Les anticorps monoclonaux anti-tumoraux sont produits en cellules eucaryotes. Pour des raisons de temps et de cout, peu de candidats sont sélectionnés après des tests in vitro pour être produits à large échelle et testés in vivo. Pour tester plus d’anticorps plus rapidement, nous souhaitons produire des fragments variables simple chaine (scFv) chez E. coli. et les coupler à un fragment constant Fc par chimie click pour reconstituer des mimes d’immunoglobulines naturelles. Cette production indépendante des fragments est aussi un outil modulaire permettant de combiner rapidement un grand nombre scFv et de Fc différents.La chimie click est basée sur une réaction spécifique et de haut rendement entre un azide et un cyclooctyne. Les fragments ont donc été fonctionnalisés sur des résidus spécifiques (tags) par des composés chimiques pour introduire ces fonctions à leur extrémité. La première étape a consisté à introduire des tags en C-terminal du scFv anti-HER2 4D5 et en N-terminal du Fc d’IgG1 humaine. Les scFv ont été produits en cytoplasme d’E. coli à hauteur d’au moins 100 mg/L puis oxydés in vitro au sulfate de cuivre. Le fragment Fc a été produit classiquement en cellules humaines. Cinq réactions chimiques ou enzymatiques ont été optimisées et comparées en termes de spécificité et de rendement. La conjugaison d’une amine sur un tag glutamine catalysée par la transglutaminase microbienne a donné les meilleurs résultats. Le scFv a ainsi été dérivé par l’azadibenzocyclooctyne et le Fc par l’azide à hauteur de 60-70%. Lorsqu’ils sont mélangés, ces fragments forment un (scFv)2-Fc et un scFv-Fc avec des rendements globals respectifs de 10-20% et 20-30% après optimisation.Les mélanges scFv + Fc après réaction de chimie click se fixent de la même façon que le (scFv)2-Fc eucaryote au récepteur HER2. Il reste désormais à montrer que leur capacité à inhiber la prolifération d’une lignée exprimant ce récepteur est similaire. L’objectif final est d’obtenir une inhibition de croissance tumorale similaire sur des xénogreffes. / Anti-tumoral monoclonal antibodies are currently produced in eukaryotic cells. For cost and time reasons, a limited number of potential candidates are selected after in vitro tests. They are produced at large scale and then tested in vivo. To test more antibodies and more rapidly, we chose to produce single chain variable fragments (scFv) in bacteria, and to couple them to the eukaryotic constant fragment (Fc) thanks to click chemistry to reconstitute immunoglobulin-like compounds. For a given cost, this enables to produce and test in vivo a larger number of clones. This independent production of fragments is also a flexible tool allowing the combination of different Fc isotypes/allotypes with different scFvs.Click chemistry is based on a specific and high-yield reaction between and azide and a cyclooctyne. Therefore, antibody fragments were functionalised on specific residues (tags) by chemical linker so that each part will contain one of these chemical moieties at their extremity. The first step consisted in introducing tags into the anti-HER2 scFv 4D5 C-terminus and human IgG1 Fc N-termini sequences. The scFvs were produced with yields higher than 100 mg/L in the E. coli cytoplasm and in vitro oxidized with copper sulfate. The Fc fragment was classically produced in human cells. Five chemical or enzymatical reactions were optimised and compared in terms of specificity and yield. The coupling between an amine and a glutamine tag catalysed by microbial transglutaminase gave the best results. The scFv fragment was thus functionalised with an azadibenzocyclooctyne and the Fc fragment with an azide at 60-70%. When mixed together, these fragments formed a (scFv)2-Fc and a scFv-Fc with global yields respectively of 10-20% and 20-30% after optimisation.After the click reaction, the scFv + Fc mix binds to the HER2 receptor on the same way as the eukaryotic (scFv)2-Fc in terms of HER2-binding and proliferation inhibition capacity. Now, it must be demonstrated that their proliferation inhibition of a HER2-positive cell line is similar. The final aim is to get a similar tumour growth inhibition on murine xenografts.

Pas de résumé fourni. / No summary available.

