L’objectif était d’identifier le ou le(s) mécanismes contribuant à l’hypercoagulabilité associée aux anticorps anti-phospholipides. L’activation plaquettaire induite par les anticorps ainsi que l’interférence des complexes anticorps/antigène avec les réactions dépendantes des phospholipides ont été étudiées. Des anticorps monoclonaux murins dirigés contre la ß2-glycoproteine I et la prothrombine ont été utilisés comme modèle des anticorps anti-phospholipides. Les résultats obtenus montrent que ces anticorps ont un effet anticoagulant qui se traduit par une diminution de la génération de thrombine et un effet procoagulant qui se traduit par une inhibition de l’activité de la protéine C activée. Ces anomalies surviennent indépendamment de l’activation plaquettaire. La résultante globale est une hypercoagulabilité. Une activation plaquettaire, suffisamment intense, augmente la quantité de phospholipides procoagulants et neutralise partiellement l’effet anticoagulant des anticorps anti-phospholipides. Ainsi, l’activation plaquettaire contribue à renforcer l’hypercoagulabilité due à la résistance à la protéine C activée. Les complexes anticorps/antigène interfèrent avec les complexes pro- et anticoagulants au niveau des surfaces plaquettaires. Les avidités respectives de chacun des partenaires étudiés pour les surfaces phospholipidiques participent aux mécanismes conduisant à l'hypercoagulabilité associée aux anticorps anti-phospholipides. / The objective was to identify the mechanisms which contribute to the hypercoagulability associated with anti-phospholipid antibodies. Antibody-mediated platelet activation and interference of antibodies with phospholipid-dependent reactions were investigated. Murine monoclonal antibodies directed against ß2-glycoprotein I and prothrombin were used as model of anti-phospholipid antibodies. An anticoagulant effect, evidenced by impairment of thrombin generation and a procoagulant effect, by inhibition of activated protein C activity were shown. These phenomena occurs independently of platelet activation. The overall result was hypercoagulability. When immune-mediated platelet activation is sufficiently intense, it increases the amount of procoagulant phospholipids and antagonizes partially the anticoagulant effect of anti-phospholipid antibodies. Thus platelet activation contributes to reinforce the hypercoagulability due to activated protein C resistance. The antibody/antigen complexes interfere with pro- and anticoagulant complexes to the platelet surfaces. The avidity of each studied partners for the phospholipid surfaces take part in the mechanisms leading to hypercoagulability associated with antiphospholipid antibodies.

Trois bactéries du genre Yersinia sont pathogènes pour l’homme : Yersinia pestis (bacille de la peste), et les bactéries entéropathogènes Yersinia pseudotuberculosis et Yersinia enterocolitica. Yersinia pestis est responsable de plus de 20 000 cas humains de peste déclarés à l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) ces dix dernières années dans différents foyers en Afrique, Asie et Amériques. Considérée aujourd’hui à tort comme une maladie du passé, elle est au contraire classée parmi les maladies réémergentes Même si elle ne se présente plus sous la forme d’épidémies massives, elle pose encore au monde actuel d’importants défis de par son extrême gravité, sa rapidité de dissémination, une apparition de résistances aux antibiotiques et une éventuelle utilisation terroriste du bacille. Dans ce contexte, l’immunothérapie contre Y. pestis pourrait être une bonne alternative pour traiter la peste bubonique et pulmonaire. Un des objectifs de cette thèse était de produire des anticorps monoclonaux murins contre trois protéines de l’injectisome (YscF, YscC et LcrV), un facteur de virulence clé des Yersinia. Les anticorps obtenus ont été caractérisés et pour certains leurs épitopes identifiés. Par la suite, en collaboration avec Elisabeth Carniel à l’Institut Pasteur, leur pouvoir neutralisant a été évalué in vivo dans un modèle murin de peste bubonique. Ces mêmes anticorps monoclonaux, produits contre les protéines de l’injectisome sont en cours d’évaluation pour la mise au point d’un test de diagnostic rapide de Y. pestis dans différents fluides et échantillons biologiques. Yersinia pseudotuberculosis et Yersinia enterocolitica sont présentes dans le monde entier et sont transmises par contamination à partir de viande de porc mal cuite, de lait ou produits laitiers et de végétaux, ou par contact avec des animaux porteurs sauvages ou domestiques. Une transmission interhumaine par voie