Burkholderia pseudomallei et Burkholderia mallei sont respectivement les agents biologiques responsables de la mélioïdose et de la morve. Pour déterminer si les échecs thérapeutiques étaient dus à l'émergence d'une résistance acquise durant le traitement antibiotique, nous avons sélectionné des souches de Burkholderia thailandensis, modèle d'étude, B. pseudomallei et B. mallei, avec différents antibiotiques : le chloramphénicol, la doxycycline et le triméthoprime-sulfaméthoxazole. Les Burkholderia ont montré qu'elles étaient capables de développer une multirésistance in vitro en réponse à chaque antibiotique utilisé dans le traitement oral de la mélioïdose ou de la morve. Pour comprendre les mécanismes de résistance impliqués, nous avons étudié les aspects moléculaires et génétiques de la résistance chez B. thailandensis par des méthodes protéomiques et transcriptomiques. Nous avons développé une méthode pour quantifier l'expression des gènes de pompes d'efflux par RT-PCR quantitative après normalisation sur plusieurs gènes de référence. Ces méthodes nous ont permis d'identifier la surproduction séquentielle de trois pompes d'efflux de type RND : BpeAB-OprB, AmrAB-OprA et BpeEF-OprC, toutes induites par le chloramphénicol ou la doxycycline chez les souches multirésistantes. L'étude de mutants déficients en pompe d'efflux nous a permis de mieux appréhender les relations étroites entre ces trois pompes et a confirmé que l'efflux actif était le principal mécanisme impliqué cette résistance induite. / Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei are respectively the causative agents of melioidosis and glanders. To determine whether treatment failures were due to the emergence of acquired resistance during antibiotic treatment, we selected strains of B. pseudomallei, B. mallei, and Burkholderia thailandensis, used as a study model of these two pathogenic bacteria, with structurally unrelated antibiotics: chloramphenicol, doxycycline and trimethoprim-sulfamethoxazole. We showed that Burkholderia were able to develop multidrug resistance in vitro in response to each of theses antibiotics used in the oral treatment of melioidosis and glanders. To understand the resistance mechanisms involved, we studied the molecular and genetic aspects of resistance in B. thailandensis by proteomic and transcriptomic methods. We have developed a method to quantify efflux pumps gene expression by quantitative RT-PCR after normalization with several reference genes. These methods allowed us to identify sequential overproduction of three RND efflux pumps: BpeAB-OprB, AmrAB-OprA and BpeEF-OprC, all induced by chloramphenicol or doxycycline in multiresistant strains. The study of mutants respectively defective in one of these efflux pumps has allowed us to better understand the close relationship between these three pumps and confirmed that active efflux acted as a major mechanism involved in the induced resistance.