Les bactéries entéropathogènes du genre Salmonella et Shigella sont transmises par les aliments ou l’eau et sont responsables de nombreuses infections entériques chez les animaux et les humains. Ces maladies infectieuses restent une cause importante de morbidité et de mortalité dans les pays en voie de développement. L’existence de multiples sérotypes de Salmonella et de Shigella ainsi que l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques, nécessite le développement de vaccins efficaces et large spectre. Ces bactéries utilisent un système d’injection de leurs protéines effectrices, appelé injectisome ou encore Système de Sécrétion de Type III (SST3), nécessaire à leur pathogénicité. Alors que les protéines effectrices injectées au moyen de cet injectisome sont variées et dépendent essentiellement du type cellulaire cible et donc de la spécificité du pathogène, certaines des protéines structurales composant l’injectisome sont relativement bien conservées parmi les différentes bactéries pathogènes, notamment les protéines de l’aiguille : PrgI et MxiH, et celles de la coiffe de l’aiguille : SipD et IpaD, respectivement de Salmonella et Shigella. Ces protéines, fortement impliquées dans la virulence des bactéries, semblent donc être des cibles de choix pour lutter contre des infections opportunistes impliquant ces bactéries pathogènes.Le premier objectif de cette thèse était d’évaluer l’immunogénicité et l’effet protecteur des protéines structurales de l’injectisome citées précédemment contre les infections à Salmonella et Shigella. Les protéines recombinantes préparées et produites au laboratoire ont été utilisées de façon séparée ou en combinaison pour immuniser des souris par différentes routes. Ensuite, les réponses immunitaires des souris ainsi immunisées ont été analysées par des tests immunométriques. Enfin, le potentiel immunogène et vaccinant de ces protéines structurales a été évalué en infectant les souris immunisées avec 100 DL50 de Salmonella par voie orale ou de Shigella par voie intranasale. Le meilleur résultat a été obtenu en utilisant la voie intra-gastrique pour les immunisations avec environ 70% de protection. Cette stratégie a permis également d’évaluer la pertinence de cette approche vaccinale dans un modèle murin de protection croisée (entre 25 et 60%). Le deuxième objectif de cette thèse était d’évaluer le pouvoir protecteur d’anticorps monoclonaux murins reconnaissant les régions conservées des protéines SipD et IpaD. Les anticorps obtenus ont été caractérisés et leur pouvoir neutralisant a été évalué in vivo dans un modèle murin d’infection avec Salmonella ou Shigella (jusqu’à 60% de protection).L’ensemble de ces travaux montre que l’utilisation de certaines protéines structurales conservées de l’injectisome de bactéries entéropathogènes présente un intérêt vaccinal et immunothérapeutique pour aider au traitement de certaines salmonelloses et shigelloses. / Salmonella and Shigella species are food and water borne pathogens that are responsible for enteric infections in both humans and animals. These infectious diseases are still the major cause of morbidity and mortality in the emerging countries. The existence of multiple Salmonella and Shigella serotypes as well as the emergence of antibio- resistant strains, require the development of protective and broad-spectrum vaccines. All these bacteria utilize a system for injection of their effectors, called injectisome or Type III Secretion System (T3SS), necessary for their pathogenicity. While effector proteins are varied and depend essentially on the cellular target and thus on the specificity of the pathogen, the structural proteins that form the injectisome are common to all virulent Salmonella and Shigella spp., particularly the needle proteins PrgI and MxiH and the needle-tip proteins SipD and IpaD of Salmonella and Shigella respectively. These proteins, strongly involved in the virulence of the bacteria, appear to be ideal candidate antigens for a subunit-based, broad spectrum vaccine.The first aim of my PhD was to evaluate the immunogenicity and protective efficacy of structural proteins of the above-mentioned injectisome against Salmonella and Shigella infections. The recombinant proteins were prepared and produced in the laboratory and were used alone or in combination to immunize mice using different routes. The immune responses of immunized mice were then analyzed by immunometric assays. Finally, the protective efficacy was evaluated in a mouse model of intestinal (Salmonella) or pulmonary (Shigella) challenge. The best result was obtained by orogastric immunization with 70% of protection. This strategy also allowed to estimate the relevance of this approach in a mouse model of crossed protection (from 25 to 60%). The second objective of my PhD was to evaluate the protective efficacy of murine monoclonal antibodies recognizing conserved regions of SipD and IpaD proteins. The obtained antibodies were characterized and their therapeutic effect was evaluated in vivo with a Salmonella and Shigella infection murine model (up to 60% of protection).To conclude, this work showed that some conserved structural proteins composing the injectisome of enteropathogenic bacteria is of interest for treatment of enteric diseases caused by Salmonella and Shigella.