fécale-orale est également possible. Ces bactéries sont responsables très fréquemment d’infections entériques. Cependant leur recherche dans les coprocultures n’est pas réalisée de façon systématique en laboratoires d’analyses médicales du fait de leur croissance lente et difficile sur les milieux usuels, ce qui rend leur isolement à partir de fèces difficile. De plus, les procédures de routine sont coûteuses et longues. Cela entraine probablement une sous-estimation de l’incidence des infections à Yersinia entéropathogènes, la prescription de traitements non adaptés et la réalisation d’appendicectomies non nécessaires, d’où la nécessité de développer des tests de diagnostic rapides, spécifiques, sensibles et faciles à utiliser. Un des objectifs de cette thèse était de produire un panel d‘anticorps monoclonaux murins contre les principaux biotypes et sérotypes pathogènes de Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica pour le développement de tests de diagnostic immunologiques (ELISA et tests bandelettes) répondant aux caractéristiques recherchées et utilisables directement avec des échantillons biologiques humains. / Three bacteria of the genus Yersinia are pathogenic for the human: Yersinia pestis (the plague bacillus) and the enteropathogenic bacteria: Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia enterocolitica. Yersinia pestis is responsible for more than 20,000 human cases of plague declared to the World Health Organization (WHO) during the ten last years in different areas from Africa, Asia and America. Mistakenly considered today as a disease from the past, on the contrary, the plague is re-emerging. Even if it doesn’t occur as a massive epidemic, it still lays down a challenge to the world for its important severity, its quick spreading, the appearance of antimicrobial resistance and a potential use for terrorism. Under the circumstances, the immunotherapy against Y. pestis could be a good option to treat bubonic and pneumonic plague. One the aims of this thesis was to produce murine monoclonal antibodies against the three proteins of the injectisom (YscF, YscC, LcrV), a key virulence factor of Yersinia. The obtained antibodies were characterized and for certain, the epitopes were identified. Then, in collaboration with Elisabeth Carniel from Institut Pasteur, their therapeutic effect was evaluated in vivo with a bubonic plague model in mice. The antibodies generated against the proteins from the injectisom are now evaluated in a diagnosis test for a fast detection of Y. pestis in different biological samples. Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis, the two enteropathogenic Yersinia species for humans, have a worldwide distribution and are among the most frequent agents of human diarrhea in temperate and cold countries. However, research of enteropathogenic Yersinia is not consistently performed in medical laboratories because of their specific growth characteristics, which makes their isolation from the stool samples difficult. Moreover, current procedures for isolation are expensive and time consuming, which leads to underestimation of the incidence of yersiniosis and prescriptions of inappropriate antibiotic treatments. One the aims of this thesis was to produce different murine monoclonal antibodies against the main pathogenic biotypes and serotypes of Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica for the development of fast, sensitive, specific and easy-to-use immunoassays (ELISA and dipsticks), useful for both human and veterinary diagnosis.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Pharmacie : Nantes : 2009. / Bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'objectif principal de cette étude consistait à identifier et à caractériser des inhibiteurs de l'activité enzymatique des Nucléosides Triphosphates Diphosphohydrolases (NTPDases) de la membrane cytoplasmique, soient les NTPDase 1, 2, 3 et 8. Ainsi, dans un premier temps, nous avons caractérisé l'inhibition de certains antagonistes des récepteurs P2 sur les NTPDases. Puis, nous avons produit et testé des inhibiteurs spécifiques de ces enzymes, tels des anticorps monoclonaux. Nos résultats nous permettent de conclure que certains antagonistes des récepteurs P2 tels la suramine, le NF279, le réactif bleu-2 sont aussi des inhibiteurs non sélectifs de l'activité enzymatique des formes humaines et murines des NTPDasel, 2, 3 et 8. Parmi les antagonistes testés, le plus puissant s'est avéré être le NF279. Soulignons cependant, qu'il suffit d'une modification chimique de certains de ces antagonistes pour obtenir une