Este trabalho teve por objetivo identificar e estudar a expressão de genes envolvidos na resposta imune a endoparasitas gastrintestinais em bovinos. Contagem periódica de ovos por grama de fezes (OPG) e análises de coproculturas foram realizadas para identificar animais resistentes e susceptíveis a endoparasitas gastrintestinais. A contagem de OPG permitiu identificar estes animais, sendo que o grupo susceptível apresentou uma contagem 20 vezes superior ao grupo resistente (P<0,001). Análises de coproculturas permitiram concluir que a infestação em bovinos foi mista, com a predominância dos gêneros Cooperia e Haemonchus e menor incidência de Oesophagostomum. Para a identificação dos genes, foi utilizada a metodologia EST (Expressed Sequence Tag) e foram construídas duas bibliotecas de clones de cDNA obtidos a partir da mucosa do abomaso, intestino delgado e nódulos linfáticos abomasais de bovinos resistentes (ER1) e susceptíveis (ES1) a nematódeos gastrintestinais. Foram geradas 2496 ESTs de cada biblioteca. Destas, 1664 e 1898 foram válidas para as bibliotecas ER1 e ES1, respectivamente. Dentre as 2323 sequências únicas obtidas foram identificados vários produtos gênicos relacionados à resposta imune, tais como moléculas de classe I e II do MHC, imunoglobulinas, interleucinas, lisozima e pepsinogênio. Para a quantificação da expressão de RNA mensageiro, foi utilizada a metodologia de transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase em tempo real, onde foram analisados 10 genes relacionados à polarização da resposta imune (as interleucinas IL- 2, IL-4, IL-8, IL-12p35 e IL-13, as citocinas TNF-&#945;, IFN-&#947;, MCP-1&#945; e MCP-2 e a glicoproteína mucina 1-MUC1). As análises de expressão gênica realizadas na mucosa do abomaso revelaram aumento nos níveis de RNAm para IL-4 (P<0,018), IL-13 (P<0,002) e diminuição de TNF-? (P<0,0001) nos animais resistentes; nos nódulos linfáticos abomasais houve aumento de IL-4 (P<0,019) nos animais resistentes e de IFN-&#947; (P<0,007) nos animais susceptíveis; no intestino delgado houve aumento de IL-4 (P<0,01) e IL-13 (P<0,045) nos animais resistentes, ao contrário de IL-2 (P<0,047), IL-12p35 (P<0,029), IFN-&#947; (P<0,004) e MCP-1 (P<0,03), cujos níveis de RNAm foram maiores nos animais susceptíveis. No abomaso dos animais resistentes houve menor expressão de pepsinogênio (P<0,025) e maior de lisozima (P<0,042). Em conclusão, a estratégia utilizada permitiu a identificação de vários genes envolvidos na resposta imune e a descoberta inédita de que Bos indicus resistentes a parasitas gastrintestinais apresentam uma resposta TH2 polarizada, em contraste aos animais susceptíveis, que apresentam uma resposta TH1. / The aim of this work was identify genes related to immune response to gastrointestinal nematodes in cattle. The periodic counts of eggs per gram (EPG) of feces and coproculture analysis were done to identify the resistant and susceptible animals. The EPG counts allowed us to identify these animals. It was twenty-fold higher in susceptible group (P<0.001). The coproculture analysis allowed us to conclude that the infestation is predominantly characterized byCooperia spp. and Haemonchus spp. and a low incidency of Oesophagostomum. To identify the genes, it was used the EST (Expressed Sequence Tags) methodology and constructed two cDNA libraries from abomasum, abomasum lymph nodules and small intestine from resistant (ER1) and susceptible (ES1) cattle. It was generated 2496 ESTs from each library. From these, 1664 and 1898 ESTs were valids to ER1 and ES1 libraries, respectively. Among the 2323 unique sequences were identifyed several genes related to immune response, such as MHC class I and II molecules, immunoglobulins, interleukins, lysozyme and pepsinogen. To study the gene expression, it was used the reverse transcription and real-time polymerase chain reaction methodology to quantify the messager RNA expression of 10 genes related to polarization of immune response (the interleukins IL-2, IL-4, IL-8, IL-12p35 e IL-13, the cytokines TNF-&#946;, IFN- &#947;, MCP-1&#946; and MCP-2 and the glycoprotein mucin 1-MUC1). The gene expression analysis in the abomasum reveled that IL-4 (P<0,018) and IL-13 (P<0,002) were up-regulated and TNF-&#946; (P<0,0001) was down-regulated in resistant group; in the abomasum lymph nodules IL-4 (P<0,019) and IFN-&#947; (P<0,007) were both up-regulated in resistant and susceptible group, respectively; in the small intestine IL-4 (P<0,01) and IL-13 (P<0,045) were up-regulated in resistant group and IL-2 (P<0,047), IL-12p35 (P<0,029), IFN-&#947; (P<0,004) and MCP-1 (P<0,03) were down-regulated in susceptible one. In the abomasum from resistant group, pepsinogen was down-regulated (P<0,025) and lysozyme was up-regulated (P<0,042). In conclusion, the strategy used allowed us to identify several genes involved in immune response and the inedit discovery that Bos indicus resistant to gastrointestinal nematodes present a TH2-type response, in contrast to susceptible animals that present a TH1-type response.