La galectine-9 (gal-9) est une lectine multifonctionnelle se liant à des glycoprotéines ou des glycolipides possédant des liaisons β-galactosides. Elle est impliquée dans plusieurs pathologies telles que le carcinome nasopharyngé associé au virus d’Epstein-Barr ou les infections chroniques par les virus des hépatites B et C.La gal-9 possède une activité immunosuppressive prédominante liée notamment à une stimulation de l’expansion et de l’activation des lymphocytes T (LTs) régulateurs. Ses effets sur les LTs conventionnels sont plus complexes : elle induit un phénomène d’apoptose précoce dans une fraction des LTs conventionnels mais aussi une activation et une prolifération dans une autre fraction incluant des LTs CD4+ Th1. D’où la nécessité d’explorer les événements de signalisation déclenchés par la gal-9 exogène dans les LTs humains.Notre recherche a été centrée sur des LTs CD4+ humains provenant de lignées leucémiques ou de PBMCs. Nos résultats montrent que le complexe TCR-CD3 et la kinase Lck sont requis pour la mobilisation de Ca2+ et la production de cytokines dont l’expression est induite en aval par la gal-9 (IL-2 et IFN-γ). A l’inverse, l’apoptose déclenchée par la gal-9 n’est pas réduite lorsque les cellules sont invalidées pour l’un de ces composants. Ces données indiquent que la gal-9 agit sur les LTs par deux voies de signalisation distinctes: l’une mimant l’activation classique du TCR avec une contribution majeure des éléments proximaux du complexe TCR, notamment Lck, et l’autre qui aboutit à l’apoptose des cellules et qui est indépendante de ce complexe.Parallèlement à ce volet fondamental de notre recherche, nous avons caractérisé de nouveaux anticorps monoclonaux (AcM) dirigés contre la gal-9. Ceux-ci neutralisent certains effets de la gal-9 sur les LTs humains tels que l’apoptose. Nous avons défini certaines propriétés immunochimiques de nos AcM en vue de leur utilisation potentielle en thérapeutique. Nous pensons que ces travaux pourraient ouvrir la voie à de nouvelles approches dans le champ actuellement en pleine expansion des thérapeutiques qui visent à une restauration de la réponse immunitaire anti-tumorale. / Galectin-9 (gal-9) is a multifunctional lectin binding some glycoproteins and glycolipids containing β-galactoside-bounds. It is involved in several pathologies such as Epstein-Barr virus-associated nasopharyngeal carcinoma or chronic infections by the hepatitis B and C viruses.Gal-9 has predominant immunosuppressive functions notably supported by its capacity to stimulate the expansion and activation of regulatory T cells. Its effects on conventional T cells are more complex: it induces apoptosis in a fraction of them, but it also activates and stimulates proliferation of another fraction including CD4+ Th1 cells. Hence the need to explore the signaling events triggered by exogenous gal-9 in human T cells.Our study was mainly focused on human CD4+ T cells from leukemic cell lines and PBMCs. We found that the TCR-CD3 complex and the Lck kinase were required for Ca2+ mobilization and subsequent cytokines production (IL-2 and IFN-γ) induced by gal-9 in T cells. By contrast, gal-9-triggered apoptosis was not reduced by the knocking-out of these TCR components. These data demonstrate that gal-9 acts on T cells by at least two distinct pathways: one mimicking the classical activation of the TCR with a mandatory contribution of proximal elements of the TCR complex, especially Lck, and another resulting in apoptosis which is independent of this complex.In parallel to this basic research, we characterized new monoclonal antibodies (mAb) targeting gal-9. We demonstrated that our mAb can neutralize the apoptosis and other gal-9 effects in human T cells and we defined some of their immunochemical properties in view of their potential therapeutic use. We believe that this work could pave the way for new approaches in the rapidly expanding field of therapeutics aiming at a restoration of the anti-tumor immune response.