inhibition plus sélective de certaines NTPDases. Finalement nous avons produit et caractérisé un anticorps dirigé contre la NTPDase3 humaine qui inhibe spécifiquement cette enzyme. Ce nouvel anticorps monoclonal que nous avons produit au laboratoire représente actuellement le premier inhibiteur spécifique d'une NTPDase. Dans ce travail, nous avons également démontré que cet anticorps monoclonal est très efficace dans différents types d'expérimentation telles le Western blot, l'immunohistochimie et la cytométrie de flux. L'identification et la caractérisation de ces outils permettront une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les nucléotides extracellulaires, via l'activation des récepteurs P2, modulent des fonctions biologiques importantes telles le développement, la sécrétion endocrinienne, l'inflammation et les réactions immunitaires.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les cellules NK sont capables d’ADCC (Antibody Dependent Cytotoxicity) suite à l’engagement durécepteur Fc!RIIIa/CD16a, et de fonctions effectrices directes antivirales et anti-tumorales: c’est la«cytotoxicité naturelle ». Ainsi activées elles peuvent également répondre en produisant des cytokines, commel’IFN-!. La dégranulation et la synthèse d’IFN-! par les cellules NK observées après engagement du récepteurCD16a, dont l’expression est indépendante du polymorphisme V158F, ont été largement supérieures à cellesobtenues avec les autres récepteurs activateurs. Son engagement par les AcMor thérapeutiques a produit desréponses fonctionnelles variables selon l’AcMor, et selon les donneurs de cellules. La perte d’expression duCD16a membranaire s’est révélé être un marqueur sensible de l’activation des cellules NK, même quand cedernier n’était pas engagé. Enfin, l’emploi de d’inhibiteur d’ADAM17 (TMI-2 et TIMP3) a permis d’observerle maintien de l’expression du CD16a après activation cellulaire sans augmenter les réponses fonctionnelles.Ce travail souligne la place centrale de l’engagement du CD16a dans l’activation NK. / NK cell can trigger ADCC (Antibody Dependent Cytotoxicity) through the engagement of theFc!RIIIa/CD16a receptor, and « Natural Cytotoxicity » after integration of cellular signals coming from theiractivating and inhibitory receptors. Moreover, activated NK cells produce cytokines such as IFN-!.Engagement by monoclonal antibodies (mAb) of CD16a was strongly more efficient than that of any otheractivating receptor to induce degranulation and IFN-! synthesis. Functional responses depend on thetherapeutic mAb used to engage CD16a and on the donor of NK cells. CD16a down-modulation was a verysensitive marker of NK cell activation, whatever the mean of activation. It was inhibited in the presence ofTMI-2 and TIMP3 (ADAM17 inhibitors), whereas CD16-dependent functional responses were not increased.This work highlighted the major role of the CD16a receptor in the activation of NK cells.

Actuellement, 60% des médicaments sur le marché ont pour cible des protéines membranaires. Toutefois, l'étude de ces protéines membranaires reste un challenge de par leur structure particulière (domaines transmembranaires hydrophobes et domaines extra- et intra-cellulaires hydrophiles), mais également par leur faible expression sur les cellules.L'entreprise Ciloa, dans laquelle j'ai effectué ma thèse, a développé une technologie brevetée, qui permet d'exprimer à la surface des exosomes, des vésicules membranaires de tailles comprises entre 30 et 100nm, des protéines membranaires natives, grâce à un peptide d'adressage, le DCTM. Cette technologie possède de nombreux domaines d'applications, comme le criblage de médicaments, le développement de vaccins ou encore le développement d'anticorps monoclonaux.L'objectif de ma thèse a été, dans un premier temps, de mettre en place l'outil exosomes recombinants grâce à la technologie de Ciloa et dans un deuxième temps, d'utiliser ces outils pour le développement d'anticorps, grâce aux exosomes recombinants.Ainsi, j'ai d'abord mis au point différentes techniques de caractérisation des exosomes recombinants (ELISA), et également participé à la mise en place de différents protocoles de production et de purification, en fonction leur utilisation. Une fois ces outils optimisés, j'ai pu les utiliser pour le développement d'anticorps. J'ai testé en parallèle deux méthodes de production d'anticorps, une méthode classique, l'hybridation lymphocytaire après immunisation de souris BALB/c, et une méthode plus récente, le criblage d'une banque de scFvs par phage display.L'hybridation lymphocytaire a permis la production d'hybridomes, dont