SOUZA, Elizabeth Ribeiro Yokobatake. Atividade antifúngica in vitro de estatinas sobre espécies de candida e cryptococcus. 2011. 96 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-06-26T12:14:28Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_erysouza.pdf: 1529070 bytes, checksum: bec5e50bfee0b3880c94980ee63697d6 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-07-04T11:48:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_erysouza.pdf: 1529070 bytes, checksum: bec5e50bfee0b3880c94980ee63697d6 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-04T11:48:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_erysouza.pdf: 1529070 bytes, checksum: bec5e50bfee0b3880c94980ee63697d6 (MD5) Previous issue date: 2011 / Nos últimos anos, as infecções oportunistas fúngicas, especialmente, candidíase, criptococose e se tornaram mais frequentes, devido ao aumento no número de indivíduos imunocomprometidos, tais como a SIDA, o transplante e pacientes de cancro e os que estão em terapia imunossupressora. Apesar de ser eficaz, por vezes é necessário utilizar novas drogas como alternativa ou como adjuvantes de modo a potenciar o efeito da terapia antifúngica clássica. As estatinas são os medicamentos hipolipemiantes mais prescritos em todo o mundo para a prevenção de doenças cardiovasculares. No entanto, outros efeitos benéficos para estas drogas foram descritas, tais como o controlo de infecções. Este trabalho teve como objetivo determinar a atividade antifúngica das estatinas contra Candida spp. e Cryptococcus spp. As concentrações inibitórias mínimas (MICs) para três diferentes estatinas (pravastatina, sinvastatina e atorvastatina) foram determinadas contra 51 cepas de Candida spp. (16 de C. albicans, 11 C. Krusei, C. tropicalis, 12 C. parapsilosis e 12) e 25 estirpes de Cryptococcus spp. (12 e 13 C. gattii C. neoformans), através do ensaio de microdiluição em meio líquido, de acordo com o Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI - Documento M27-A3). A concentração de ensaio para a pravastatina variou de 50-0,0977 mg / mL, no caso da simvastatina, variou 1-0,0020 mg / ml e, para a atorvastatina, que variou de 10-0,0200 mg / ml. A pravastatina inibe 37 estirpes de Candida, com MICs variando 1,56-6,25 mg / mL e as amostras restantes não foram inibidas, mesmo na maior concentração testada (50 mg / mL). Simvastatina e atorvastatina, por outro lado, todas as estirpes inibiram 51 Candida avaliada, apresentando MICs, variando de 0,02 a 1 mg / ml e 0,04-5 mg / mL, respectivamente. Relativamente Cryptococcus spp., Apenas quatro estirpes foram inibidas por pravastatina (CIM = 25 mg / mL), enquanto todas as 25 estirpes foram inibidas por sinvastatina (0,06 ≤ CIM ≤ 1 mg / mL) e oito foram inibidos por atorvastatina (0,62 ≤ CIM ≤ 2,5 mg / mL) e os restantes 17 não eram sensíveis à concentração máxima testada atorvastatina (10 mg / mL). As concentrações fungicidas mínimas (CFM) para as estatinas testadas também foram determinadas. O MFC para a pravastatina contra Candida spp. foi determinada contra 15 cepas (3,12 ≤ MIC ≤ 25 mg / mL). Os valores de MFC para sinvastatina foram determinados para 34 cepas de Candida spp. (0,03 ≤ MFC ≤ 1 mg / mL), enquanto que aqueles para a atorvastatina foram determinados contra 16 estirpes (0,04 ≤ MFC ≤ 0,31 mg / mL). Quanto Cryptococcus spp., As 25 cepas testadas, os valores de MFC para pravastatina foram encontrados contra três cepas (MFC = 50 mg / mL), enquanto os de sinvastatina foram determinadas contra 21 cepas (0,12 ≤ MFC ≤ 1 mg / mL) e aqueles para atorvastatina foram determinados contra uma única estirpe (MFC = 1 mg / mL). Esta actividade inibidora in vitro de estatinas contra Cândida spp. e Cryptococcus spp. cria uma perspectiva importante para a utilização destes fármacos in vivo, a fim de controlar as infecções fúngicas. / O aumento nn ultimos Anos de indivíduos imunocomprometidos, Como Portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, de Doenças malignas, transplantados e To Us Link Usuarios de terapias imunossupressoras, favorece o surgimento de Infecções oportunistas, principalmente como de Teor fúngico, Como a candidíase ea criptocócica. Apesar de a terapia antifúngica Atual Ser Eficiente na maioria dos Casos, algumas Vezes fazem necessárias SE-Novas Drogas Que atuem COMO ALTERNATIVA UO Como coadjuvantes sem Tratamento parágrafos potencializar Ø EFEITO DOS Antifúngicos utilizados. Como estatinas São fármacos hipolipemiantes Mais prescritos mundialmente parágrafo Doenças cardiovasculares. EntreTanto, recentemente, Tem Sido descritos To Us Link efeitos benéficos destas Drogas, Como, Por Exemplo, o Controle de Infecções. Este Trabalho Teve Como Objetivo determinar um ATIVIDADE antifúngica in vitro das estatinas ante 51 cepas de Candida, Sendo 16 de C. albicans, 11 de C. krusei, 12 de C. tropicalis e 12 de C. parapsilosis, e 25 cepas de Cryptococcus, Sendo 12 de C. gattii e 13 de