion onto endothelial cells (ECs) and platelet-activating factor (PAF) synthesis. PAF is known to promote pro-survival activity on neutrophils and since both angiopoietins can modulate ECs viability, we addressed whether Ang1 and/or Ang2 could modulate neutrophil viability. Human neutrophils were isolated from blood of healthy volunteers in accordance with the guidelines of the Montreal Heart Institute’s ethical committee. Neutrophil viability was assessed by flow cytometry using apoptotic and necrotic markers. Treatment with anti-apoptotic mediators such as interleukin 8 (IL-8; 25 nM) and PAF (100 nM) increased neutrophil basal viability by 34 and 27%, respectively. In addition, treatment with Ang1 (1 pM – 10 nM) increased neutrophil viability by up to 35%, while Ang2 had no effect. Combination of IL-8 or PAF with Ang1 (10 nM) provided an additive effect on neutrophil viability and further increased viability by 56 and 60%, respectively. Pretreatment of the neutrophils with blocking anti-IL-8 antibodies inhibited the anti-apoptotic effect of IL-8 and Ang1 by 92 and 80%, respectively. In summary, our data are the first one to report Ang1 pro-survival activity on neutrophils, which is mainly driven through IL-8 release.

L’angiogenèse, caractérisée par la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants, est un processus accompagné par l’inflammation, impliquant la synthèse et la relâche de différents facteurs de croissance par les cellules inflammatoires. Parmi ces facteurs, seuls le vascular endothelial growth factor (VEGF) et les angiopoïétines (Ang1 et Ang2) peuvent participer à la régulation de l’inflammation et de l’angiogenèse. La famille des angiopoïétines comporte quatre membres, desquels l’Ang1 et l’Ang2 ont été les plus étudiés. Ces deux médiateurs inflammatoires sont capables d’activer le récepteur Tie2, dont l’expression a initialement été rapportée sur les cellules endothéliales (CE). Notre laboratoire a été le premier à démontrer l’expression de Tie2 à la surface des neutrophiles, ainsi que sa capacité, suite à son activation par l’Ang1 ou l’Ang2, à induire la synthèse du facteur d’activation plaquettaire (PAF), l’activation de la β2-intégrine, la migration des neutrophiles ainsi que leur adhésion aux CE. D’autres études ont montré que les CE emmagasinent et relâchent le VEGF et l’Ang2, tandis que les péricytes et les cellules musculaires lisses contiennent l’Ang1. Puisque les neutrophiles relâchent le VEGF et que les deux angiopoïétines ont la capacité d’activer Tie2 sur ces derniers, nous avons voulu déterminer si les neutrophiles contiennent l’Ang1 et/ou l’Ang2 et si elles peuvent être relâchées suite à une stimulation avec des agonistes proinflammatoires. Nous avons découvert que l’Ang1, mais pas l’Ang2 est présente dans les neutrophiles, et qu’elle est relâchée suite à une stimulation au phorbol myristate acetate (PMA). De plus, nous avons démontré que l’Ang1 est localisée au niveau du cytosol et que sa relâche est calcium-indépendante, contrairement au VEGF, qui est localisé dans les granules β et sa relâche est calcium-dépendante. Cette étude démontre pour la première fois l’expression et la localisation de l’Ang1 dans les neutrophiles. Une récente étude effectuée dans notre laboratoire a démontré que les angiopoïétines induisent la migration des neutrophiles en activant le récepteur Tie2 et la voie de la PI3K. De plus, les angiopoïétines ont potentialisé la migration induite par l’IL-8. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que l’Ang1 et/ou l’Ang2 seraient capables d’induire la relâche et/ou la synthèse de l’IL-8 par les neutrophiles. Nous avons démontré pour la première fois, la capacité de l’Ang1 à induire l’expression de l’ARNm, ainsi que la synthèse et la relâche d’IL-8 par les neutrophiles. Cependant, un traitement avec l’Ang2 seule ou en combinaison avec l’Ang1 n’a eu aucun effet sur les activités mentionnées ci-dessus. Nous avons aussi observé que la synthèse et la relâche d’IL-8 induite par l’Ang1 requièrent la transcription de l’ADN en ARNm, suivie par la stabilisation de ce dernier, qui ultimement induit la traduction de l’ARNm de l’IL-8 en sa protéine. Finalement, nous avons démontré que la stimulation des neutrophiles avec l’Ang1 induit ces activités en activant la voie de la p42/44 MAPK, tout en étant indépendantes de la p38 MAPK et la PI3K/Akt. Ces résultats sont en lien direct avec une récente étude dans laquelle nous avons observé que l’Ang1, mais pas l’Ang2 est capable d’augmenter la survie des neutrophiles via la relâche d’IL-8. / Angiogenesis is known as the formation of new blood vessels from pre-existent ones. This process is accompanied by inflammation, which involves the synthesis and release of numerous growth factors by inflammatory cells. Among the growth factors involved in these activities, only the vascular endothelial growth factor (VEGF) and the angiopoietins (Ang1 and Ang2) can modulate both the inflammatory and the angiogenic processes. The angiopoietins family has four fully characterized members, from which Ang1 and Ang2 have been the most extensively studied. Ang1 and Ang2 are both capable to activate the receptor Tie2, initially discovered on the endothelial cell (EC) surface. We were the first group to report the expression of Tie2 on neutrophils along with its activation by Ang1 and Ang2 which can enhance platelet-activating factor (PAF) synthesis, β2-integrin activation, neutrophil migration and adhesion onto EC. Other studies have shown that EC have endogenous stores of VEGF and Ang2, whereas pericytes and smooth muscle cells contain intracellular pools of Ang1. Since neutrophils can release VEGF and that both angiopoietins can activate Tie2 receptor, we wanted to assess if neutrophils contain Ang1 and/or Ang2, and if so, investigate their capacity to be released under inflammatory stimuli. We observed that Ang1, but not Ang2, is found in the neutrophils and that it can be only released upon phorbol myristate acetate (PMA) stimulation. Moreover, using the nitrogen sub-cellular fractionation technique, we demonstrated that Ang1 is found in the cytosolic fraction and its release is calcium-independent, while VEGF is found in β-granules and its release is calcium-dependent. This study demonstrates for the first time the expression and release of Ang1 from the neutrophils and its localization in the cytosol. In one of our recent studies, we have shown that angiopoietins are capable to induce neutrophil migration through Tie2 activation and via the PI3K/Akt signalling pathway. Moreover, both angiopoietins were shown to potentiate IL-8-induced neutrophil migration. Thus, we sought to investigate the capacity of Ang1 and/or Ang2 to induce IL-8 synthesis and/or release from human neutrophils. We demonstrated for the first time, the capacity of Ang1 to induce IL-8 mRNA expression, along with its protein synthesis and release from the neutrophils. However, a treatment with Ang2, alone or in combination with Ang1, had no effect on these aforementioned activities. We also observed that Ang1-induced IL-8 protein synthesis and release requires the transcriptional mechanism from IL-8 DNA to mRNA, followed by the mRNA stabilization, which ultimately enhances its translation into IL-8 protein. Finally, we also observed that neutrophil stimulation with Ang1 enhances IL-8 mRNA expression, protein synthesis and release by activating the p42/44 MAPK signalling pathway, while being independent from p38 MAPK and PI3K/Akt. These results are in line with one of our recent studies, in which we observed that Ang1, but not Ang2, is capable to enhance neutrophil survival, by diminishing their apoptosis through the release of IL-8 by the neutrophils.