L’étude du microbiote digestif est un enjeu important de recherche en microbiologie. La première partie de cette thèse porte sur la recherche au sein du microbiote digestif de nouveaux antibactériens, qui apparait comme une des pistes clés dans la lutte contre la résistance aux antibiotiques. Les trois quarts des antibiotiques sont des produits naturels, ou dérivés, sécrétés par des microorganismes de l’environnement. Comme lui, le microbiote digestif représente un écosystème complexe où règne une grande compétition. Nous avons recherché des antagonismes de culture dans le microbiote digestif contre les bactéries les plus pathogènes pour l’homme. Nous avons trouvé une inhibition de S. aureus par P. avidum, de E. cloacae par B. fragilis, E. dispar, L. delbruckii, P. acidipropionici, S. equinus, S. gallolyticus, et enfin de E. aerogenes par B. vulgatus et E. dispar. Nous avons également trouvé des clusters de gène de métabolites secondaires dans le génome de ces bactéries. Ce travail préliminaire confirme que le microbiote digestif est une source potentielle de nouveau antibactériens. En dépit de l’explosion du nombre d’espèces isolées dans le microbiote digestif grâce à la culturomics, certaines restent fastidieuses à cultiver. Nous avons analysé par métagénomique et culturomics une selle avant et après incubation anaérobie en présence de 5% de rumen et 5% de sang de mouton. Ce travail montre une dynamique de croissance des bactéries très hétérogène. Le milieu d’enrichissement utilisé était efficace et permettait la culture d’un plus grand nombre d’espèces bactériennes. Ce travail apporte des éléments nouveaux permettant l’optimisation de cette étape de culturomics. / Gut microbiota is a major health concern for microbiologists. Its alterations were previously related to diseases. In the first step of this thesis, we have searched for new antimicrobials within the gut microbiota. Indeed, antibiotic resistance is a global health concern and research for new antibiotics is a cornerstone for fight against it, according to the WHO. Three quarter of all current antibiotics are natural products, or derived from them, synthesised by bacteria and fungi from soil. Gut microbiota is another complex ecosystem with strong competition. We have searched for antagonism in the gut microbiota species against most human pathogenic species. We found an inhibition of growth of S. aureus by P. avidum, of E.cloacae by B. fragilis, E. dispar, L. delbruckii, P. acidipropionici, S. equinus, S. gallolyticus,and an inhibition of E. aerogenes by B. vulgatus and E. dispar. We also found BGCs for all these species. This preliminary work confirm that gut microbiota is a potential source for new antibiotics. Despite the explosion of bacterial species isolated from gut, some fastidious species remains difficult to grow. We performed a metagenomic and culturomics analysis of a fresh stool sample before and after incubation into an anaerobic blood bottle supplemented with sheep blood and rumen fluid. This medium used in culturomics for enrichment was effective, allowing the isolation of higher number of species. This work show that the dynamic growth of bacteria is very variable. This work brings some precisions in the dynamic of bacterial growth that could improve the culturomics process.

L’utilisation massive des antibiotiques contribue à leur accumulation dans les boues des stations d’épurations. L’application directe des boues est parmi les sources de dissémination des antibiotiques et des gènes de résistance aux antibiotiques. Le compostage et la méthanisation sont parmi les bioprocédés de traitement des boues qui permettent d’éliminer ou réduire les teneurs de certains antibiotiques. Dans ce travail, une boue primaire de la STEP de Marrakech a été contaminée par trois familles d’antibiotiques (macrolides, tétracyclines, fluoroquinolones) pour conduire 4 essais de compostage à différentes doses (dont un essai témoin) et un essai deméthanisation en mode semi-continu. Les résultats du compostage ont montré que l’augmentation des concentrations d’antibiotiques retarde la dégradation de la matière organique et affecte le ratioC/N. De même, la phase thermophile est perturbée, retardée et réduite dans le temps. Pour la méthanisation, une concentration unique et réaliste a été testée. Dans ces conditions, aucun effet sur la production du biogaz ou sur la dégradation de la matière organique n’a été observé. Afin de suivre la dissipation des trois familles d’antibiotiques utilisées au cours du compostage et de la méthanisation, une approche analytique basée sur l’extraction accélérée par solvant (ASE) suivie par l’application d’une méthode des ajouts dosés avant quantification par chromatographie liquide couplée à de la spectrométrie de masse en tandem (UPLC-MS/MS) a du être mise en point. Le compostage et la méthanisation permettent de réduire significativement les concentrations des molécules parents appartenant à la famille des macrolides et des tétracyclines. Par contre,l’élimination des fluoroquinolones est non-significative et ne dépasse pas 30%. Au cours du compostage, la dissipation des macrolides se fait en phase de stabilisation tandis que la phase de maturation est impliquée dans la dissipation des tétracyclines. Les concentrations encirprofloxacine (fluoroquinolone) semblent légèrement évoluer au cours du procédé probablement en raison d’une adsorption/désorption sur le co-substrat lignocellulosique utilisé. Concernant la méthanisation, l’élimination des macrolides et des tétracyclines est significative durant la stabilisation du procédé mais n’atteinds pas les rendements observés lors du compostage. Ladiminution des concentrations des molécules parents est probablement accompagnée par une biotransformation des antibiotiques sous forme de métabolites qui à ce stade ne sont pas connus.La question de la rémanence de certaines molécules comme les fluoroquinolones, interpelle quand au risque d’antibiorésistance. Ainsi, la valorisation des composts/digestats comme amendements organiques des sols dois à terme conduire à une réflexion concernant la réglementation qui inclus la présence de molécule de la classe des antibiotiques.

