A distrofia muscular dos cães Golden Retriever (GRMD), uma miopatia degenerativa causada pela ausência da distrofina é geneticamente homóloga a distrofia muscular de Duchenne que acomete humanos, portanto, estes cães são considerados modelos experimentais para estudos em terapia celular. Seu sucesso depende da imunossupressão adequada. A ciclosporina A (CsA) é indicada para tal, a monitorização de suas concentrações sangüíneas e efeitos adversos são essenciais para viabilizar a terapia. Foram estudados cães GRMD, e normais da mesma raça, submetidos a terapia com CsA, associada, nos GRMD, ao transplante. Foram avaliados as concentrações sangüíneas do fármaco e seus possíveis efeitos sobre as funções renal e hepática sendo consideradas as manifestações clínicas relacionadas, urinálise, hemograma, testes de função glomerular, e concentrações séricas de uréia, creatinina, alanina amino transferase (ALT), fosfatase alcalina (FA), cálcio, fósforo, sódio e potássio. Como resultados houve aumento discreto na uréia sérica de ambos os grupos; reações adversas como vômito, diarréia, tricose, periodontite e gengivite; diminuição dos níveis de ALT, cilindrúria e proteinúria e aumento da densidade urinária no grupo dos GRMD. As concentrações séricas de CsA oscilaram muito, em seis dos oito animais. Concluímos que maiores estudos devem ser realizados quanto à função renal dos GRMD e que as doses variam individualmente sendo de maior importância avaliar a concentração do fármaco no sangue e sua viabilização no uso da terapia celular. / The muscular dystrophy of Golden Retriever (GRMD) is a degenerative miopaty caused by the absence of dystrophy and it is genetically homologue of the Duchenne muscular dystrophy in humans, so, these dogs are considerably experimental models for studies on cellular therapy. Their successful depends of the adequate immunosuppression. Cyclosporin A (CsA) is indicated for that, the monitoring of the blood concentration and adverse effects are essential to viabilise the therapy. It was studied GRMD dogs, and normal dogs from the same breed, submitted for therapy with CsA, associated, on GRMD, of cell transplantation. It was evaluated blood concentration of the drug, and their possible effects on renal and hepatic functions has been considerate the clinic manifestations, urinalisis, blood counts, testis of glomerular function and blood concentrations of urea, cretinine, alanine aminotransferase, alkaline fosfatase, calcium, phosphorus, sodium and potassium. In our results we found a discrete increase of blood urea on booth groups; adverse reactions like vomits, diarrhea, tricose, periodontitis and gingivitis; decrease of blood alanine aminotransferase, increased levels of urine?s cylinders and protein and also increase of urinary density on GRMD group. The CsA blood concentrations oscillated too much on six than eight of our animals. We concluded that more researches wants to be done to evaluated renal functions of GRMD dogs and also that the doses varieties individually and the correct dosage as to important as the evaluation of the blood concentration of the drug and became viable for cell therapy.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a aptidão reprodutiva de cães da raça Golden Retriever afetados pela distrofia muscular. Realizou-se avaliações andrológicas em 11 cães com idades entre 10 meses e 4 anos. Destes, 7 eram afetados pela distrofia muscular e 4 sadios, utilizados como controle. Todos foram submetidos a exame clinico, análise seminal e ultra-sonografia dos órgãos reprodutores. Analisou-se também a morfologia dos testículos e seus respectivos funículos espermáticos dos cães que foram a óbito. Detectou-se as seguintes alterações nos cães afetados pela distrofia: atrofia muscular, andar rígido, pneumonia por aspiração, fragilidade do diafragma com projeção do estomago para a cavidade torácica, megaesôfago e cardiomiopatia dilatada. Em relação aos órgãos genitais dois dos cães apresentaram criptorquidismo bilateral. Os resultados das análises seminais mostraram que os cães afetados pela distrofia possuem maior quantidade de defeitos espermáticos maiores e totais. Nas avaliações ultra-sonográficas não foram identificadas diferenças entre os cães afetados pela distrofia quando comparados com cães sadios. As análises histopatológicas evidenciaram alterações morfológicas nos testículos e músculos cremáster