De par sa présence dans tous les vaisseaux sanguins, l'endothélium joue un rôle clef dans le processus d’hémostase, tant par sa libération de facteurs anticoagulants que par ses changements protéiques qui permettent à l’organisme de déclencher la réparation tissulaire. La fonction anticoagulante de l’endothélium peut être mise en défaut en cas d’atteinte de son intégrité, entrainant la formation de thrombus, le rejet précoce de greffes ou encore l’induction de l’athérosclérose. L’intégrité de l’endothélium est donc capitale pour la prévention de nombreuses maladies cardiovasculaires. Chez l’adulte, les cellules endothéliales (CE), normalement quiescentes, sont rapidement activées en cas d’hypoxie ou d’inflammation, leur permettant ainsi d’amorcer le processus angiogénique comme suit: Tout d’abord, l’induction de l’hyperperméabilité vasculaire permet l’extravasation des protéines plasmatiques. Ensuite, la dégradation de la lame basale par des métalloprotéases permet aux CE de se détacher, de proliférer, de migrer et de s’organiser pour former l’ébauche du futur vaisseau. La dernière étape consiste en la maturation du vaisseau, c’est-à-dire son recouvrement par des cellules murales, telles que les cellules musculaires lisses et les péricytes. Ces processus sont régulés par de nombreux facteurs angiogéniques tels que les membres de la famille Notch, du vascular endothelial growth factor (VEGF), du fibroblast growth factor (FGF), des angiopoïétines, et des matrix metalloproteases (MMP). L’angiogenèse pathologique, soit une insuffisance ou un excès de vascularisation, est impliquée dans les blessures chroniques, les accidents cardiovasculaires, les pathologies coronariennes artérielles, les pathologies tumorales, l’arthrite rhumatoïde, la rétinopathie diabétique, l’athérosclérose, le psoriasis et l’asthme. Ces pathologies sont souvent issues d’une dérégulation de l’activité endothéliale, fréquemment observée conjointement à l’expression continue de molécules d’adhésion leucocytaires, à l’augmentation de la perméabilité vasculaire, et aux anomalies de la vasoréactivité. L’activation non-contrôlée de l’endothélium entraîne ainsi une inflammation chronique et la formation de structures vasculaires anarchiques. Les premiers leucocytes à répondre à l’appel inflammatoire sont les neutrophiles. Equippées d’une panoplie de produits antibactériens puissants mais aussi nocifs pour les tissus qui les entourent, ces cellules polylobées participent à chaque étape du processus inflammatoire, depuis l’induction de l’hyperperméabilité vasculaire jusqu’à la résolution. En effet, grâce à leurs récepteurs, les neutrophiles détectent et interprètent les signaux biochimiques présents dans la circulation et à la surface de l’endothélium, et libèrent aussi leurs propres médiateurs tels le VEGF, les MMP, et l’interleukine-8 (IL-8), dont les effets sont à la fois paracrines et autocrines. Existent-ils d’autres modulateurs typiques de la fonction endothéliale capables d’influencer le comportement des neutrophiles? En effet, notre laboratoire a démontré que chez l’humain, une stimulation directe aux angiopoïétines incitait les neutrophiles à adhérer aux CE, à migrer, à synthétiser et à relâcher l’IL-8, voire même à vivre plus longtemps. La présence du récepteur des angiopoïétines, Tie2, à la surface des neutrophiles laisse présager que la famille possèderait d’autres fonctions leucocytaires encore non-identifiées. Par ailleurs, dans un modèle classique de l’angiogenèse in vivo (matrigel), nous avons observé que sous l’effet du FGF1 et 2, les ébauches des nouveaux vaisseaux étaient parfois accompagnées d’une infiltration de cellules granulocytaires. Ainsi, en partant de ces observations, l’objectif de nos études (présentées ci-après) était d’approfondir nos connaissances sur la relation entre neutrophiles et facteurs angiogéniques, notamment les FGF et les angiopoïétines. Par tests in vitro, nous avons confirmé que les neutrophiles humains exprimaient plusieurs récepteurs du FGF (FGFR1-4) d’une façon hétérogène, et qu’ils migraient vers un gradient des ligands FGF1 et 2. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés aux voies de signalisation inflammatoires activées par les ligands FGF1, FGF2, Ang1 et Ang2. Grâce à une stratégie génique ciblant 84 gènes inflammatoires, nous avons identifié plusieurs cibles d’intérêt touchées par Ang1, dont certains membres de la famille de l’IL-1, alors qu’aucun des gènes testés n’avait changé de façon significative sous l’effet des FGF ou d’Ang2. Suite à des cinétiques approfondies, nous avons démontré qu’Ang1 stimulait la transcription de l’ARN messager de l’IL-1β, et augmentait simultanément la quantité de protéine immature (pro-IL-1β; inactive) et clivée (IL-1β « mature »; active). En parallèle, Ang1 augmentait la sécrétion de l’antagoniste naturel de l’IL-1β, l’IL-1RA, sans pour autant stimuler la relâche de l’IL-1β. A