C. neoformans, Por Meio de testes de microdiluição los caldo, Segundo Documento M27-A3 padronizado Pelo CLSI. O Intervalo de Concentração Testado parágrafo pravastatina was de 50 a 0,0977 mg / mL, parágrafo sinvastatina, 1 a 0,0020 mg / mL e parágrafo atorvastatina, 10 a 0,0200 mg / mL. Pravastatina inibiu 37 Leveduras fazer Gênero Candida apresentando Concentração inibitória minima (CIM) na Faixa de 1,56 a 6,25 mg / mL e como cepas restantes Localidade: Não FORAM MESMO inibidas na Maior Concentração testada (50 mg / mL), enquanto Opaco sinvastatina e atorvastatina apresentaram ATIVIDADE antifúngica sobre TODAS como 51 cepas avaliadas, apresentando CIM de 0,02 a 1 mg / ml e 0,04 de mg / ml, 5,00 respectively. Pará o Gênero Cryptococcus, apenas quatro cepas FORAM inibidas ante a pravastatina (CIM = 25 mg / mL), Por Outro Lado, sinvastatina inibiu TODAS as 25 cepas (CIM = 0,06 a 1 mg / mL), e atorvastatina apenas oito cepas (CIM = 0,62 a 2,5 mg / mL), Sendo Que como 17 restantes Localidade: Não FORAM MESMO inibidas na Maior Concentração testada (≥ 10 mg / mL). FOI determinada Concentração fungicida minima (CFM) de pravastatina sobre 15 cepas fazer Gênero Candida (CFM = 3,12 a 25 mg / mL), de sinvastatina sobre 34 cepas (CFM = 0,03 a 1 mg / mL), e de atorvastatina sobre 16 cepas (CFM = 0,04 a 0,31 mg / mL). Pará o Gênero Cryptococcus, das 25 cepas testadas, pravastatina exibiu apenas sobre CFM três cepas (CFM = 50 mg / mL), sinvastatina sobre 21 cepas (CFM = 0,12 a 1 mg / mL), e atorvastatina sobre uma cepa (CFM = 1 mg / mL). ESTA ATIVIDADE inibitória in vitro de estatinas sobre Espécies de Candida e Cryptococcus, abre UMA Perspectiva de suma importância par a Investigação fazer Possível USO destas Drogas com Finalidade antifúngica in vivo.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-08-26Bitstream added on 2014-06-13T18:43:05Z : No. of bitstreams: 1 silva_hr_dr_arafcf.pdf: 2348065 bytes, checksum: c63f75a77b4cb78f5b87a6170be20a8f (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Nas últimas décadas, tem ocorrido um aumento expressivo na incidência de infecções fúngicas. Por outro lado, o tratamento das micoses nem sempre é efetivo, pois os fármacos antifúngicos disponíveis apresentam espectro de atividade e perfil farmacocinético inadequados, em especial no tratamento das lesões cutâneas. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver e caracterizar sistemas nanoestruturados estabilizados com álcool cetílico etoxilado 20 OE e propoxilado 5 OP (PROC) contendo fluconazol (FLU), empregando ácido oléico (AO) e óleo de copaíba como fases oleosas. A caracterização química, seguida de ensaios biológicos, dos óleos de copaíba de diferentes fontes, foi determinante para a escolha do óleo a ser usado no desenvolvimento das formulações. A construção de diagramas de fases com ambos os óleos mostrou que diferentes sistemas como microemulsões (ME) e cristais líquidos (CL) podem ser formados. A caracterização físico-química (MLP, SAXS e Reologia) mostrou que na região de 40% de PROC, o aumento da quantidade de água favorece a formação de sistemas mais estruturados como CL de fase lamelar e hexagonal quando se utiliza AO e óleo de copaíba... / In the last decades, there has been an expressive increase in incidence of fungal infections. On the other hand, the treatment of mycoses is not always effective, because available antifungal drugs show inappropriate activity spectrum and pharmacokinetic profile. The aim of this work was to develop and characterize nanostructured systems stabilized by propoxyl (5OP) ethoxyl (20 OE) cethyl alcohol (PROC) containing fluconazole, using oleic acid and copaiba oil from different origins as oily phases. Chemical and biological characterization of copaiba oils from different origins was decisive for the choice of oil to be used in the development of the formulations. The construction of phase diagrams with studied copaiba oils showed that different systems such as microemulsions (ME) and liquid crystals (CL) can be formed. The characterization by polarized light microscopy, rheological behavior and SAXS confirmed the results obtained in phase diagrams, showing that in the region of 40% of PROC, the increase in the quantity of water favors the formation of more structured systems as CL of lamellar and hexagonal phase... (Complete abstract click electronic access below)