Les campylobacters sont des bactéries zoonotiques responsables d'entérites chez l'homme. La viande de volaille est considérée comme une source importante de contamination. Il a été suggéré que les désinfectants et les stress subis par les bactéries au cours des procédures de nettoyage et désinfection et des procédés d'abattage des volailles puissent favoriser la sélection de gènes de résistance aux antibiotiques. Afin d'explorer cette hypothèse, des prélèvements dans 4 abattoirs de volailles ont été réalisés au cours de 9 visites. Les niveaux de résistance des campylobacters isolés ont été déterminés par la méthode de dilution en milieu gélosé pour 6 antibiotiques et 2 substances actives entrant dans la composition de désinfectants. Des souches isolées dans l'environnement des abattoirs après nettoyage et désinfection et sur les carcasses de volailles avant l'entrée en salle de ressuage, ont été génotypées avec la technique de PCR-RFLP des gènes pfla/gyrA et flaA. Nos résultats montrent d'une part que les campylobacters sont capables de survivre aux opérations de nettoyage et de désinfection dans les abattoirs de volailles, et que ces souches sont susceptibles de contaminer les carcasses de volailles. D'autre part, nos résultats indiquent que les opérations d'abattage et les procédures de nettoyage et désinfection dans les abattoirs de volailles ne semblent pas favoriser la sélection de souches de campylobacter résistantes aux antibiotiques.

The “magic bullet” theory stated by Paul Ehrlich more than one century ago foresees that drugs need to reach their target to exert their pharmacological activity. When dealing with antibiotics, this implies not only a capacity to interact with bacteria, but also to rejoin them in the infected compartment. The latter property is directly linked to pharmacokinetics. In this Thesis, we have focused our interest on cellular pharmacokinetics of antibiotics in macrophages, reasoning that (i) this model would be relevant for predicting the access of antibiotics to intracellular bacteria, and (ii) deciphering mechanisms of drug entry, distribution, and efflux in single cells would provide pieces of information applicable to the understanding of general pharmaco-kinetics. Accumulation and distribution were studied for oritavancin, a semi-synthetic glycopeptide currently in phase III of clinical development. This molecule is characterized by a highly bactericidal activity against staphylococci, including multiresistant strains, which would be of interest for the eradication of the intracellular forms of these bacteria. We show that oritavancin enters macrophages by adsorptive endocytosis and accumulates to very large amounts in lysosomes, with cellular concentrations as high as 300-fold the extracellular ones. Accordingly, it exerts a concentration-dependent bactericidal activity against Staphylococcus aureus multiplying in phagolysosomes. In parallel, however, it also causes morphological and biochemical alterations, characterized by the deposition of material of heterogeneous aspect and the accumulation of phospholipids and cholesterol. These data point to the difficulty of dissociating high cellular accumulation and cellular toxicity and plead for the interest of in vitro models in the evaluation of the intracellular activity of antibiotics, the early assessment of drug safety profile and the orientation of further in vivo studies. Active efflux was evaluated for macrolides and quinolones, two antibiotic classes accumulating in macrophages and therefore usually considered as useful in the treatment intracellular infections. Macrophages indeed express multidrug transporters in their pericellular membrane, which can extrude a large variety of drugs presenting as common feature an amphiphatic character. We show that macrolides (and azithromycin in particular) are substrates for P-glycoprotein, while quinolones (and ciprofloxacin in particular) are substrates for an MRP-like transporter. Inhibiting these pumps increases the intracellular activity of these antibiotics by enhancing their cellular accumulation. We also describe different mode of transport for these antibiotics, which essentially reflect their variable fluxes through the membrane. These data underline the major role constitutive efflux plays in the modulation of the pharmacokinetics of drugs, and, hence, of their pharmacodynamics. They encourage the setting-up of large-scale screenings aimed at evaluating drug-transporter interactions in lead optimization processes. We may therefore conclude to the usefulness of cellular models in the study of the pharmacokinetics of drugs and of its consequences for pharmacodynamics and toxicity, and suggest the implementation of such models in the early development of new drugs.