La formation d'agrégats d'anticorps monoclonaux en solution est difficile à empêcher. Même si la présence de gros agrégats est assez rare, leur existence peut avoir des effets dramatiques dans les systèmes d'injection, en menant à des situations de colmatage partiel ou total de la restriction dans ce dernier. Cela entraîne une injection mal contrôlée ou même une obstruction totale du système d'injection. Très peu est connu sur le rôle de la taille des agrégats et de la pression appliquée sur de tels évènements de colmatage. Dans cette thèse, nous présentons un système microfluidique modèle, imitant les systèmes médicaux d'injection afin de comprendre fondamentalement le colmatage de restrictions d'une taille donnée. Des solutions très concentrées en anticorps monoclonaux nous permettent de créer des agrégats de protéines (plus grands que 50 micromètres) en utilisant un stress mécanique ou thermique. Nous montrerons que le colmatage a lieu quand les agrégats atteignent la taille de la restriction et peut dans certains cas être défait en augmentant la pression appliquée. La possibilité observée d'éjecter des agrégats de la restriction via une augmentation en pression indique le rôle important de la déformabilité des agrégats de protéines, à ce jour complètement inexplorée. Nous réalisons des expériences systématiques pour différentes tailles relatives d'agrégats et de pressions appliquées, et nous mesurons le débit en sortie. Malgré leurs formes et densités différentes, nous pouvons prédire le nombre d'évènements de colmatage pour une taille donnée de restriction par des mesures utilisant le Flow Imaging Microscopy (MFI). De plus, notre système peut détecter l'occurrence de très gros agrégats (très rares) souvent non détectés par d'autres techniques. Avec un modèle mécanique simple, nous pouvons estimer pour la première fois un ordre de grandeur du module d'Young et un diamètre effectif de pores pour des agrégats d'anticorps monoclonaux. Nous avons également développé une autre expérience modèle dans un canal hyperbolique couplé avec un flow focusing afin d'observer la déformation d'agrégats sous écoulement élongationnel. Nous décrirons leur comportement en analysant leurs trajectoires qui sont pour la plupart d'entre eux du tumble et de l'alignement avec l'écoulement. De plus, nous développerons un modèle mécanique qui tient compte de la force de friction dans une expérience modèle contrôlée avec une solution polymérique de PEGDA. Nous étudierons ainsi le rôle d'une différence de pression minimale à appliquer pour remettre la particule en mouvement dans la restriction, et ainsi relier cela aux agrégats de protéines. / The formation of aggregates in solutions of monoclonal antibodies is difficult to prevent. Even if the occurrence of large aggregates is rather rare, their existence can have dramatic effects in injection devices, as they can lead to partial or total clogging of constrictions in the latter. This leads to badly controlled injection or even total obstruction of the device. Little is know on the role of aggregate size and applied pressure on such clogging events. In this thesis, we present a microfluidic model system, mimicking medical injection devices to gain fundamental understanding of the clogging of constrictions of given size. Highly concentrated solutions of monoclonal antibodies allow us to create protein aggregates (bigger than 50 micrometers) using mechanical or heat stress. We show that clogging occurs when aggregates reach the size of the constriction and can in some cases be undone by increasing the applied pressure. The observed possibility to eject aggregates from constrictions via an increase in pressure indicates the important role of protein aggregate deformability, so far completely unexplored. We perform systematic experiments for different relative aggregate size and the applied pressure, and measure the flow-rate. Despite their different shapes and density, we can predict the number of clogging events for a given constriction size by Flow Imaging Microscopy (MFI) measurements. In addition our device can detect the occurrence of very rare big aggregates often overlooked by other detection techniques. With a simple mechanical model where we neglected the friction, we could estimate for the first time an order of magnitude for the Young modulus and a porous diameter for monoclonal antibodies aggregates. We also develop another model experiment with an hyperbolic channel coupled with a flow focusing to observe deformation of the aggregates under extensional flow. We describe their behavior by analyzing their trajectories which are for most of them tumbling and alignment with the flow. Moreover, we develop a mechanical model which took into account the friction force in a controlled model experiment with polymeric solution. We thus investigate the role of a minimal applied pressure to generate the particle movement into the constriction, and then link it with protein aggregates.