les anticorps ont été criblés sur exosomes, par ELISA. Dans le cadre du criblage par phage display, j'ai participé au développement d'une banque de scFvs, basée sur le modèle du 13R4, dont nous avons modifié les longueurs de boucles des différents CDRs, notamment le CDRH3, afin de cibler les épitopes faiblement accessibles des protéines membranaires. Les sélections de scFvs ont été effectuées sur exosomes recombinants, exprimant des protéines membranaires. / Nowadays, more than 60% of marketed drugs target membrane proteins. However, their study still represents a challenge, essentially due to their particular 3D-structure (hydrophobic transmembrane domains and hydrophilic extra- and intra-cellular domains), but also to their low expression level in cells.Ciloa, the start-up company in which I realized my PhD, has developed a patented technology that enables to express native membrane proteins on exosomes, membrane vesicles of 30 to 100nm, using a pilot peptide called DCTM (for Cytosolic Domain of TransMembrane). This technology displays a lot of different applications, in different domains such as drug screening, vaccines development or monoclonal antibodies (mAbs) development.The purpose of my PhD research was, first, to set up the recombinant exosomal tool using Ciloa's innovative technology, and then to use this tool to develop monoclonal antibodies.Thus, at the beginning of my PhD, I set up exosomal characterization technics, such as ELISA, and I also took part in the setup of several production and purification protocols, depending of the use of exosomes. Once these tools had been optimized, I was able to use them to develop mAbs. I tested two methods, one classical, the generation of hybridoma after Balb/c mice immunizations, and a more recent technology, the screening of scFvs library by phage display.Therefore, I obtained hybridoma and was able to screen the derived antibodies by ELISA on exosomes. Concerning the phage display technology, I took part in the development of a new scFvs library, based on the 13R4 scaffold, of which we changed the CDRs lengths, mostly the CDRH3, in order to target epitopes with low accessibility, such as the one of membrane proteins. The library screening was realized on recombinant exosomes.

Le cancer colorectal est le troisième cancer le plus répandu dans le monde avec plus d’un million de patients diagnostiqués chaque année, dont 50% auront une évolution métastatique de leur maladie. Les récentes études pour améliorer les traitements du cancer colorectal métastatique (CCRm) ont permis le développement d’anticorps monoclonaux, le cetuximab et le panitumumab, capables d’inhiber l’activation des récepteurs au facteur de croissance épidermique (EGFR) et les voies de signalisation en aval (RAS/RAF/MAPK et PI3K/AKT/mTOR), responsables de la croissance cellulaire, la prolifération, l’inhibition de l’apoptose, l’invasion et de l’évolution métastatique. Cependant, dans les études incluant des patients dont les tumeurs sont « RAS sauvage », c’est à dire exemptes de mutation des gènes KRAS et NRAS, le taux de réponse aux thérapies à base de cetuximab ou du panitumumab sont de l’ordre de 40 à 60% seulement, ce qui signifie qu’une grande partie des patients traités échappent au traitement par le biais d’autres mécanismes. La présence d’altérations d’autres gènes comme PIK3CA, BRAF est responsable en partie des cas où les patients ne présentent pas de réponse. De plus, la surexpression ou l’altération de protéine comme PTEN, PI3K, AKT impliquées dans les voies de signalisation RAS/RAF/MAPK et PI3K/AKT/mTOR peuvent avoir un impact significatif sur la prolifération cellulaire ou l’apoptose. L’absence ou la surexpression des protéines sous leur forme active phosphorylée pourrait présenter un intérêt pour prédire la réponse aux anti-EGFR chez les patients dont les tumeurs sont « RAS sauvage ». Dans ce travail, nous avons tout d’abord développé des techniques pour le génotypage des gènes RAS et PIK3CA à partir d’échantillons de tumeurs colorectales fixées au formol et incluses en paraffine, puis dans un second temps, nous avons validé ces méthodes selon la norme ISO 15189, puis dans un dernier temps, nous avons étudié l’expression des phosphoprotéines en aval des récepteurs à l’EGF ainsi que les statuts mutationnels des gènes KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA à partir de 100 échantillons de tumeurs congelées issues de patients atteints d’un CCRm et traités par un anti-EGFR. Sur 100 échantillons de tumeurs, 60 ne présentaient pas de mutation des gènes RAS. Parmi les patients dont les tumeurs ne