Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. [89]-96. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2001. / Bibliogr.: f. 119-137. Publié aussi en version électronique.

Thèse (Ph. D.) -- Université Laval, 1997. / Bibliogr.: f. 279-354. Publié aussi en version électronique.

Thèse (M.Sc.) -- Université Laval, 1997. / Bibliogr.: f. 85-102. Publié aussi en version électronique.

Des anticorps monoclonaux, dirigés contre l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (HBsAg) ont été obtenus par fusion de lymphocytes de souris immunisées avec de l'antigène purifié par chromatographie d'affinité et des cellules de myélome de souris (Sp2/0) maintenues en culture exponentielle. Le dépistage des clones sécréteurs a été effectué par RIA en phase liquide. Pour chaque fusion, nous avons obtenu entre 10 et 20% de clones sécréteurs. La sélection a été effectuée d'après le titre de l'anticorps sécrété dans le surnageant de culture. Les hydrides intéressants ont été clonés par dilution limite. Parmi le souches obtenues, deux ont été sélectionnées comme composantes d'une trousse de dépistage. Ces anticorps sont dirigés contre le déterminant commun "a" de l'HBsAg. Le seuil de sensibilité de cette trousse, indépendamment du sous- type ("ad" et "ay") est de 0.06 ng./ml de sérum. Tous les échantillons trouvés positifs lors de 1'utilisation de réactifs commerciaux l'ont été aussi avec cette trousse. Par contre, nous avons trouvé parmi 1114 donneurs de sang un faux positif dû à la présence d'anticorps anti-immunoglobulines de souris. Cette reaction a pu être neutralisée par addition d'immunoglobulines de souris a l'anticorps révélateur. Des essais complémentaires sur les échantillons du "College of American Pathologist", démontrent que la trousse, mise au point avec des anticorps monoclonaux, est supérieure à celles utilisées dans les laboratoires inscrits à ce service. / Montréal Trigonix inc. 2018

Le daratumumab (Darzalex®) est un anticorps monoclonal thérapeutique dirigé contre l'antigène CD38 et indiqué pour le traitement du myélome multiple. À cause de son efficacité et de son profil d'innocuité, le daramutumab est de plus en plus utilisé et on le retrouve maintenant dans un nombre croissant d'échantillons sanguins. Toutefois, cette présence est problématique, car il se lie aussi au CD38 des globules rouges servant à l'identification des alloanticorps causant des faux. Ce mémoire décrit le développement d'une nouvelle méthode pour contrer l'interférence du daratumumab dans les tests de compatibilité sanguins. La stratégie consistait à mimer la région du récepteur CD38 reconnue par l'anticorps à l'aide de peptides cycliques et de les attacher sur un support solide afin d'hameçonner sélectivement le daratumumab et le retirer du plasma. Différentes méthodes d'ancrage et de cyclisation ont tout d'abord été évaluées afin d'identifier l'approche la plus simple pour sa production et son utilisation. Des études de relation structure-activité par balayages et des troncations ont ensuite été effectuées sur une séquence peptique d'une région du CD38 reconnue par le daramutumab pour identifier les motifs avec la meilleure affinité et la plus grande sélectivité. L'approche sélectionnée offre une grande flexibilité d'ancrage sur différents supports solides et permet la caractérisation et la purification des peptides. Elle a aussi permis de cribler rapidement différentes tailles de peptides cycliques et d'évaluer leur capacité à retirer le daramutumab d'échantillons sanguins. Mes travaux ont permis des avancées importantes sur les méthodes de synthèse et les approches d'ancrage sur support solide et permettront potentiellement le développement de ligands sélectifs pour des anticorps thérapeutiques problématiques dans l'avenir. / Daratumumab (Darzalex[exposant TM]) is a therapeutic monoclonal antibody directed against CD38 antigen and indicated for the treatment of multiple myeloma. Because of its efficacy and good safety profile, daratumumab is increasingly being used and is now found in an increasing number of blood samples. This presence has even become a problem as daratumumab binds to CD38 on red blood cells, it causes false positives thus complicating the identification of the alloantibodies. This thesis describes the development of a new method to overcome the daratumumab interference in blood compatibility tests by using cyclic peptides supported on polymer beads. The strategy was to mimic the antibody-recognized CD38 receptor region with cyclic peptides and attach them to a solid support to selectively remove daratumumab from the plasma. To achieve this, different anchoring and cyclization methods were evaluated in order to identify the simplest and most applicable approach for the production and use. Then, structure-activity relationship studies by scanning and truncation were performed on a peptide sequence of the CD38 region recognized by daratumumab to identify patterns with the best affinity and selectivity. The selected approach offers high anchorage flexibility on different solid supports and allows characterization and purification of the peptide product. It also allowed the rapid screening of different sizes of cyclic peptides and their ability to remove daratumumab from blood samples. My work has provided significant advances in synthesis methods and solid support anchoring approaches and will potentially allow the development of selective ligands for problematic therapeutic antibodies in the future.