A incidência e gravidade de doenças fúngicas têm aumentado significativamente, apresentando elevados índices de morbidade e mortalidade. Além disso, a emergência de fungos resistentes aos fármacos disponíveis e a escassez de agentes antifúngicos seguros tem tornado ainda mais crítico o controle desses micro-organismos. Portanto, as atuais circunstâncias justificam a nossa pesquisa destinada a caracterizar a atividade anti-Candida e antidermatofítica, obter informações sobre o mecanismo de ação antifúngico e avaliar parâmetros toxicológicos de análogos de 8-hidroxiquinolina. Cinco derivados da 8-hidroxiquinolinas foram avaliados: clioquinol (composto 1), ácido 8-hidroxiquinolinil-5-sulfônico (composto 2), ácido 7-iodo-8-hidroxiquinolinil-5-sulfônico (composto 3), 8-hidroxiquinolinil-5-(N-4-clorofenil)sulfonamida (PH151) e 8-hidroxiquinolinil-5-(N-4-metoxifenil)sulfonamida (PH153). As 8-hidroxiquinolinas mostraram atividade antifúngica para todos os isolados de Candida e dermatófitos testados. Clioquinol 1 foi o composto que apresentou menores valores de CIM, seguido das sulfonamidas (PH151 e PH153) e ácidos sulfônicos (composto 2 e 3). Os compostos foram fungistáticos para C. albicans e fungicidas para dermatófitos (exceto PH151). A modelagem PK/PD mostrou EC50 variando entre 0,181 - 0,306 μg/mL para clioquinol 1, 0,873 - 1,329 μg/mL para PH151 e 7,105 - 8,865 μg/mL para PH153. Em relação aos mecanismos de ação envolvidos, todos os derivados mostraram efeito sobre a parede celular fúngica. Os ácidos sulfônicos 2 e 3 comprometeram, também, a integridade funcional da membrana plasmática; e clioquinol 1, PH151 e PH153 inibiram a formação de pseudo-hifas em C. albicans. Ainda, clioquinol 1 exibiu ação sobre biofilme de Candida formado em microplaca de poliestireno e em dispositivo intrauterino. Clioquinol 1, PH151 e PH153 mostraram ótimos efeitos antifúngicos via oral em D. melanogaster imunodeficientes infectadas com C. albicans. Os derivados da 8-hidroxiquinolina apresentaram baixa toxicidade em modelos alternativos como pele de orelha de porco, D. melanogaster e embriões de galinha. O composto 3 foi o único que demonstrou toxicidade nesses modelos, uma vez que foi letal para o embrião de galinha. Os estudos com embriões e larvas de zebrafish foram realizados apenas com os derivados PH151 e PH153 e mostraram mortalidade dependente da dose. A aparente toxicidade foi detectada nas fases embrio-larval, logo, não se pode inferir sobre potencial toxicidade em adultos; mas podem servir de alerta para uma possível embriotoxicidade. Em conjunto, os dados deste estudo apoiam o potencial do clioquinol 1, PH151 e PH153 para tratar candidíase sistêmica e dermatomicose. Por fim, estes compostos demonstram ser candidatos antimicóticos apropriados para avançar em estudos com roedores. / The incidence and severity of fungal diseases have significantly increased, presenting high morbidity and mortality rates. In addition, the emergence of drug-resistant fungi and the scarcity of safe antifungal agents have become the control of these microorganisms even more critical. Therefore, the current circumstances justify our research designed to characterize anti-Candida and antidermatophytic activity, gain insights into the antifungal action mechanism and to evaluate toxicological parameter of 8-hydroxyquinoline analogues. Five 8-hydroxyquinoline derivatives were evaluated: clioquinol (compound 1), 8-hydroxy-5-quinolinesulfonic acid (compound 2), 8-hydroxy-7-iodo-5-quinolinesulfonic acid (compound 3) 8-hydroxyquinoline-5-(N-4-chlorophenyl)sulfonamide (PH151) and 8-hydroxyquinoline-5-(N-4-methoxyphenyl)sulfonamide (PH153). The 8-hydroxyquinolines showed antifungal activity for all Candida and dermatophytes tested. Clioquinol 1 was the compound that presented lower MIC values, followed by sulfonamides (PH151 and PH153) and sulfonic acids (compounds 2 and 3). The compounds were fungistatic for C. albicans and fungicides for dermatophytes (except PH151). PK/PD modeling showed EC50 ranging from 0.181 - 0.306 μg/mL for clioquinol 1, 0.873 - 1.329 μg/mL for PH151 and 7.105 - 8.865 μg/mL for PH153. Regarding the mechanisms of action involved, all derivatives showed effect on the fungal cell wall. Sulphonic acids 2 and 3 also compromised the functional integrity of the cytoplasmic membrane; and clioquinol 1, PH151 and PH153 inhibited the formation of pseudohyphas in C. albicans. Further, clioquinol 1 exhibited action on Candida biofilm formed on polystyrene microplate and intrauterine device. Clioquinol 1, PH151 and PH153 showed excellent oral antifungal effects in immunodeficients D. melanogaster infected with C. albicans. The 8-hydroxyquinoline derivatives showed low toxicity in alternative models such as pig ear skin, D. melanogaster and chicken embryos. Compound 3 was the only one that demonstrated toxicity in these models, since it was lethal to the chicken embryo. Studies with zebrafish embryos and larvae were performed only with the PH151 and PH153 derivatives and showed dose-dependent mortality.The apparent toxicity was detected in the embryo-larval stages, therefore, it is not possible to infer about potencial toxicity in adults; but may be an alert for possible embryotoxicity.Taken together, data from this study support the potential of clioquinol 1, PH151 and PH153 to treat systemic candidiasis and dermatomycosis. Finally, these compounds demonstrate to be appropriate antimycotic candidates to advance in rodent models.