présentaient pas de mutation des gènes RAS, 45,0% présentaient une réponse tumorale partielle ou complète et 55,0% étaient en maladie stable ou évolutive lorsqu’ils étaient traités par un anti-EGFR. Les patients dont les tumeurs présentaient une mutation des gènes RAS avaient une survie sans progression (PFS) significativement plus faible (HR=3.04 [1.91; 4.83];p<0.001) ainsi qu’une survie globale (OS) plus faible (HR=2.49 [1.56; 3.97];p<0.001). La PFS et la survie globale (OS) étaient significativement plus élevées chez les patients dont les tumeurs étaient « RAS sauvage ». L’expression de pAKT, pERK1/2 et pMEK1 étaient significativement plus faibles chez les patients dont les tumeurs étaient sauvages que chez les patients présentant des tumeurs RAS mutées (p=0,0246 ; p=0,004 ; p=0,0110 respectivement) et aucune différence significative d’expression entre les tumeurs RAS sauvage et RAS mutées n’a été démontrée pour pEGFR, pGSK3, pIGFR et pP90SRK. Chez les patients présentant des tumeurs RAS sauvage, le taux de réponse était significativement supérieur pour les tumeurs surexprimant pEGFR et pAKT au dessus des seuils calculés (p=0,0258 et p=0,0277 respectivement). Aucune différence significative n’a été trouvée entre le taux de réponse et l’expression des autres phosphoprotéines. Notre étude montre qu’associer la mesure de l’expression des phosphoprotéines de signalisation en aval d’EGFR, à l’analyse du statut mutationnel des gènes RAS, BRAF, PIK3CA pourrait présenter un intérêt dans la prédiction de la réponse aux thérapies anti-EGFR chez les patients atteints d’un cancer colorectal métastatique / Colorectal cancer is the third most common cancer worldwide with more than one million patients diagnosed each year, among 50% will develop metastatic disease. Recent efforts to improve the treatment of metastatic colorectal cancer (mCRC) has led to the development of monoclonal antibodies such as cetuximab and panitumumab, that inhibit the activation of the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) and its downstream pathways (namely RAS/RAF/MAPK and PI3K/AKT/mTOR) that promote cell growth, proliferation, inhibition of apoptosis, invasion and metastasis. However, from studies including “RAS wild-type” i.e. KRAS and NRAS wild-type tumors, the response rates to cetuximab or panitumumab therapy ranged from only 40 to 60% which results in a large fraction of patients without any known causes for treatment failure. The presence of alterations in other genes such as PIK3CA or BRAF in the EGFR-dependent signaling pathways is responsible for some of the non-responding cases. Moreover, overexpression or alterations of proteins such as PTEN, PI3K, AKT, involved in the RAS/RAF/MAPK or PI3K/AKT/mTOR signaling pathways can have a significant impact on cell proliferation or apoptosis. Absence or overexpression of proteins under their active phosphorylated forms may be of interest to predict response to anti-EGFR in RAS wild-type patients. In this work, we first developed assays to assess RAS and PIK3CA mutations in formalin fixed paraffin embedded colorectal tumors, then we validated these assays according to ISO 15189 and we finally studied expression of downstream signalling phosphoproteins and KRAS, NRAS, BRAF and PIK3CA status in 100 frozen samples of patients with mCRC and treated with anti-EGFR. Among the 100 tumor samples, 60 were RAS wild-type. Among the RAS wild-type patients, 45.0% achieved a complete or partial response, and 55.0% had a stable disease or progression (p<0.001) when treated with anti-EGFR. Patients with a RAS mutation had significant lower progression-free survival (PFS) (HR=3.04[1.91; 4.83];p<0.001) and overall survival (OS) (HR=2.49[1.56; 3.97];p<0.001). PFS and OS were significantly higher in RAS wild-type patients. Expression of pAKT, pERK1/2 and pMEK1 was significantly lower in RAS wild-type patients than in RAS mutated patients (p=0.0246; p=0.004; p=0.0110 respectively) and no significant difference was observed between RAS wild-type and RAS mutated tumors in the expression of pEGFR, pGSK3, pIGFR, pP70S6K and pP90SRK. In RAS wild-type patients, response rate was significantly higher for tumors that overexpressed pEGFR and pAKT above the calculated threshold (p=0.0258 and p=0.0277 respectively). No significant relation was found between response rate and the level of expression of the other phosphoproteins. Our study shows that combining the analysis of the expression of EGFR downstream signalling phosphoproteins, RAS, BRAF or PIK3CA status could be of interest to predict the response to anti-EGFR therapies in patients with mCRC