de cães afetados pela doença. Os testículos apresentaram degeneração testicular e o músculo cremáster retração de fibras musculares com hialinizacao dos miócitos. Conclui-se então que a distrofia muscular em cães da raça Golden Retriever pode comprometer sua aptidão reprodutiva. / The aim of the present research was to evaluate the reproductive condition of Golden Retriever dogs affected by muscular dystrophy. Breeding soundness examination was performed in 11 male dogs aged between 10 months and 4 years. Seven of this total were affected by muscular dystrophy and 4 healthy dogs that served as control. All dogs were submitted to a through physical exam, seminal evaluation and ultrasound of the reproductive tract. Testicle and spermatic cord morphology of post-mortem dogs were also examined. The following alterations were observed for the affected dogs: muscular atrophy, stiff walk, aspiration pneumonia, diaphragmatic fragility with stomach projection to the torax, megaesophagus e dilated cardiomyopathy. In relation to the genital tract, two dogs presented with bilateral cryptorchidism. Semen evaluation revealed high percentage of major and total sperm defects in affected dogs. Ultrasonographic exams were similar among healthy and affected dogs. Histophatology of the testicle and cremaster muscle revealed morphologic alterations in affected dogs represented by degeneration and muscular retraction with miocyte hyalinization, respectively. In conclusion, affected Golden Retriever dogs have their reproductive performance compromised by the muscular dystrophy.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a aptidão reprodutiva de cães da raça Golden Retriever afetados pela distrofia muscular. Realizou-se avaliações andrológicas em 11 cães com idades entre 10 meses e 4 anos. Destes, 7 eram afetados pela distrofia muscular e 4 sadios, utilizados como controle. Todos foram submetidos a exame clinico, análise seminal e ultra-sonografia dos órgãos reprodutores. Analisou-se também a morfologia dos testículos e seus respectivos funículos espermáticos dos cães que foram a óbito. Detectou-se as seguintes alterações nos cães afetados pela distrofia: atrofia muscular, andar rígido, pneumonia por aspiração, fragilidade do diafragma com projeção do estomago para a cavidade torácica, megaesôfago e cardiomiopatia dilatada. Em relação aos órgãos genitais dois dos cães apresentaram criptorquidismo bilateral. Os resultados das análises seminais mostraram que os cães afetados pela distrofia possuem maior quantidade de defeitos espermáticos maiores e totais. Nas avaliações ultra-sonográficas não foram identificadas diferenças entre os cães afetados pela distrofia quando comparados com cães sadios. As análises histopatológicas evidenciaram alterações morfológicas nos testículos e músculos cremáster de cães afetados pela doença. Os testículos apresentaram degeneração testicular e o músculo cremáster retração de fibras musculares com hialinizacao dos miócitos. Conclui-se então que a distrofia muscular em cães da raça Golden Retriever pode comprometer sua aptidão reprodutiva. / The aim of the present research was to evaluate the reproductive condition of Golden Retriever dogs affected by muscular dystrophy. Breeding soundness examination was performed in 11 male dogs aged between 10 months and 4 years. Seven of this total were affected by muscular dystrophy and 4 healthy dogs that served as control. All dogs were submitted to a through physical exam, seminal evaluation and ultrasound of the reproductive tract. Testicle and spermatic cord morphology of post-mortem dogs were also examined. The following alterations were observed for the affected dogs: muscular atrophy, stiff walk, aspiration pneumonia, diaphragmatic fragility with stomach projection to the torax, megaesophagus e dilated cardiomyopathy. In relation to the genital tract, two dogs presented with bilateral cryptorchidism. Semen evaluation revealed high percentage of major and total sperm defects in affected dogs. Ultrasonographic exams were similar among healthy and affected dogs. Histophatology of the testicle and cremaster muscle revealed morphologic alterations in affected dogs represented by degeneration and muscular retraction with miocyte hyalinization, respectively. In conclusion, affected Golden Retriever dogs have their reproductive performance compromised by the muscular dystrophy.