A incidencia de infecções por espécies patogênicas de Candida vem crescendo e Candida albicans é a espécie que continua sendo a mais prevalente nas candidíases. Entretanto, observa-se o aumento no número de infecções por espécies emergentes de Candida não-albicans (CNA). Neste trabalho é avaliada a prospecção de novas moléculas e biopolímeros com atividade antifúngica e antibiofilme sobre cepas de Candida. Formulações de enxaguantes bucais foram desenvolvidas a partir do sal imidazólico cloreto de 1-n-hexadecil-3-metilimidazólico (C16MImCl) e selenocianatos alílicos 1-3. As formulações de enxaguantes bucais contendo C16MImCl na ausencia ou presença de sorbato de potássio (F1, F2, respectivamente), apresentaram uma Concentração Inibitória Mínima (CIM) de 50 μg/mL e os selenocianatos alílicos 1-3 apresentaram atividade antibiofilme pelo método cristal violeta (150 μg/mL). Os resultados expressos em Unidades Formadoras de Colônia (UFC/mL) e corante (brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) confirmaram que a formulação F2 exerceu um efeito antibiofilme similar ou mesmo maior do que F3 (presença de cloreto de cetilpiridinio - CP) e Colgate®. A formulação contendo selenocianatos alílicos 1 e 3, ambos na ausencia ou presença de sorbato de potassio, exibiram o mesmo nível de atividade antibiofilme para C. tropicalis (UFC/cm2). A técnica da Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) avaliou as formulações contendo C16MImCl e selenocianatos alílicos (1-3) sobre a resina acrílica e foram observadas ausência de arquitetura de biofilme e material de matriz extracelular. A técnica Hens Egg Test-Chorion Allantoic Membrane (HET-CAM) também foi empregada e os compostos em estudo não foram irritantes. Sugere-se que o C16MImCl e os selenocianatos alílicos (1-3) são potentes candidatos a agentes antifúngicos e antibiofilmes para o desenvolvimento de formulações de enxaguantes bucais. Alem disso, foram utilizados agentes antifúngicos comerciais, como anidulafungina (AND), Anfotericina (AMB), Cetoconazol (CTZ), Itraconazol (ITR), bem como C16MImCl e o CP com o intuito de avaliar a susceptibilidade de Candida spp na presença dos polímeros (PVOH, álcool polivinílico altamente amorfo e PDDA, cloreto de poli(dialildimetilamônio) em diferentes proporções de polímero/fármaco (1:1, 99:1 e 1:99). O PVOH não apresentou CIMs capazes de inibir o crescimento de todos os fungos testados. Quando o PVOH foi associado, verificou-se a eficácia de quatro dos seis fármacos testados (CTZ, ITR, C16MImCl e AND), mostrando também ampla atividade antifúngica contra Candida spp. Em alguns casos, em concentrações muito baixas quando comparadas aos fármacos puros. O PDDA em água apresentou atividade antifúngica. Seis antifúngicos (CTZ, ITR, CP, C16MImCl, AND e AMB) apresentaram seu efeito antifúngico potencializado quando associado ao polímero catiônico (PDDA). Verificou-se mudança no potencial zeta, tamanho de partícula e estrutura do fármaco/polímero indicando a possível formação de micelas que solubilizam os fármacos em água. Os resultados obtidos neste trabalho evidenciam fortes candidatos para a aplicação em várias áreas biomédicas, possibilitando o uso de uma série de fármacos antifúngicos de diferentes classes. / The incidence of infections by pathogenic species of Candida has been increasing and Candida albicans is the species that continues being the most prevalent in candidiasis. However, the number of other species of Candida non-albicans (CNA) is now higher. This work aims to evaluate the prospection of new molecules and biopolymers with antifungal activity and antibiofilm on strains of Candida. Mouthwashes formulations have been developed from the imidazolium salt 1-methyl-3-octylimidazole chloride (C16MImCl) and for allylic selenocyanates 1-3. The mouthwash formulations containing C16MImCl in the absence or presence of potassium sorbate (F1, F2, respectively) presented a Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of 50 μg/mL and the allylic selenocyanates 1-3 presented antibiofilm activity by crystal violet method (150 μg/mL). Both the colony forming units (CFU/mL) and (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) results confirmed that the F2 formulation exerted a similar antibiofilm effect or even greater than F3 (presence of the cetylpyridinium chloride compound - CP) and Colgate®. The data obtained for formulations containing the allylic selenocyanates (1-3) indicated that formulations containing 1 and 3 (both in the absence or presence of potassium sorbate) exhibited the same level of antibiofilm activity for C. tropicalis (in CFU/cm2). The Scanning electron microscopy (SEM) technique evaluated the formulations containing C16MImCl and allylic selenocyanates (1-3) on the acrylic resin and showed no biofilm architecture and extracellular matrix material. The Hens Egg Test-Chorion Allantoic Membrane (HET-CAM) technique was employed and the compounds under study were not irritating. It is suggested that C16MImCl and allyl selenocyanates (1-3) are potent candidates for antifungal and antibiofilms agents for the development of mouthwashes formulations. In addition, commercial antifungal agents as Anidulafungin (AND), Anfotericin (AMB), Ketoconazole (CTZ), Itraconazole (ITR), as well as C16MImCl and CP were used in order to evaluate the susceptibility of Candida spp in the presence or absence of polymers (PVOH, highly amorphous polyvinyl alcohol and PDDA, poly diallyl dimethyl ammonium chloride)) in different polymer/drug ratios (1:1; 99:1 and 1:99). PVOH did not present MICs capable of inhibiting the growth of all fungi tested. When PVOH was associated the efficacy of four of the six drugs tested (CTZ, ITR, C16MImCl and AND) was demonstrated, showing broad antifungal activity against Candida spp. In some cases, in very low concentrations when compared to pure drugs. PDDA in water showed antifungal activity. Six antifungals (CTZ, ITR, CP, C16MImCl, AND and AMB) had their antifungal effect potentiated when associated with the cationic polymer (PDDA). Change in zeta potential, particle size and and structure of the drug/polymer indicating the possible formation of micelles that solubilize the drugs in water.The results obtained in this work show strong candidates for the application in several biomedical areas, allowing the use of a series of antifungal drugs of different classes.