Dans la première partie de cette thèse, nous avons démontré la faisabilité de produire des anticorps monoclonaux contre la progestérone à partir de cellules de myélome de souris et de souris immunisée contre la progestérone liée à 1'albumine sérique de boeuf. Nous avons obtenu des anticorps monoclonaux que nous avons comparé à des anticorps polyclonaux selon deux méthodes d'immunoétalonnage, le dosage radioimmunologique et le dosage immunoenzymatique par bioluminescence. Nous avons constaté que dans le dosage radioimmunologique, 1’interaction d'anticorps monoclonaux avec le marqueur iodé est différente de celle observée entre les anticorps polyclonaux et le marqueur iodé. Nous avons pour la première fois observé que la sensibilité de ce dosage avec les anticorps monoclonaux est proportionnelle à la dilution de 1’anticorps. Un dosage radioimmunologique très sensible peut donc être obtenu aussi bien avec un traceur homologue qu'avec un traceur hétérologue. Les méthodes de dosage par bioluminescence sont aussi sensibles que les dosages par radioactivité et cette méthode permet d'éliminer l'étape de séparation de la fraction liée et celle non liée. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons étudié les conjugués stéroïdes-glucuronides dans le but de déterminer si ces métabolites pouvaient fournir une information pertinente sur les transformations des stéroïdes-C19 en périphérie. Nous avons donc mesuré les concentrations plasmatiques de stéroïdes et de leur dérivé glucuronide en fonction de l'âge et en fonction de différentes pathologies telles que 1'hirsutisme et l’hyperplasie bénigne de la prostate. De plus, nous avons déterminé l'effet du Flutamide sur les niveaux de stéroïdes-glucuronides circulants chez des patients castrés atteints d'un cancer de la prostate traités avec le Elutamide. Les 5α-stéroïdes-C19-glucuronides(androstérone-glucuronide et androstane-3α, 17β diol-glucuronide) sont présents en plus grande concentration que leur correspondant non conjugué. Les résultats obtenus ont également démontré que chez l'homme, 1'androstérone-glucuronide est le dérivé glucuronidé dont les concentrations sériques sont les plus élevées. Ces stéroïdes conjugués sont donc plus faciles à déterminer et sont un meilleur reflet du métabolisme des stéroldes-C19 surrénaliens et testiculaires. Nous constatons de plus que la mesure d'un seul stéroïde glucuronide n'est pas suffisante pour constater une anomalie métabolique. / Montréal Trigonix inc. 2018

Le syndrome X-fragile, la première cause de retard mental héréditaire, est causé dans la majorité des cas par l'expansion d'une séquence répétée située dans la région 5' non-traduite du gène FMR1. Cette expansion entraîne l'inactivation du gène et l'absence des protéines FMR1 (6 isoformes) est directement responsable des phénotypes observés chez les patients. L'anticorps monoclonal 1C3, disponible depuis près d'une décennie, a permis l'étude de la protéine sous tous ses aspects ou presque. Cependant, il a été montré récemment que cet anticorps détecte aussi la protéine homologue FXR1. La contribution de cette réaction croisée au signal observé n'a pas été quantifiée mais représente probablement une proportion faible mais non négligeable selon la technique utilisée. Nous avons utilisé deux techniques en parallèle pour obtenir de nouveaux anticorps. Tout d'abord, nous avons tenté la sélection de fragments d'anticorps par la technologie du ?phage display?. Nous avons aussi entrepris la création de nouveaux hybridomes en injectant la protéine FMR1 purifiée à des souris Balb/C. Nous avons obtenu 23 lignées d'hybridomes parmi lesquelles 4 types d'anticorps différents ont été identifiés. La caractérisation de ces anticorps a débuté par l'identification de leur classe d'IgG et la chaîne lègère utilisée. Nous avons aussi vérifié leur spécificité et identifié l'épitope reconnu. L'anticorps produit par l'hybridome 14D3 est ressorti comme étant le plus intéressant compte tenu de sa spécificité et de la possibilité de le purifier. Nous avons évalué son efficacité en immunobuvardage, en immunofluorescence, en immunohistochimie, en ELISA et en immunoprécipitation. L'anticorps 14D3 s'est avéré un excellent anticorps pour toutes ces techniques à l'exception de l'immunoprécipitation. Certains de nos résultats diffèrent des travaux effectués avec l'anticorps 1C3. Cette différence est peut-être attribuable à la différence de spécificité des anticorps ou au fait que l'épitope reconnu par notre anticorps peut être absent de certaines isoformes. Nous avons aussi utilisé les anticorps 14D3 et 11F7 pour préparer un test de dosage par ELISA-sandwich. L'ELISA a été mis au point sur la protéine purifiée. Les tests effectués sont reproductibles et la précision de la courbe standard est excellente (R2 > 0.98).