A distrofia muscular dos cães Golden Retriever (GRMD), uma miopatia degenerativa causada pela ausência da distrofina é geneticamente homóloga a distrofia muscular de Duchenne que acomete humanos, portanto, estes cães são considerados modelos experimentais para estudos em terapia celular. Seu sucesso depende da imunossupressão adequada. A ciclosporina A (CsA) é indicada para tal, a monitorização de suas concentrações sangüíneas e efeitos adversos são essenciais para viabilizar a terapia. Foram estudados cães GRMD, e normais da mesma raça, submetidos a terapia com CsA, associada, nos GRMD, ao transplante. Foram avaliados as concentrações sangüíneas do fármaco e seus possíveis efeitos sobre as funções renal e hepática sendo consideradas as manifestações clínicas relacionadas, urinálise, hemograma, testes de função glomerular, e concentrações séricas de uréia, creatinina, alanina amino transferase (ALT), fosfatase alcalina (FA), cálcio, fósforo, sódio e potássio. Como resultados houve aumento discreto na uréia sérica de ambos os grupos; reações adversas como vômito, diarréia, tricose, periodontite e gengivite; diminuição dos níveis de ALT, cilindrúria e proteinúria e aumento da densidade urinária no grupo dos GRMD. As concentrações séricas de CsA oscilaram muito, em seis dos oito animais. Concluímos que maiores estudos devem ser realizados quanto à função renal dos GRMD e que as doses variam individualmente sendo de maior importância avaliar a concentração do fármaco no sangue e sua viabilização no uso da terapia celular. / The muscular dystrophy of Golden Retriever (GRMD) is a degenerative miopaty caused by the absence of dystrophy and it is genetically homologue of the Duchenne muscular dystrophy in humans, so, these dogs are considerably experimental models for studies on cellular therapy. Their successful depends of the adequate immunosuppression. Cyclosporin A (CsA) is indicated for that, the monitoring of the blood concentration and adverse effects are essential to viabilise the therapy. It was studied GRMD dogs, and normal dogs from the same breed, submitted for therapy with CsA, associated, on GRMD, of cell transplantation. It was evaluated blood concentration of the drug, and their possible effects on renal and hepatic functions has been considerate the clinic manifestations, urinalisis, blood counts, testis of glomerular function and blood concentrations of urea, cretinine, alanine aminotransferase, alkaline fosfatase, calcium, phosphorus, sodium and potassium. In our results we found a discrete increase of blood urea on booth groups; adverse reactions like vomits, diarrhea, tricose, periodontitis and gingivitis; decrease of blood alanine aminotransferase, increased levels of urine?s cylinders and protein and also increase of urinary density on GRMD group. The CsA blood concentrations oscillated too much on six than eight of our animals. We concluded that more researches wants to be done to evaluated renal functions of GRMD dogs and also that the doses varieties individually and the correct dosage as to important as the evaluation of the blood concentration of the drug and became viable for cell therapy.

A domesticação dos cães produziu-se simultaneamente em várias partes do globo o que ocasionou, o aparecimento por seleção de várias raças. Desde então o cão passou a ser utilizado para várias e diferentes tarefas, dentre elas acompanhar o homem, que usufruiu da sua conveniência, descobrindo que muitas vezes ambos podem sofrer dos mesmos males. Cães da raça Golden Retriever apresentam uma doença geneticamente degenerativa, homóloga a distrofia muscular de Duchenne (DMD) no homem; ambas doenças afetam o gene que produz a distrofina; uma proteína citoesquelética múscular. Uma possível forma de fornecer uma cópia normal do gene para os grupos musculares afetados de um indivíduo consiste no transplante de células tronco os quais podem ser obtidas de células embrionárias, células germinativas, células do sangue de cordão umbilical, células de medula óssea e células de sangue periférico. Estudos com modelos animais tem mostrado que transplante de células tronco fetais ou células tronco pluripotentes podem ter sucesso no tratamento de muitas doenças crônicas, sendo assim, objetivamos delinear uma linha de tratamento para distrofia muscular em cães da raça Golden Retriever, mediante caracterização e uso das células germinativas embrionárias para terapia celular. Foram utilizados 16 fêmeas sem raça definida (SRD), e as cadelas foram selecionadas a partir do exame citológico; as fêmeas foram inseminadas artificialmente, e após 30 dias de gestação os animais foram castrados pela técnica de ovário-salpingohisterectomia. Os embriões coletados possibilitaram a obtenção e estabelecimento de células tronco germinativas embrionárias, de fibroblastos fetais, de células musculares, os quais analisamos através de citometria de fluxo, interação no co-cultivo de células musculares caninas e células germinativas embrionárias e a imunopositividade das células na detecção de Oct-4. Os resultados nos possibilitam afirmar que em embriões com 22 dias de idade gestacional a região paramesonéfrica apresenta-se indiferenciada, diferentemente do que encontramos com 24 dias de idade, no qual o rim primitivo apresenta-se visível diferenciado. As células tronco germinativas embrionárias apresentaram colônias compactas e com alta proliferação de células mononucleares indiferenciadas e que as células tronco germinativas embrionárias apresentaram como principal problema a manutenção das culturas por períodos significativos. / The canine domesticity generated simultaneously in different parts of the World, that created, the begin of selection of many breeds. Since that time, dogs become to be used for different works, since follow men, that usufructed their convinience discovering most of the time that both are soffering the same ill. Dogs from the Golden Retriever breed presented a degenerative and genetically disease, homologous to Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) in human, the dystrophin gene affection; a muscle citosckeletical protein. A possibility way to supply a correct gene shape for the affected muscle could be from the stem cell therapy from embrionic stem cell, germ cells, umbilical cord blood cells, bone marrow and perific blood. Researches with animal models are showing sucess on the treatment with fetal stem cells or pluripotents ones in different types of cronic illness, then, we aimed a treatment of the Golden Retriever Muscular Dystrophy using embrionic germ cells meantime characterization and their use on cell therapy. Were uses 16 females crossbreed (SRD), bitches were selected by the vaginal cytology exams; females were artificially inseminated and after 30 days of pregancy, the animals were histectomized. Embryos were collected to stabilish embrionic germ cells, canine fibroblasts, muscle cells, which were analysed by flow cytometre, co culture and OCT-4 detection. The results showed the paramesonephic region of embryos with 22 days of pregnancy presents undifferentiate cells(germ cells), what differs from embryos with 24 days, which primitive kidneys presented differentianted types of cells. Under culture conditions, these cells formed compact colonies with high proliferative potential, but without capacity of maintenance after 30 days.