As leveduras basidiomicéticas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são os agentes etiológicos da criptococose. A infecção se desenvolve via inalação e disseminação até o sistema nervoso central, causando lesões pulmonares e meningoencefalite, a principal causa de morte da criptococose. Estes fungos patogênicos causam aproximadamente um milhão de casos por ano, principalmente entre pacientes imunocomprometidos, resultando em aproximadamente 625.000 mortes. O tratamento da criptococose emprega altas doses dos fármacos anfotericina B e 5-flucitosina, seguido de longa monoterapia com fluconazol. Este tratamento é caracterizado pela nefrotoxicidade e hepatotoxicidade. Além destes efeitos tóxicos, o surgimento de linhagens resistentes a estes compostos leva à necessidade de novas estratégias terapêuticas, dentre as quais podem ser citadas moléculas obtidas de fontes vegetais. O composto natural plumieridina, extraído de Allamanda polyantha (uma planta nativa brasileira), possui atividade antifúngica. Com o objetivo de elucidar as bases moleculares desta atividade, uma biblioteca de mutantes de C. gattii obtida por transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens foi triada utilizando distintas concentrações deste composto, tendo como referencial o valor de MIC para a linhagem selvagem de C. gattii. Foram encontrados dez mutantes sensíveis e um mutante resistente a plumieridina e os fatores de virulência clássicos foram avaliados. A identificação dos genes inativados pelo T-DNA revelou o possível envolvimento de algumas proteínas no mecanismo molecular de plumieridina, tais como lisofosfolipídeo aciltransferase, transportador de colina, protease rhomboide, transportador de arsenito ATPase, proteína BAG e subunidade N6 do complexo regulatório 26S proteasoma. Estas proteínas estão relacionadas com diferentes processos biológicos ligados a via de sinalização Unfolded Protein Response (UPR). Esses resultados indicam um complexo processo celular desencadeado por estresse de retículo endoplasmático, afetando indiretamente várias vias, o que sugere um novo mecanismo de ação para um fármaco antifúngico em potencial. / The basidiomycete yeasts Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are the etiologic agents of cryptococcosis. The infection proceeds via inhalation and dissemination of yeast cells to the central nervous system, causing lung injury and meningoencephalitis, which is the major cause of death on cryptococcosis. These fungal pathogens cause one million cases per year among immunocompromised patients mainly, resulting in nearly 625,000 deaths. The treatment of cryptococcosis uses high doses of amphotericin B and 5-flucytoseine, followed by long fluconazole monotherapy. This regime is characterized by nephrotoxicity and hepatotoxicity. In addition to these toxic effects, the emergence of strains resistant to these compounds leads to the need of new therapeutic strategies, among which molecules obtained from plant sources. The natural compound plumieridine, extract from Allamanda polyantha (a Brazillian native plant), has antifungal activity. In order to elucidate the molecular basis of plumieridine antifungal activity, a C. gattii mutant library obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation was screened using distinct plumieridine concentrations based on MIC value for C. gattii wild type. One resistant and ten susceptible mutants were found and the classical virulence factors were evaluated. The genome-wide screening revealed the possible involvement of some proteins in molecular mechanisms of plumieridine, such as lysophospholipid acyltransferase, choline transporter, rhomboid protease, arsenite transporting ATPase, BAG Protein and 26S proteasome regulatory subunit N6. These proteins are related with different biological process linked to Unfolded Protein Response (UPR) signaling pathway. This result suggests a complex cell process triggered by endoplasmic reticulum stress with many pathways indirectly affected by plumieridine, displaying a novel mechanism of action in a potential antifungal agent.