L'utilisation d'agents chimiothérapeu tiques est souvent limitée par leur toxicité sur les cellules non pertinentes. Pour remédier à ce problème, nous avons utilisé des drogues dirigées de façon spécifique vers la tumeur grâce à leur association à des anticorps monoclonaux qui reconnaissent spécifiquement la cellule-cible. Nous avons évalué l'efficacité de ce modèle avec deux drogues couramment utilisées en thérapie, la daunorubleine et le chlorambucil, couplées a des anticorps mono clonaux dirigés contre un antigène de surface des lymphocytes T, 1'antigène Thy-1.1. Ces anticorps ont été produits en ascite chez des souris nu/nu et CDF1. Ils ont ensuite été purifiés sur DEAE-Sepharose CL-6B et leur activité sur les cellules AKR-SL3 (Thy-1.1 positives) a été prouvée par immuno fluorescence et ELISA. Une fois les conjugués obtenus, nous avons mesuré leur activité pharmacologique par des tests d'inhibition de croissance cellulaire sur les cellules de leucémie de souris P388-D1 (Thy-1.1 -) et AKR-SL3. Les conjugués se sont révélés beaucoup plus actifs (pourcentage de survie plus faible) sur la lignée AKR-SL3 que sur les cellules P388-D1. On constate aussi une augmentation de la spécificité par rapport a la drogue 119re. Cependant lorsqu'on utilise des conjugués non pertinents (dirigés contre des cellules d’adénocarcinome de colon humain, LoVo) on trouve une activité similaire à celle des conjugués drogue-anti-Thy-1.1. On ne peut donc pas vraiment parler de spécificité du modèle d'immunochimiothérapie. Nous avons aussi étudié l'action combinée des deux drogues sur les deux lignées leucémiques et une lignée myélomateuse (SP2/0-Ag-14) selon une représentation graphique appelée isobologramme. Cette représentation permet d'évaluer si l'action des drogues est antagoniste, synergique ou tout simplement additive. Sur les cellules AKR-SL3 et SP2/O-Ag-14, elle s'est avérée additive ; par contre sur les cellules P388-D1 elle est synergique. / Montréal Trigonix inc. 2018