Para o sucesso das estratégias de manejo de Rhipicephalus (Boophilus) microplus (carrapato bovino) são necessários testes práticos, econômicos e confiáveis que possam detectar a presença de fenótipos resistentes a drogas em suas populações. O fipronil é um acaricida de uso relativamente recente não havendo testes padronizados para o diagnóstico de resistência do carrapato à molécula. No presente trabalho, foram padronizados bioensaios in vitro para esta finalidade: Teste de Imersão de Adultas, Teste de Imersão de Larvas e Teste de Pacote com Larvas. Os testes foram aplicados e, de forma inédita, populações resistentes foram diagnosticadas tanto no Brasil quanto no Uruguai. Ensaios com inibidores enzimáticos não evidenciaram participação importante de enzimas detoxificadoras no mecanismo de resistência. Foi demonstrada reação cruzada entre fipronil e lindano, não verificada para ivermectina. Em algumas situações, foi observado interferência do controle químico de pragas agrícolas no desenvolvimento de resistência dos carrapatos. / For the success of the strategies for the management of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (cattle tick), practical, economical and reliable tests are needed to detect the presence of drug-resistant phenotypes in their populations. Fipronil is a relatively new acaricide with no standardized tests for the diagnosis of tick resistance to this molecule. In this study, were standardized in vitro bioassays for this purpose: Adult Immersion Test, Larval Immersion Test and Larval Packet Test. The tests were applied and for the first time, resistant populations were diagnosed in Brazil and Uruguay. Tests with enzymatic inhibitors showed no significant involvement of detoxification enzymes in the mechanism of resistance. Cross-resistance was demonstrated between lindane and fipronil but not with ivermectin. In some situations, it was observed interference of the chemical control of agricultural pests in the development of resistance in ticks.

Este trabalho teve por objetivo identificar e estudar a expressão de genes envolvidos na resposta imune a endoparasitas gastrintestinais em bovinos. Contagem periódica de ovos por grama de fezes (OPG) e análises de coproculturas foram realizadas para identificar animais resistentes e susceptíveis a endoparasitas gastrintestinais. A contagem de OPG permitiu identificar estes animais, sendo que o grupo susceptível apresentou uma contagem 20 vezes superior ao grupo resistente (P<0,001). Análises de coproculturas permitiram concluir que a infestação em bovinos foi mista, com a predominância dos gêneros Cooperia e Haemonchus e menor incidência de Oesophagostomum. Para a identificação dos genes, foi utilizada a metodologia EST (Expressed Sequence Tag) e foram construídas duas bibliotecas de clones de cDNA obtidos a partir da mucosa do abomaso, intestino delgado e nódulos linfáticos abomasais de bovinos resistentes (ER1) e susceptíveis (ES1) a nematódeos gastrintestinais. Foram geradas 2496 ESTs de cada biblioteca. Destas, 1664 e 1898 foram válidas para as bibliotecas ER1 e ES1, respectivamente. Dentre as 2323 sequências únicas obtidas foram identificados vários produtos gênicos relacionados à resposta imune, tais como moléculas de classe I e II do MHC, imunoglobulinas, interleucinas, lisozima e pepsinogênio. Para a quantificação da expressão de RNA mensageiro, foi utilizada a metodologia de transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase em tempo real, onde foram analisados 10 genes relacionados à polarização da resposta imune (as interleucinas IL- 2, IL-4, IL-8, IL-12p35 e IL-13, as citocinas TNF-&#945;, IFN-&#947;, MCP-1&#945; e MCP-2 e a glicoproteína mucina 1-MUC1). As análises de expressão gênica realizadas na mucosa do abomaso revelaram aumento nos níveis de RNAm para IL-4 (P<0,018), IL-13 (P<0,002) e diminuição de TNF-? (P<0,0001) nos animais resistentes; nos nódulos linfáticos abomasais houve aumento de IL-4 (P<0,019) nos animais resistentes e de IFN-&#947; (P<0,007) nos animais susceptíveis; no intestino delgado houve aumento de IL-4 (P<0,01) e IL-13 (P<0,045) nos animais resistentes, ao contrário de IL-2 (P<0,047), IL-12p35 (P<0,029), IFN-&#947; (P<0,004) e MCP-1 (P<0,03), cujos níveis de RNAm foram maiores nos animais susceptíveis. No abomaso dos animais resistentes houve menor expressão de pepsinogênio (P<0,025) e maior de lisozima (P<0,042). Em conclusão, a estratégia utilizada permitiu a identificação de vários genes envolvidos na resposta imune e a descoberta inédita de