Cryptococcus gattii é um patógeno emergente que infecta principalmente indivíduos imunocompetentes, causando criptococose. Dentre os tratamentos estão anfotericina B e fluconazol, porém são insuficientes na erradicação da doença. A estimulação da resposta imune por vacinas de DNA em diversos modelos fúngicos vem sendo relatados. Dentre as proteínas fúngicas candidatas no desenvolvimento de vacinas estão às proteínas 14-3-3, as quais foram identificadas como proteínas imudominantes em estudos de proteômica de Cryptococcus neoformans e C. gattii e em soro de pacientes com criptococose. O objetivo deste estudo foi realizar a construção do vetor recombinante contendo a região codificante do gene 14-3-3, seguido da análise preliminar da resposta imune em camundongos imunizados. A região codificante do 14-3-3 foi clonada em vetor de expressão eucariótico pcDNA3.1(+) e a funcionalidade do vetor recombinante foi confirmada a nível transcricional por RT-PCR a partir de células A549 transfectadas com a vacina de DNA e a nível traducional por imunobloting. A proteína 14-3-3 foi ainda localizada na parede celular da levedura, revelado por metodologias de microscopia por imunofluorescência. A porção codificante do gene 14-3-3 de C. gattii foi clonada em vetor de expressão pET23-d e a proteína recombinante foi expressa em células de E. coli BL21 e purificada por cromatografia de afinidade a níquel. A resposta imune humoral foi determinada por dosagem de imunoglobulinas, porém não ocorreu diferença estatística na indução de imunoglobulinas totais em camundongos inoculados com a vacina. Assim esse trabalho contribuiu para o estudo imunogenicidade da proteína 14-3-3 em C. gattii permitindo possíveis estudos em outros modelos animais usando a mesma estratégia profilática. / Cryptococcus gattii is an emerging pathogen that mainly infects immunocompetent individuals, causing cryptococcosis. Among the treatments are amphotericin B and fluconazole, but they have proven insufficient in eradicating this disease. The immune responses stimulation by DNA vaccines in several fungal models has been reported. Among fungal candidate proteins in vaccine development are the 14-3-3 proteins, which were identified as immunodominant sera proteins in Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii proteomics and in serum of patients with cryptococcosis. The study aimed to construct a recombinant vector containing the 14-3-3 coding region, followed by the immune response preliminary analysis of immunized mice. The 14-3-3 gene was cloned into a eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+) vector and RT-PCR confirmed the recombinant transcriptional level functionality from A549 transfected with DNA vaccine cells and translational level by immunoblotting. The 14-3-3 protein was localized associated with the yeast cell wall, as revealed by immunofluorescence microscopy. The coding portion of the 14-3-3 C. gattii gene was cloned into pET23-d expression vector and the recombinant protein was expressed in E. coli BL21 and purified by nickel affinity chromatography. The humoral immune response was determined by serum total immunoglobulin measurements, but no statistical differences were observed in total immunoglobulins from vaccine-inoculated mice. Thus, this research contributed to 14-3-3 C. gattii protein immunogenicity study, allowing possible researches in other animal models applying the same prophylactic strategy.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:48:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

MALAQUIAS, Ângela Donato Maia. Efeito inibitório in vitro de miltefosina frente à cepas de histoplasma capsulatum var. capsulatum e sporothrix spp. 2013. 88 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-12-08T14:21:57Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_âdmmalaquias.pdf: 1142026 bytes, checksum: ae8a52759fb515a2f09f79d7d4c3f6e0 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-12-08T14:22:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_âdmmalaquias.pdf: 1142026 bytes, checksum: ae8a52759fb515a2f09f79d7d4c3f6e0 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-08T14:22:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_âdmmalaquias.pdf: 1142026 bytes, checksum: ae8a52759fb515a2f09f79d7d4c3f6e0 (MD5) Previous issue date: 2013 / istoplasma capsulatum var. capsulatum and Sporothrix spp. are dimorphic fungi, pathogenic, causing histoplasmosis and sporotrichosis, respectively, being able to affect humans and other animals. Although the commonly used antifungal therapy is effective for the treatment of such fungal infections, some drawbacks may be mentioned, as the need for treatment for prolonged periods, as well as by the high toxicity of amphotericin B. Moreover, refractory cases and recurrences have been described. This scenario has driven the search for new agents that have antifungal activity. Some studies have shown that certain drugs already used clinically in the treatment of non-fungal etiology diseases may have significant antifungal potential. The miltefosine, originally developed as anticancer agent and currently used in the treatment of leishmaniasis, has demonstrated a significant antifungal activity against various fungal pathogens. Based on the above, this study aimed to evaluate the antifungal activity in vitro of miltefosine against the dimorphic fungi H. capsulatum var. capsulatum and S schenckii complex species including S. brasiliensis, S. schenckii, S. globosa and S. mexican, by broth microdilution technique standard by CLSI. The results showed that miltefosine inhibitory effect in vitro against H. capsulatum var. capsulatum and Sporothrix spp. being able to inhibit the growth of all strains analyzed. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) values obtained ranged from 0.25 to 2 mg.L-1 for H. capsulatum var. capsulatum the filamentous phase and from 0.125 to 1 ug.mL-1 in the yeast phase. For Sporothrix spp. filamentous phase in the MIC range was from 0.25 to 2 mg.L-1. The Minimum Fungicidal Concentration (MFC) values were ≤ 4 mg L-1 for both species analyzed. Thus, the present study demonstrated for the first time the relevant antifungal activity of miltefosine against H. capsulatum var. capsulatum and Sporothrix spp. It is noteworthy that more studies are necessary to evaluate the applicability of miltefosine in vivo and validate its use as an alternative to support the treatment of patients with histoplasmosis and sporotrichosis. / Histoplasma capsulatum var. capsulatum e Sporothrix spp. são fungos dimórficos, patogênicos, causadores da histoplasmose e da esporotricose, respectivamente, sendo capazes de acometer o homem e outros animais. Embora a terapia antifúngica comumente utilizada seja eficiente para o tratamento dessas micoses, algumas desvantagens podem ser apontadas, como a necessidade de tratamento por tempo prolongado, bem como, a elevada toxicidade apresentada pela anfotericina B. Ademais, casos de refratariedade e recidivas já foram descritos. Esse cenário tem impulsionado a busca por novos agentes que apresentem atividade antifúngica. Alguns estudos tem demonstrado que determinadas drogas já empregadas clinicamente no tratamento de doenças de etiologia não-fúngica podem apresentar potencial antifúngica relevante. A miltefosina, originalmente desenvolvida como agente anticâncer e atualmente utilizada no tratamento da Leishmaniose, tem demonstrado uma importante atividade antifúngica contra diferentes patógenos fúngicos. Baseado no exposto, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a atividade antifúngica in vitro da miltefosina ante aos fungos dimorficos H. capsulatum var. capsulatum e as espécies do complexo S. schenckii, incluindo S. brasiliensis, S. schenckii, S. globosa e S. mexicana, por meio da técnica de microdiluição em caldo padronizada pelo CLSI. Os resultados obtidos mostraram que a miltefosina possui efeito inibitório in vitro frente H. capsulatum var. capsulatum e Sporothrix spp. sendo capaz de inibir o crescimento de todas as cepas analisadas. Os valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) obtidos variaram de 0,25 a 2 μg mL-1 para H. capsulatum var. capsulatum na fase filamentosa e de 0,125 a 1 μg mL-1 na fase leveduriforme. Para Sporothrix spp. na fase filamentosa o intervalo de CIM foi de 0,25 a 2 μg mL-1. Os valores de Concentração Fungicida Mínima (CFM) foram ≤ 4 μg mL-1 para ambas as espécies analisadas. Assim, o presente estudo demonstrou pela primeira vez a relevante atividade antifúngica da miltefosina ante H. capsulatum var. capsulatum e Sporothrix spp. Vale ressaltar, que mais estudos ainda são necessários para avaliar a aplicabilidade da miltefosina in vivo e validar a sua utilização como uma alternativa para subsidiar o tratamento de pacientes com histoplasmose e esporotricose.

MACÊDO, Ramila de Brito. Efeito da inibição da calcineurina pela ciclosporina a em células planctônicas e biofilme de complexo Candida parapsilosis. 2013. 100 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-05-11T16:04:52Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_rmmacêdo.pdf: 1193560 bytes, checksum: e505455412f2ac097fd97d4f6409d323 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-05-11T16:06:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_rmmacêdo.pdf: 1193560 bytes, checksum: e505455412f2ac097fd97d4f6409d323 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-11T16:06:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_rmmacêdo.pdf: 1193560 bytes, checksum: e505455412f2ac097fd97d4f6409d323 (MD5) Previous issue date: 2013 / Candida parapsilosis Complex comprises three species, C. parapsilosis sensu stricto, C. metapsilosis and C. orthopsilosis, which have the same phenotypic characteristics, can be differentiated only by the genotype using PCR with restriction enzyme. The C. parapsilosis Complex is gaining prominence in the global epidemiology of candidiasis to be the second or third most isolated species, moreover, reports of resistance to some antifungal agents are worrying. Calcineurin molecule also responsible for resistance to antifungal drugs and thinking of new molecular targets with the objective of this study was to evaluate the potential synergistic antifungal and calcineurin inhibitor, cyclosporin A, against planktonic and biofilm forms of strains C. parapsilosis Complex from clinical sources. The susceptility assays with amphotericin B, fluconazole, voriconazole, caspofungin and cyclosporin A were performed by microdilution in accordance with the guidelines of the Clinical Laboratory Standards Institute. The method board in microdilution assay performed tests for synergism against planktonic cells of strains of C. parapsilosis Complex. Antifungal combinations formed by cyclosporin A were evaluated against biofilms forming and mature in polystyrene plates, where differences in the pattern of antifungal susceptibility among species were observed, but strains of C. parapsilosis sensu stricto were more sensitive to cyclosporin A to C. orthopsilosis and C. metapsilosis. Synergism between the antifungal and cyclosporin A was observed in strains of C. parapsilosis Complex. The combinations formed by antifungal and cyclosporin A were able to prevent the growth of the species in the planktonic phase of the complex, as well as in biofilm formation in CIM10X and CIM50X and showed inhibitory effect against mature biofilms of C. parapsilosis sensu stricto, C. metapsilosis and C. orthopsilosis in CIM50X. These results support the potential of inhibiting fungal calcineurin as a promising approach for increasing the efficiency of antifungal drugs. / O Complexo Candida parapsilosis compreende três espécies, C. parapsilosis stricto sensu, C. metapsilosis e C. orthopsilosis, que possuem características fenotípicas iguais, podendo ser diferenciadas apenas pelo genótipo utilizando a técnica de PCR com enzima de restrição. O Complexo C. parapsilosis