l’instar des endotoxines bactériennes dont les effets liés à l’IL-1 dépendaient de la kinase p38, ceux d’Ang1 découlaient presque entièrement des voies de signalisation du p42/44. / Endothelial cells (ECs) form a monolayer that lines the inside of all blood vessels; thus, as the first barrier that separates blood elements from all things that fall beyond the blood vessel, ECs are strategically placed to play a central role in many essential physiological processes. While it is found mostly in a quiescent state in adult organisms, the endothelium retains a high level of plasticity that allows it to react to stimulus and dynamically control the passage of blood components to and from the bloodstream. For instance, upon detecting an activating angiogenic signal, ECs forgo their quiescence and undergo biochemical and structural changes necessary for the initiation of angiogenesis. Thus, activated ECs down-regulate their own expression of junctional molecules and secrete proteins to digest the extracellular matrix (ECM), thereby giving them the space to proliferate and migrate. Relaxing endothelial junctions also increases permeability, opening up the doorway for leukocyte infiltration. These cells can then modulate angiogenesis via their own set of mediators. Though the instigating stimuli may differ, the biochemical sequence of events that initiates angiogenesis is also common to the inflammatory response. In the latter case, changes in EC biochemistry include the release of chemotactic agents and expression of surface adhesion molecules, increasing the efficiency of leukocyte infiltration, particularly those of the myeloid lineage. Evidently, because angiogenesis and inflammation can be initiated by the same sequence of events, they will inevitably share effector molecules. Of the recruited leukocytes, neutrophils are generally the first responders at the site of inflammation, contributing mediators that propagate and eventually resolve inflammation. We and other groups have shown that endothelial modulators such as angiogenic growth factors exert a direct action on neutrophil activity independently of the presence of the endothelium. In particular, our laboratory has shown that members of the angiopoietin family and their receptor Tie2 are expressed by neutrophils and are capable of activating neutrophil intracellular signalling pathways that impact their survival, adhesion, migration, and protein production. The ability of angiopoietins to directly engage neutrophils illustrates an intimate link between angiogenesis and inflammation, and provides an explanation for why vascular pathologies are often accompanied by an exacerbated inflammatory response. In the studies presented herein, we sought to expand our understanding of the relationship between angiogenic growth factors and neutrophil behavior. In a pilot experiment using in vivo subcutaneous matrigel plugs, short-term treatment with fibroblast growth factors (FGF) 1 and 2 resulted in significant neovascularization; interestingly, the tissues surrounding the matrigel plug showed an increase in polymorphonuclear cell infiltration. Encouraged by the paucity of information in the literature regarding FGF-neutrophil interaction, we looked at the expression of FGF receptors (FGFRs) on neutrophils from different human donors, as well as the ability of FGFs to induce neutrophil chemotaxis. We demonstrated that the expression of FGFR was strongly dependent on genetic background: Overall, FGFR2 showed the highest incidence as a neutrophil cell-surface receptor, but none of the receptors were universally or uniformly expressed. Despite the genetic factor, neutrophils migrated in response to both FGF1 and FGF2 in vitro, suggesting that other neutrophil adaptors may be engaging FGFs. Given the shared ability of FGFs and angiopoietins (Ang) to induce neutrophil migration, we performed a wide-scale RNA assay to determine which genes were being engaged by the main ligands of both families. While none of FGF1, FGF2 or Ang2 had a strong effect on the 84 inflammatory cytokine genes tested (FGFs - unpublished data, 2011), at least two target genes belonging to the interleukin-1 (IL-1) family were significantly upregulated following Ang1 treatment. Further analysis showed that Ang1 not only stimulates gene transcription, but also translation and processing of the precursor of IL-1β (pro-IL-1β), and both precursor and mature proteins accumulate in the cell simultaneously. Interestingly, although no IL-1β is secreted from neutrophils after Ang1 or endotoxin (LPS) treatment, substantial quantities of the naturally occurring IL-1β antagonist (IL-1RA) are released, thereby tipping the balance in favor of inhibiting IL-1β activity. Finally, the activities of Ang1 on IL-1β and IL-1RA production and/or release are largely mediated by p42/44 MAPK; in contrast, the effects of LPS are driven by recruitment of p38.