L’augmentation de l’espérance de vie entraîne l’accroissement d’une population vieillissante et augmente ainsi le nombre de personnes souffrant de maladies neurodégénératives. Le développement de nouveaux médicaments pour le traitement de ces maladies est grandement limité par la présence d’une barrière physiologique, appelée barrière hémato-encéphalique (BHE), qui protège l’homéostasie du cerveau. Cependant, un grand nombre de transporteurs spécifiques sont situé sur les cellules endothéliales formant la BHE et pourrait être l’objet de ciblage thérapeutique afin d’augmenter la disponibilité cérébrale de plusieurs médicaments. Afin d’évaluer le potentiel d’anticorps monoclonaux (AcM) ciblant le récepteur de la transferrine (RTf) dans le cadre d’une approche non invasive de thérapie génique, nous avons tout d’abord étudié la distribution cérébrale de l’AcM Ri7. Nous avons, en premier lieu, observé une rétention au cerveau des AcM ciblant le RTf. Cependant, des analyses de microscopie ont démontré que la distribution était confinée à la cérébrovasculature. Par la suite, en conjuguant le Ri7 à des points quantiques, nous avons caractérisé la distribution subcellulaire du vecteur. Nos analyses de microscopie électronique ont confirmé que les complexes Ri7-points quantiques étaient massivement internalisés dans les cellules endothéliales du cerveau (CECCs) et que ces complexes étaient observés dans les petites vésicules, les structures tubulaires et dans les corps multivésiculaires. Nous avons ainsi identifié les CECCs comme cible potentielle pour le traitement de la pathologie endothéliale de maladies neurodégénératives. Par la suite, nous avons évalué le potentiel de deux formulations de nanoparticules pour acheminer du matériel génétique dans les CECCs. Nos résultats ont démontré que l’utilisation de micelles polyionques et d’immunoliposomes permettait une accumulation importante d’acides nucléiques dans les CECCs. Notre étude ouvre donc la porte à de nouvelles approches thérapeutiques basées sur le ciblage thérapeutique des cellules endothéliales du cerveau. / The increase in life expectancy leads to a direct expansion of the aging population. This expansion further increases the burden of neurodegenerative diseases. The development of new drugs to treat brain pathologies is greatly hindered by the presence of a physiological barrier, the blood-brain barrier (BBB), protecting the brain homoeostasis. However, a high number of specific transporters are located on endothelial cells forming the BBB and could be the target of brain-drug delivery allowing significant cerebral accumulation of many therapeutic compounds. To study the potential of monoclonal antibodies (mAb) targeting the transferrin receptor (TfR) in the context of a non-invasive gene therapy strategy, we foremost studied the cerebral distribution of the mAb Ri7. We first observed retention in the brain of the mAb. However, fluorescence microscopy analysis revealed that the distribution of Ri7 was confined to cerebral vasculature. Thereafter, by conjugating Ri7 to quantum dots (Qdot), we performed experiments to characterize the subcellular distribution of the mAb. Our transmission electron microscopy analyses showed that Ri7-Qdots were massively internalized within brain capillary endothelial cells (BCECs) and that the TfR-targeted Qdots were in small vesicles, tubular structures and multivesicular bodies. We thus identified BCECs as a potential target for the treatment of endothelial pathology of neurodegenerative diseases. Finally, we investigated the potential of two nanoformulations to delivery nucleic acids to BCECs. Our data demonstrated the capacity of polyionic complex micelles and immunliposomes to deliver a large number of nucleic acids to BCECs. Overall, our study opens the door for a novel therapeutic approach based on brain endothelial cells drug delivery.