vem ganhando destaque na epidemiologia mundial da candidíase por ser a 2a ou 3a espécies mais isolada, além disso, relatos de resistência a alguns antifúngicos são preocupantes. A calcineurina molécula responsável, também, pela resistência aos antifúngicos e pensando em novos alvos moleculares para as drogas que o objetivo desse trabalho foi, avaliar o potencial sinérgico de antifúngicos e do inibidor de calcineurina, ciclosporina A, contra formas planctônicas e biofilmes de cepas do Complexo C. parapsilosis de origens clínicas. Os ensaios de sensibilidade com anfotericina B, fluconazol, voriconazol, caspofungina e ciclosporina A foram realizadas pela técnica de microdiluição, em conformidade com as orientações do Clinical Laboratory Standards Institute. Os testes de sinergismo contra células planctônicas de cepas do Complexo C. parapsilosis foram realizados pelo método de Checkerboard, em ensaio de microdiluição. Combinações formadas por antifúngicos com ciclosporina A foram avaliados contra biofilmes em formação e maduros, em placas de poliestireno, onde diferenças no padrão de sensibilidade aos antifúngicos entre as espécies não foram observadas, porém cepas de C. parapsilosis stricto sensu foram mais sensíveis à ciclosporina A que C. orthopsilosis e C. metapsilosis. O sinergismo entre os antifúngicos e ciclosporina A foi observado em cepas do Complexo C. parapsilosis. As combinações formadas por antifúngicos e ciclosporina A foram capazes de impedir o crescimento das espécies do Complexo na fase planctônica, bem como, na formação de biofilme nas CIM10X e CIM50X e mostrou efeito inibitório contra biofilmes maduros de C. parapsilosis stricto sensu, C. metapsilosis e C. orthopsilosis nas CIM50X. Os resultados obtidos reforçam o potencial de inibição da calcineurina fúngica como uma abordagem promissora para aumentar a eficiência de drogas antifúngicas.

As leveduras basidiomicéticas Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são os agentes etiológicos da criptococose. A infecção se desenvolve via inalação e disseminação até o sistema nervoso central, causando lesões pulmonares e meningoencefalite, a principal causa de morte da criptococose. Estes fungos patogênicos causam aproximadamente um milhão de casos por ano, principalmente entre pacientes imunocomprometidos, resultando em aproximadamente 625.000 mortes. O tratamento da criptococose emprega altas doses dos fármacos anfotericina B e 5-flucitosina, seguido de longa monoterapia com fluconazol. Este tratamento é caracterizado pela nefrotoxicidade e hepatotoxicidade. Além destes efeitos tóxicos, o surgimento de linhagens resistentes a estes compostos leva à necessidade de novas estratégias terapêuticas, dentre as quais podem ser citadas moléculas obtidas de fontes vegetais. O composto natural plumieridina, extraído de Allamanda polyantha (uma planta nativa brasileira), possui atividade antifúngica. Com o objetivo de elucidar as bases moleculares desta atividade, uma biblioteca de mutantes de C. gattii obtida por transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens foi triada utilizando distintas concentrações deste composto, tendo como referencial o valor de MIC para a linhagem selvagem de C. gattii. Foram encontrados dez mutantes sensíveis e um mutante resistente a plumieridina e os fatores de virulência clássicos foram avaliados. A identificação dos genes inativados pelo T-DNA revelou o possível envolvimento de algumas proteínas no mecanismo molecular de plumieridina, tais como lisofosfolipídeo aciltransferase, transportador de colina, protease rhomboide, transportador de arsenito ATPase, proteína BAG e subunidade N6 do complexo regulatório 26S proteasoma. Estas proteínas estão relacionadas com diferentes processos biológicos ligados a via de sinalização Unfolded Protein Response (UPR). Esses resultados indicam um complexo processo celular desencadeado por estresse de retículo endoplasmático, afetando indiretamente várias vias, o que sugere um novo mecanismo de ação para um fármaco antifúngico em potencial. / The basidiomycete yeasts Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are the etiologic agents of cryptococcosis. The infection proceeds via inhalation and dissemination of yeast cells to the central nervous system, causing lung injury and meningoencephalitis, which is the major cause of death on cryptococcosis. These fungal pathogens cause one million cases per year among immunocompromised patients mainly, resulting in nearly 625,000 deaths. The treatment of cryptococcosis uses high doses of amphotericin B and 5-flucytoseine, followed by long fluconazole monotherapy. This regime is characterized by nephrotoxicity and hepatotoxicity. In addition to these toxic effects, the emergence of strains resistant to these compounds leads to the need of new therapeutic strategies, among which molecules obtained from plant sources. The natural compound plumieridine, extract from Allamanda polyantha (a Brazillian native plant), has antifungal activity. In order to elucidate the molecular basis of plumieridine antifungal activity, a C. gattii mutant library obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation was screened using distinct plumieridine concentrations based on MIC value for C. gattii wild type. One resistant and ten susceptible mutants were found and the classical virulence factors were evaluated. The genome-wide screening revealed the possible involvement of some proteins in molecular mechanisms of plumieridine, such as lysophospholipid acyltransferase, choline transporter, rhomboid protease, arsenite transporting ATPase, BAG Protein and 26S proteasome regulatory subunit N6. These proteins are related with different biological process linked to Unfolded Protein Response (UPR) signaling pathway. This result suggests a complex cell process triggered by endoplasmic reticulum stress with many pathways indirectly affected by plumieridine, displaying a novel mechanism of action in a potential antifungal agent.