que Bos indicus resistentes a parasitas gastrintestinais apresentam uma resposta TH2 polarizada, em contraste aos animais susceptíveis, que apresentam uma resposta TH1. / The aim of this work was identify genes related to immune response to gastrointestinal nematodes in cattle. The periodic counts of eggs per gram (EPG) of feces and coproculture analysis were done to identify the resistant and susceptible animals. The EPG counts allowed us to identify these animals. It was twenty-fold higher in susceptible group (P<0.001). The coproculture analysis allowed us to conclude that the infestation is predominantly characterized byCooperia spp. and Haemonchus spp. and a low incidency of Oesophagostomum. To identify the genes, it was used the EST (Expressed Sequence Tags) methodology and constructed two cDNA libraries from abomasum, abomasum lymph nodules and small intestine from resistant (ER1) and susceptible (ES1) cattle. It was generated 2496 ESTs from each library. From these, 1664 and 1898 ESTs were valids to ER1 and ES1 libraries, respectively. Among the 2323 unique sequences were identifyed several genes related to immune response, such as MHC class I and II molecules, immunoglobulins, interleukins, lysozyme and pepsinogen. To study the gene expression, it was used the reverse transcription and real-time polymerase chain reaction methodology to quantify the messager RNA expression of 10 genes related to polarization of immune response (the interleukins IL-2, IL-4, IL-8, IL-12p35 e IL-13, the cytokines TNF-&#946;, IFN- &#947;, MCP-1&#946; and MCP-2 and the glycoprotein mucin 1-MUC1). The gene expression analysis in the abomasum reveled that IL-4 (P<0,018) and IL-13 (P<0,002) were up-regulated and TNF-&#946; (P<0,0001) was down-regulated in resistant group; in the abomasum lymph nodules IL-4 (P<0,019) and IFN-&#947; (P<0,007) were both up-regulated in resistant and susceptible group, respectively; in the small intestine IL-4 (P<0,01) and IL-13 (P<0,045) were up-regulated in resistant group and IL-2 (P<0,047), IL-12p35 (P<0,029), IFN-&#947; (P<0,004) and MCP-1 (P<0,03) were down-regulated in susceptible one. In the abomasum from resistant group, pepsinogen was down-regulated (P<0,025) and lysozyme was up-regulated (P<0,042). In conclusion, the strategy used allowed us to identify several genes involved in immune response and the inedit discovery that Bos indicus resistant to gastrointestinal nematodes present a TH2-type response, in contrast to susceptible animals that present a TH1-type response.

Para o sucesso das estratégias de manejo de Rhipicephalus (Boophilus) microplus (carrapato bovino) são necessários testes práticos, econômicos e confiáveis que possam detectar a presença de fenótipos resistentes a drogas em suas populações. O fipronil é um acaricida de uso relativamente recente não havendo testes padronizados para o diagnóstico de resistência do carrapato à molécula. No presente trabalho, foram padronizados bioensaios in vitro para esta finalidade: Teste de Imersão de Adultas, Teste de Imersão de Larvas e Teste de Pacote com Larvas. Os testes foram aplicados e, de forma inédita, populações resistentes foram diagnosticadas tanto no Brasil quanto no Uruguai. Ensaios com inibidores enzimáticos não evidenciaram participação importante de enzimas detoxificadoras no mecanismo de resistência. Foi demonstrada reação cruzada entre fipronil e lindano, não verificada para ivermectina. Em algumas situações, foi observado interferência do controle químico de pragas agrícolas no desenvolvimento de resistência dos carrapatos. / For the success of the strategies for the management of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (cattle tick), practical, economical and reliable tests are needed to detect the presence of drug-resistant phenotypes in their populations. Fipronil is a relatively new acaricide with no standardized tests for the diagnosis of tick resistance to this molecule. In this study, were standardized in vitro bioassays for this purpose: Adult Immersion Test, Larval Immersion Test and Larval Packet Test. The tests were applied and for the first time, resistant populations were diagnosed in Brazil and Uruguay. Tests with enzymatic inhibitors showed no significant involvement of detoxification enzymes in the mechanism of resistance. Cross-resistance was demonstrated between lindane and fipronil but not with ivermectin. In some situations, it was observed interference of the chemical control of agricultural pests in the development of resistance in ticks.