Orientador: Maria Julia Marques / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-09-11T21:17:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Taniguti_AnaPaulaTiemi_D.pdf: 2092152 bytes, checksum: 12213bebdeb4e5920c800ccf1d164d9a (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O camundongo mdx é o animal mais utilizado como modelo da distrofia muscular de Duchenne (DMD), diferindo dos humanos doentes por apresentar ciclos de regeneração muscular e reduzida fibrose. Este trabalho tem como objetivos: 1. desenvolver protocolo experimental para promover fibrose muscular através de exercício de corrida em esteira e 2. verificar se a suramina inibe a fibrose induzida experimentalmente. A suramina tem efeito anti-fibrótico, sendo um potencial agente farmacológico para tratamento da DMD visando sucesso de terapias celulares. Foram utilizados camundongos mdx (n=42) e C57BL/10 (n=11) com seis meses de idade. Os camundongos mdx foram divididos em quatro grupos experimentais: grupo sedentário e tratado com salina (n=11), grupo sedentário e tratado com suramina (n=11), grupo exercitado e tratado com salina (n=10) e grupo exercitado e tratado com suramina (n=10). Os animais foram submetidos à corrida em esteira diariamente e o tratamento com suramina (60mg/kg) foi realizado em dias alternados, via intra-peritoneal. Após sete semanas, os animais foram sacrificados e o músculo tibial anterior, bíceps braquial, diafragma e coração coletados e congelados para análise histológica e protéica por western blot. O plasma sanguíneo foi submetido à análise de creatina-quinase. A força de tração dos membros anteriores foi medida no início e no final do protocolo experimental utilizando-se Grip Strength Meter e o músculo diafragma submetido ao estudo in vitro para verificar a força de contração. Verificamos que o protocolo de corrida em esteira foi adequado para induzir a fibrose e inibir a regeneração nos músculos da pata dos camundongos mdx. O aumento da área de fibrose foi acompanhado pelo aumento dos níveis de TGF-?1, aumento de creatina-quinase e diminuição da força de tração. O tratamento com suramina diminuiu a fibrose nos músculos exercitados e acelerou o processo de regeneração. Adicionalmente, observamos que a suramina reduziu o número de fibras marcadas com azul de Evans, diminuiu os níveis da CK e impediu a perda da força de tração bem como a força de contração do músculo diafragma. Concluímos que o protocolo de corrida em esteira foi eficaz na indução de fibrose nos músculos tibial anterior e bíceps braquial. O efeito anti-fibrótico da suramina torna-a droga potencialmente útil para a terapia farmacológica da DMD / Abstract: The mdx mouse is commonly used as a model to study Duchenne muscular dystrophy (DMD) however shows cycles of muscle regeneration and reduced fibrosis. The purposes of this study were (1) to induce muscle fibrosis through eccentric running exercise in mdx mice and (2) to verify the effects of suramin on muscle fibrosis. Six-month-old mdx (n=42) and control (C57BL/10, n=11) mice were used. Mdx mice were divided in four groups: sedentary and saline-treated (n=11); sedentary and suramintreated (n=11); exercised and saline-treated (n=10) and exercised and suramin-treated (n=10). The mdx mice belonging to the exercised groups were placed on treadmill to run daily, for seven weeks. Suramin was injected at a dose of 60mg/kg i.p. on alternate days. At the end of the experimental protocol, the mice were sacrificed and the tibialis anterior, biceps brachii, diaphragm and heart muscles were dissected, frozen in liquid nitrogen and used to histological and western blot analysis. Blood was obtained to determine creatine-kinase (CK) levels. The forelimb force was measured by an adapted Grip Strength Meter. Force of contraction of diaphragm in vitro was verified. Our results showed that the experimental protocol was adequate to induce muscle fibrosis in mdx mice. The occurrence of fibrosis was accompanied by elevated levels of TGF- ?1 and serum CK and decreased forelimb force. Suramin reduced muscle fibrosis, decreased the number of muscle fibers stained with Evans blue, reduced serum CK levels and prevented the loss of muscle force in exercised mdx and diaphragm strips in vitro. We concluded that the downhill running protocol was effective for inducing fibrosis in tibialis anterior and biceps brachii muscles of mdx mice. Suramin seems to be a potential useful therapeutic alternative for DMD treatment / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