Encore aujourd'hui, la prévention de la grippe par la vaccination ou les approches thérapeutiques ne sont que partiellement efficaces. Les caractères d’hypervariabilité et de transmission du virus influenza lui permettent d’infecter les populations du monde entier malgré une immunité préexistante acquise par infection ou vaccination. En 2009 une éclosion de grippe A(H1N1) au Mexique s’est répandue mondialement et est devenue la pandémie A(H1N1)pdm09. Il devenait alors impératif d’étudier davantage ce virus influenza, notamment les sites antigéniques du virus qui sont les éléments clefs dans l’équilibre entre l’immunité des populations et la propagation du virus influenza. Pour étudier les sites antigéniques de la grippe A(H1N1)pdm09 et identifier leurs épitopes, leurs interactions et leurs immunodominances, nous avons créé des anticorps monoclonaux neutralisants (AcMoN) à l’aide de souris immunisées avec l’hémagglutinine recombinante du virus A(H1N1)pdm09. Les AcMoN obtenus ont été utilisés pour créer des mutants d’échappement in vitro. Nous avons ensuite introduit les mutations identifiées au sein des sites antigéniques de la HA1 par génétique inverse dans un virus réassortant (RG1) possédant six gènes du virus A/PR/8/34 (PA, PB1, PB2, M, NP et NS) et deux gènes (HA et NA) du virus pandémique A/Québec/144147/09. Ces virus ont été testés in vitro (par tests IHA et neutralisation) contre des sérums de furets immunisés contre le virus A(H1N1)pdm09 et in vivo (challenge infectieux ) chez des souris immunisées avec le vaccin influenza en vigueur au moment de l’étude puis infectées avec les virus mutants. D’autre part un AcMoN (appelé PN-SIA28) dirigé contre une portion conservée de la sous-unité HA2 responsable de la fusion du virus à la paroi cellulaire a également été testé quant à sa protection 24 heures post-infection sur des souris infectées avec les virus ; pandémique A/Québec/144147/09 (H1N1), A/WSN/33 (H1N1) et A/Victoria/3/75 (H3N2). Ces études ont permis d’obtenir 33 AcMoN qui ont conduit à l‘identification de 11 mutations d’intérêt immunologique, dont 6 au sein de sites antigéniques (T89R, G157E, G172E, N173D, K180E et A212E) et 5 en marge de ceux-ci (F128L, K180E, K256E, R269K, N311T et G478E). L’obtention de trois variants différents au sein du site antigénique ‘Sa’ adémontré l’immunodominance de celui-ci. Les mutations créées au sein des sites antigéniques sur des virus réassortants 6:2 ont démontré un grand potentiel de glissement antigénique. En effet, les souris immunisées avec la souche vaccinale sauvage n’ont pas été protégées suite aux infections par le virus muté aux sites antigéniques de la HA (RG1). L’AcMoN PN-SIA28 dirigé contre la région HA2 a quant à lui démontré une protection sur les souris infectées avec les virus issus des groupe phylogénétiques 1 (H1N1) et 2 (H3N2) de la HA. L’étude des sites antigéniques du virus A(H1N1) tel que menée dans ces travaux nous permet d’anticiper des mutations futures qui pourraient apparaître naturellement et causer des épidémies ne pouvant être freinées par le vaccin actuel protégeant contre la souche A/California/07/2009. De plus, la thérapie basée sur des AcMoN hétéro-sous-typiques dirigés contre des épitopes conservés ouvre une perspective thérapeutique qui complémente l’aspect préventif découlant de l’étude des sites antigéniques du virus influenza. / Presently, our ability to prevent influenza through vaccination or to remediate it therapeutically is still nowadays partially efficient. The hypervariability and the transmission aspects of influenza virus allow it to infect worldwide populations despite pre-existing immunity acquired through exposition or vaccination. In 2009, a new A(H1N1) virus in Mexico spread worldwide and became the A(H1N1)pdm09 pandemic virus. Since then, it was becoming imperative to study more deeply this influenza virus, especially its antigenic sites which are key elements in the equilibrium between population immunity and influenza virus propagation. In order to study the antigenic sites of flu A(H1N1)pdm09 and to identify their epitopes, their interactions and their immunodominances, we have generated neutralizing monoclonal antibodies (NMAbs) with mice immunized with recombinant hemagglutinin from A(H1N1)pdm09. The MAbs obtained were used for in vitro generation of escape mutants. Afterward, we introduced the identified mutations within the antigenic sites of the HA1 through reverse genetics in a reassortant virus (RG1) possessing six genes from virus A/PR/8/34 (PA, PB1, PB2, M, NP and NS) and two genes (HA and NA) from virus A/Quebec/144147/09. These viruses were tested in vitro (by HAI and neutralization) against sera of ferrets immunized with A(H1N1)pdm09 virus and in vivo (infectious challenge) in mice vaccinated with the current vaccine then infected with the mutant viruses. From another perspective, a MAb (named PN-SIA28) directed against a conserved portion of the HA2 subunit responsible for viral fusion to the host cell membrane, was tested for its protective properties 24 hour post-infection in mice infected with A/Quebec/144147/09 (H1N1) virus, A/WSN/33 (H1N1) virus and A/Victoria/3/75 (H3N2) virus. The study allowed us to obtain 33 MAbs and identify 11 mutations of immunological interest, from which 6 were inside antigenic sites (T89R, G157E, G172E, N173D, K180E and A212E), and 5 were outside them (F128L, K180E, K256E, N311T and G478E). The obtaining of three different variants for one single antigenic site ‘Sa’ demonstrates its immunodominance. The mutations created within the antigenic sites in reassortant 6:2 viruses could lead to high antigenic drift potential since mice immunized with the wild-type vaccine strain were not protected following infections with the RG1 virus having its HA antigenic sites mutated. PN-SIA28 MAb directed against the HA2 region showed protection of mice infected with viruses derived from HA phylogenetic groups 1 (H1N1) and 2 (H3N2). Our work, could allow to anticipate future antigenic drift which could appear naturally and cause epidemics not controlled by the actual vaccine directed towards A/California/07/09. Moreover, a therapy based on MAbs directed against conserved epitopes opens a therapeutic perspective that complements the preventive vaccine approach.