La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle effectuée par les poly(ADP-ribose) polymerases (PARP), des enzymes à prédominance nucléaire qui catalysent la formation de polymères d'ADP-ribose sur des protéines acceptrices en utilisant le NAD+ comme substrat. Cette modification est impliquée dans plusieurs processus cellulaires dont la replication, la transcription, la réparation de l'ADN et la mort cellulaire. La poly(ADP-ribose)glycohydrolase (PARG) est l'enzyme qui hydrolyse le polymère d'ADP-ribose, permettant aux protéines modifiées de regagner leurs fonctions. Le projet de recherche ici présent décrit les méthodes et caractéristiques optimales de l'inhibition de l'expression du gène PARG dans le but de moduler la réponse aux dommages à l'ADN des cellules humaines cancéreuses. La première étape a été de développer des anticorps monoclonaux spécifiques envers l'enzyme PARG humaine (B8G4 et D8B10). Ces anticorps, d'un isotype IgGl et IgG2a respectivement, sont capables de détecter spécifiquement trois isoformes de l'enzyme PARG. Les résultats d'immunobuvardages ont montré que B8G4 et D8B10 détectent PARG dans des types cellulaires différents. La deuxième étape consistait au développement de petits ARN en épingle à cheveux (shARN) spécifiques au gène PARG humain et leur insertion dans un système d'expression viral (lentivirus). Les quatre shARN-huPARG produits et caractérisés ont tous démontré une capacité variable de l'inhibition de l'expression du gène PARG chez les cellules humaines. L'inhibition a permis de diminuer significativement la présence cellulaire de la protéine PARG ainsi que son activité enzymatique. Des cellules de gliomes humains SKI-1 dont le contenu en PARG a été constitutivement diminué à l'aide du système de shARN semblent montrer une sensibilité accrue aux rayons ionisants. Les anticorps anti-PARG B8G4 et D8B10 ainsi que les ARN en épingle à cheveux shRNA-PARG sont des outils moléculaires fonctionnels permettant de diminuer significativement l'expression du gène PARG et de déterminer l'ampleur de l'inhibition. Ces outils ont été ainsi utilisés dans une étude fonctionnelle de sensibilisation des cellules cancéreuses envers des rayons ionisants.

Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des glycoprotéines complexes possédant de nombreuses micro-hétérogénéités qui peuvent influencer leur efficacité dans l’organisme. Il est par conséquent nécessaire de développer des méthodes analytiques robustes, sensibles et spécifiques pour les caractériser avec la plus grande précision. L’objectif de cette thèse a été de développer des méthodes analytiques permettant la caractérisation fine et à différents niveaux d’un anticorps monoclonal, le cetuximab, ainsi qu’un anticorps monoclonal conjugués à un principe actif, le brentuximab vedotin, sur des couplages direct ou indirect de l’électrophorèse capillaire et la spectrométrie de masse. Dans une première partie, une approche middle-up protéomique du cetuximab a été réalisé sur le couplage indirect CZE-UV/MALDI-MS afin de séparer et caractériser les variants de charges du fragment F/2 et F(ab)’2 ainsi que la caractérisation top-down des fragments Fc/2. Ensuite une nouvelle stratégie indirecte CZE-UV/nanoESI-MS a été développée pour permettre la caractérisation fine de ce mAbs partiellement digéré. Enfin un couplage direct par CESI-MS a été développé pour permettre l’analyse rapide et précise du cetuximab middle-up. Dans une deuxième partie, la combinaison d’analyse de mAbs d’intact, middle-up et bottom-up protéomique a été réalisée sur le couplage CZE-UV/nanoESI-MS et CESI-MS. Cela a permis la caractérisation à différent niveau du brentuximab vedotin. Cette méthodologie a permis l’analyse du DAR, l’identification de fragments conjugués, la caractérisation simultanée de la séquence complète de l’anticorps, d’un grand nombre de modifications post-traductionnelles, la caractérisation des peptides conjugués ainsi que l’identification d’ions diagnostiques du principe actif. / Monoclonal antibodies (mAbs) are highly complex glycoproteins having a lot of