Nous avons identifié l’expression du récepteur des angiopoïétines, le récepteur Tie2, à la surface des neutrophiles humains. De plus, nous avons démontré qu’Ang1 et Ang2 induisent des activités pro-inflammatoires sur les neutrophiles, comme l’adhésion aux cellules endothéliales (CEs) et la synthèse du facteur d’activation plaquettaire (PAF). Puisque le PAF augmente la viabilité des neutrophiles et que les angiopoïétines modulent la survie des CEs, nous avons voulu évaluer l’effet des angiopoïétines sur la survie des neutrophiles. Des neutrophiles humains ont été isolés à partir du sang de donneurs sains en accord avec le comité d’éthique de l’Institut de cardiologie de Montréal. La viabilité des neutrophiles a été mesurée par cytométrie en flux à l’aide de marqueurs d’apoptose et de nécrose. Un traitement avec des témoins positifs, soit l’interleukine 8 (IL-8; 25 nM) ou le PAF (100 nM), a augmenté la survie basale des neutrophiles de 34 et 27%, respectivement. De plus, un traitement avec Ang1 (1 pM – 10 nM) a augmenté la survie des neutrophiles jusqu’à 35%, alors qu’Ang2 n’a eu aucun effet. La combinaison de l’IL-8 ou du PAF avec Ang1 (10 nM) a eu un effet additif sur la viabilité des neutrophiles et a augmenté la survie de 56 et 60%, respectivement. Un prétraitement avec des anticorps bloquants contre l’IL-8 a permis d’inhiber l’activité anti-apoptotique de l’IL-8 et d’Ang1 de 92 et 80%, respectivement. Ainsi, notre étude est la première à démontrer la capacité d’Ang1 à prolonger la viabilité des neutrophiles, qui est principalement causée par la relâche d’IL-8. / We reported the expression of angiopoietin receptor Tie2 on the surface of human neutrophils. In addition, we reported that Ang1 and Ang2 are both capable to promote pro-inflammatory activities in neutrophils, namely their adhesion onto endothelial cells (ECs) and platelet-activating factor (PAF) synthesis. PAF is known to promote pro-survival activity on neutrophils and since both angiopoietins can modulate ECs viability, we addressed whether Ang1 and/or Ang2 could modulate neutrophil viability. Human neutrophils were isolated from blood of healthy volunteers in accordance with the guidelines of the Montreal Heart Institute’s ethical committee. Neutrophil viability was assessed by flow cytometry using apoptotic and necrotic markers. Treatment with anti-apoptotic mediators such as interleukin 8 (IL-8; 25 nM) and PAF (100 nM) increased neutrophil basal viability by 34 and 27%, respectively. In addition, treatment with Ang1 (1 pM – 10 nM) increased neutrophil viability by up to 35%, while Ang2 had no effect. Combination of IL-8 or PAF with Ang1 (10 nM) provided an additive effect on neutrophil viability and further increased viability by 56 and 60%, respectively. Pretreatment of the neutrophils with blocking anti-IL-8 antibodies inhibited the anti-apoptotic effect of IL-8 and Ang1 by 92 and 80%, respectively. In summary, our data are the first one to report Ang1 pro-survival activity on neutrophils, which is mainly driven through IL-8 release.

No description available.