Résumé : La recherche développée vise à étudier les différents tests microbiens disponibles pour la détection des antibiotiques dans le lait, ainsi que leur couplage à la spectrométrie infra-rouge (MIR et SPIR). Dans un premier temps, lapplicabilité de certains tests de détection des antibiotiques est envisagée directement à la ferme. Cette étude met en évidence certaines interférences (désinfectants et alimentation), pouvant conduire à des résultats faux positifs. De plus, les différences de sensibilité observées entre tests posent la question de lhomogénéité du contrôle lors des tests officiels réalisés sur les livraisons de lait. Sur base des conclusions tirées de cette première partie de létude, la spectrométrie infra-rouge est envisagée comme moyen de mise en évidence de linhibition bactérienne résultant de la présence de résidus dantibiotiques. Cette seconde partie a nécessité le développement doutils analytiques permettant le comptage rapide des bactéries utilisées dune part et de réaliser le suivi de la croissance bactérienne par chromatographie liquide dautre part. Ce suivi physico-chimique est basé sur un indice de métabolisme intégrant différents acides organiques, dont le principal est lacide lactique. Ces outils analytiques sont appliqués à des échantillons de laits dopés ou non en antibiotiques, analysés par spectrométrie infra-rouge. La confrontation des résultats analytiques aux spectres obtenus dans le moyen infra-rouge ou dans le proche infra-rouge (caméra SPIR) montre le potentiel de ce mode de détection de linhibition bactérienne, corrélée à la production dacides organiques. Summary : Developed research aims at studying the various microbial tests available for the detection of antibiotics in milk, like their coupling with infra-red spectrometry (MIR and SPIR). Initially, the applicability of certain tests of detection of antibiotics is considered directly with the farm. This study highlights certain interferences (disinfecting and feed), being able to lead to false-positives results. Moreover, the differences in sensitivity observed between tests raise the question of the homogeneity of control during the official tests carried out about the milk deliveries. On the basis of conclusion drawn from this first part of the study, infra-red spectrometry is considered like means of detection of bacterial inhibition resulting from the presence of antibiotic residues. This second part required the development of analytical tools allowing the fast counting of the bacteria used on the one hand and to carry out the follow-up of the bacterial growth by liquid chromatography on the other hand. This physico-chemical follow-up is based on an index of metabolism integrating various organic acids, whose main thing is the lactic acid. These analytical tools are applied to spiked milk samples and to unspiked milk samples, analyzed by infra-red spectrometry. The confrontation of the analytical results to the spectra obtained in MIR or PIR spectrometry (camera) shows the potential of this mode of detection of the bacterial inhibition, correlated with the production of organic acids.

Thèse d'exercice : Pharmacie : Nantes : 2003. Mémoire DES : Biologie médicale : Nantes : 2003. / Thèse : 2003NANT026P. Bibliogr. f. 105-115 [129 réf.].

Thèse d'exercice : Médecine. Médecine générale : Université de Nantes : 2004. / Bibliogr. f. 96-106 [74 réf.].

Thèse d'exercice : Médecine. Médecine interne : Université de Nantes : 2004. / Bibliogr. f. 92-98 [81 réf.].

Thèse de doctorat : Chimie : Strasbourg 1 : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 12 p.