micro-heterogeneities which can influence their effectiveness. As a consequence, it is necessary to develop robust analytical methods, sensitive and specific to characterize them with high accuracy. The purpose of this thesis was to develop analytical methods allowing the multi-level characterization of monoclonal antibody (cetuximab), and antibody drug conjugates (brentuximab vedotin), using on-online or off-line capillary electrophoresis – mass spectrometry coupling. In the first section, a middle-up proteomic approach of cetuximab was carried out using Off-line CZE-UV/MALDI-MS coupling to separate and to characterize Fc/2 and F(ab)’2 charge variants. A top-down characterization of Fc/2 fragments was also employed. Then a new strategy off-line CZE-UV/nanoESI-MS was used to allow the characterization of this partially digest mAbs. Finally, an online coupling by CESI-MS was developed to allow the fast and accurate analysis of middle-up cetuximab. In a second part, the combination of intact, middle-up and bottom-up proteomic carried out on CZE-UV/nanoESI-MS and CESI coupling allowed the most exhaustive characterization of brentuximab vedotin. This methodology allowed the analyze of DAR, the identification of fragments drug conjugates, the simultaneous characterization of the complete structure of antibody, a significant number of post-translational modifications, all peptides drug conjugates and the identification of diagnostic ions.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La NADPH oxydase, Nox4, appartient à la famille des Nox qui génèrent les espèces radicalaires de l'oxygène, ROS, en transférant un électron à l'oxygène moléculaire. Malgré sa large distribution dans les tissus, Nox4 est encore mal comprise. Contrairement aux autres Nox, Nox4 est unique par son activité constitutive et sa capacité à former H2O2. Les ROS sont des espèces bactéricides dans les phagocytes et des outils de signalisation dans les cellules non phagocytaires en étant associés à de nombreuses pathologies inflammatoires et du vieillissement. Une étude de la structure en lien avec la fonction de Nox4 permettra de mettre l'accent sur un mécanisme de fonctionnement et sur de nouvelles cibles thérapeutiques. 5 nouveaux anticorps monoclonaux ont été générés contre une construction recombinante tronquée (AA: 206-578) de Nox4. La spécificité de 3 anticorps monoclonaux (8E9, 5F9, 6B11) a été confirmée par western blot dans les cellules HEK293 transfectées et le cortex de rein humain. L'anticorps 8E9 est le seul à permettre un marquage des cellules TRex-Nox4 sans perméabilisation par FACS. L'immunofluorescence confocale a montré que Nox4 est localisée dans la zone périnucléaire et le réticulum endoplasmique. La microscopie TIRF a confirmé sa présence dans la membrane plasmique. Un phénomène intéressant est que 5F9 ne détecte pas Nox4 à la membrane plasmique. L'épitope de 8E9 reconnaît une région sur la dernière boucle E extracellulaire de Nox4 (222H-E241), tandis que les anticorps monoclonaux, 6B11 et 5F9 marquent respectivement les régions 6B11 (389S-P416) et 5F9 (392D-F398). Par ailleurs, seuls 5F9 et 6B11 inhibent l'activité de Nox4, ce qui suggère que les deux régions marquées par ces ACm sont impliquées dans le transfert d'électrons. Une étude ciblée sur la boucle E de Nox4 a permis de montrer que le changement de 2 cystéines modifie la nature des ROS générés par Nox4 avec la production de O2- au lieu de H2O2. O2- est mis en évidence par la formation de peroxynitrite en présence de NO. Par ailleurs l'ACm 8E9 diminue la production de H2O2 dans les cellules COS7 qui expriment Nox4 à la membrane plasmique alors que celle de O2- est augmentée. Des constructions recombinantes de Nox4 (native ou tronquée) ont été générées par induction bactérienne, E.Coli, et par un système de transcription/traduction (RTS). Les protéines correspondantes, solubles, ont été produites à grande échelle et l'activité diaphorase mesurée; cette activité est constitutive. L'étude de la topologie membranaire de Nox4 et p22phox a été abordée en préparant des protéines de fusion avec