A domesticação dos cães produziu-se simultaneamente em várias partes do globo o que ocasionou, o aparecimento por seleção de várias raças. Desde então o cão passou a ser utilizado para várias e diferentes tarefas, dentre elas acompanhar o homem, que usufruiu da sua conveniência, descobrindo que muitas vezes ambos podem sofrer dos mesmos males. Cães da raça Golden Retriever apresentam uma doença geneticamente degenerativa, homóloga a distrofia muscular de Duchenne (DMD) no homem; ambas doenças afetam o gene que produz a distrofina; uma proteína citoesquelética múscular. Uma possível forma de fornecer uma cópia normal do gene para os grupos musculares afetados de um indivíduo consiste no transplante de células tronco os quais podem ser obtidas de células embrionárias, células germinativas, células do sangue de cordão umbilical, células de medula óssea e células de sangue periférico. Estudos com modelos animais tem mostrado que transplante de células tronco fetais ou células tronco pluripotentes podem ter sucesso no tratamento de muitas doenças crônicas, sendo assim, objetivamos delinear uma linha de tratamento para distrofia muscular em cães da raça Golden Retriever, mediante caracterização e uso das células germinativas embrionárias para terapia celular. Foram utilizados 16 fêmeas sem raça definida (SRD), e as cadelas foram selecionadas a partir do exame citológico; as fêmeas foram inseminadas artificialmente, e após 30 dias de gestação os animais foram castrados pela técnica de ovário-salpingohisterectomia. Os embriões coletados possibilitaram a obtenção e estabelecimento de células tronco germinativas embrionárias, de fibroblastos fetais, de células musculares, os quais analisamos através de citometria de fluxo, interação no co-cultivo de células musculares caninas e células germinativas embrionárias e a imunopositividade das células na detecção de Oct-4. Os resultados nos possibilitam afirmar que em embriões com 22 dias de idade gestacional a região paramesonéfrica apresenta-se indiferenciada, diferentemente do que encontramos com 24 dias de idade, no qual o rim primitivo apresenta-se visível diferenciado. As células tronco germinativas embrionárias apresentaram colônias compactas e com alta proliferação de células mononucleares indiferenciadas e que as células tronco germinativas embrionárias apresentaram como principal problema a manutenção das culturas por períodos significativos. / The canine domesticity generated simultaneously in different parts of the World, that created, the begin of selection of many breeds. Since that time, dogs become to be used for different works, since follow men, that usufructed their convinience discovering most of the time that both are soffering the same ill. Dogs from the Golden Retriever breed presented a degenerative and genetically disease, homologous to Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) in human, the dystrophin gene affection; a muscle citosckeletical protein. A possibility way to supply a correct gene shape for the affected muscle could be from the stem cell therapy from embrionic stem cell, germ cells, umbilical cord blood cells, bone marrow and perific blood. Researches with animal models are showing sucess on the treatment with fetal stem cells or pluripotents ones in different types of cronic illness, then, we aimed a treatment of the Golden Retriever Muscular Dystrophy using embrionic germ cells meantime characterization and their use on cell therapy. Were uses 16 females crossbreed (SRD), bitches were selected by the vaginal cytology exams; females were artificially inseminated and after 30 days of pregancy, the animals were histectomized. Embryos were collected to stabilish embrionic germ cells, canine fibroblasts, muscle cells, which were analysed by flow cytometre, co culture and OCT-4 detection. The results showed the paramesonephic region of embryos with 22 days of pregnancy presents undifferentiate cells(germ cells), what differs from embryos with 24 days, which primitive kidneys presented differentianted types of cells. Under culture conditions, these cells formed compact colonies with high proliferative potential, but without capacity of maintenance after 30 days.