l'ubiquitine marquée à la GFP. Cette méthode, TDUFA, particulièrement originale, devrait permettre d'appréhender la topologie de l'hétérodimère Nox4/p22phox, actif. / NADPH oxidase, Nox4, belongs to the Nox family which could generate reactive oxygen species by transferring an electron to molecular oxygen. Despite its wide distribution in tissues, Nox4 is still poorly understood. Unlike the other Noxes, Nox4 shows some unique characters: the constitutive activity, H2O2 formation. Nox4 involved ROS has been proposed to be implicated in several pathologies. Thus, to study the structure/function and the regulation of the activity of Nox4 will provide new ideas and new drug targets for the effective prevention and treatment of clinical diseases related with ROS. To know more about Nox4, in this study, 5 novel monoclonal antibodies were raised against a truncated recombinant protein (AA: 206-578) of Nox4. The specificity of 3 mAbs (8E9, 5F9, 6B11) was confirmed by western blot analysis in HEK293 transfected cells and human kidney cortex. In FACS studies, only mAb 8E9 could react with intact tet-induced T-RExTM Nox4 cells. Immunofluorescence confocal microscopy showed that Nox4 localized not only in the perinuclear and endoplasmic reticulum regions but also at the plasma membrane of the cells which was further confirmed by TIRF-microscopy. An interesting phenomena is that mAb 5F9 failed to detect Nox4 at the plasma membrane. Epitope determination showed that mAb 8E9 recognizes a region on the last extracellular loop of Nox4 (222H-E241), while mAb 6B11 (389S-P416) and 5F9 (392D-F398) are directed to its cytosolic tail. Cell-free oxidase assays showed a moderate but significant inhibition of constitutive Nox4 activity by mAb 5F9 and 6B11. To study the protein region which is responsible for the unique ability of Nox4 of releasing H2O2 rather than O2-, chimeric proteins and mutants were used. E-loop of Nox4 is 28 amino acid longer than that of Nox1 or Nox2. Deletion of E-loop amino acids only present in Nox4 or change of the two cysteines in the E-loop switch Nox4 from H2O2 to O2- generation. In the presence of a NO donor, the O2--producing Nox4 mutants, but not widetype Nox4, generated peroxynitrite, excluding artifacts of the detection systems as the apparent origin of O2-. A second approach was used to confirm the responsibility of E-loop for the H2O2 formation. In Cos7 cells, which exhibit some plasma membrane expression of Nox4, addition of the mAb 8E9 decreased H2O2 production but increased O2- formation. Unlike Nox1 or Nox2, the E-loop of Nox4 contains a highly conserved histidine H222. Mutation of H222 also switched Nox4 from H2O2 to O2- formation. The structure of the E-loop might hinder O2- egress and/or provide a source for protons to accelerate dismutation to form H2O2. Two bacterial protein expression approaches (in vitro RTS and bacterial induction) were used to produce Nox4 cytosolic tail for characterizing the electronic transfer property of Nox4. The presence of rare codons (1363AGA AGA CUA1371) and high level of hydrophobicity affects the production of soluble and active recombinant Nox4Aqc and Nox4Bqc. After optimization of the conditions, soluble and active recombinant proteins were obtained by RTS or by bacteria induction. The soluble proteins were produced in large scale, purified onto affinity chromatography and were tested for the diaphorase activity (INT and cytochrome c). Results showed that electronic acceptor cytochrome c gives a higher rate than INT. Nox4Aqc produced a lower specific activity by a cell-based system compared to the protein synthesized in cell-free technology. This activity is not stimulated by the addition of cytosolic factors. A new method, topological determination by ubiquitin fusion assay (TDUFA), was used to investigate the topology of Nox4 and p22phox. ubGFP fusion proteins are used as tools to obtain details of membrane protein topology. This method was first validated by using two membrane proteins with known topology and then should get more topology information of Nox4 and p22phox further.