AGUIAR, F. R. M. Biofilmes do complexo Sporothrix schenckii: formação e sensibilidade in vitro. 2016. 97 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-01-18T14:13:06Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_frmaguiar.pdf: 2310499 bytes, checksum: 79ee5f07e4f132b127796c1e72156695 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-01-18T14:13:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_frmaguiar.pdf: 2310499 bytes, checksum: 79ee5f07e4f132b127796c1e72156695 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-18T14:13:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_frmaguiar.pdf: 2310499 bytes, checksum: 79ee5f07e4f132b127796c1e72156695 (MD5) Previous issue date: 2016-11-17 / Sporotrichosis is a cosmopolitan subcutaneous mycosis, found mainly in tropical and subtropical areas of Latin America, caused by species of Sporothrix schenckii complex. The aim of this study was to demonstrate the capacity of Sporothrix schenckii complex to produce in vitro biofilms and to determine the profile of these biofilms against to classical antifungal drugs. Four species from Sporothrix schenckii complex were used: S. brasiliensis (n=10), S. schenckii sensu stricto (n=2), S. globosa (n=2) and S. mexicana (n=4). The formation of biofilms was performed by transferring inoculum of 2 x 105 conidia/mL for microdilution plates, which were incubated at 25 °C for 5 days. After each day of incubation, XTT and Crystal Violet assays were made to determine the metabolic activity and biomass of biofilm, respectively. For susceptibility tests, three different concentrations (planktonic MIC, 10 x MIC and 50 x MIC) of antifungals amphotericin B (AMB), caspofungin (CAS), ketoconazole (KTC), voriconazole (VRC) and fluconazole (FLC) were transferred to biofilm wells, which were incubated for 72 hours at 25 °C. The biofilms profile then antifungal drugs presence was determined by the XTT and crystal violet assays. Biofilms were produced in Thermanox™ coverslips for viewing by optical microscopy with congo-red staining, scanning electron microscopy and confocal microscopy. It was found that all species from S. schenckii complex are strong biofilm-forming, with no difference formation between them. Absorbance of biofilm after drug exposure showed that biomass and metabolic activity was significantly reduced (p<0.05), mainly in S. brasiliensis. Antifungal drugs tested showed metabolic activity and biomass reduction, especially at concentrations 50 times higher than the planktonic MICs, demonstrating the protective increase in sessile form when compared for planktonic form. / A esporotricose é uma micose subcutânea cosmopolita, encontrada, principalmente, em áreas tropicais e subtropicais da América Latina, sendo causada por espécies do complexo Sporothrix schenckii. O objetivo deste estudo foi demonstrar a capacidade de fungos do complexo S. schenckii de produzir biofilmes in vitro e determinar o perfil desses biofilmes frente às drogas antifúngicas clássicas. Foram utilizadas 4 espécies do complexo Sporothrix schenckii: S. brasiliensis (n=10), S. schenckii sensu stricto (n=2), S. globosa (n=2) e S. mexicana (n=4). A formação dos biofilmes foi feita através da transferência de inóculos de 2 x 105 conídios/mL para placas de microdiluição, que foram incubadas a 25 °C por 5 dias. Após cada dia de incubação, realizaram-se ensaios de XTT e Cristal violeta, para se determinar a atividade metabólica e biomassa dos biofilmes, respectivamente. Para os ensaios de sensibilidade, três concentrações diferentes (MIC planctônico, 10 x MIC e 50 x MIC) dos antifúngicos anfotericina B (AMB), caspofungina (CAS), cetoconazol (KTC), voriconazol (VRC) e fluconazol (FLC) foram transferidas para os poços com biofilmes, que foram incubados por 72 horas a 25 °C. O perfil dos biofilmes frente às drogas antifúngicas foi determinado através de ensaios de XTT e cristal violeta. Biofilmes foram produzidos em lamínulas de Thermanox™ para visualização através de microscopia óptica com coloração de vermelho-congo, microscopia eletrônica de varredura e microscopia confocal. Verificou-se que todas as espécies do complexo S. schenkii são fortes formadoras de biofilme, não havendo diferença de formação entre as espécies. A absorbância dos biofilmes após exposição às drogas demonstrou que a biomassa e a atividade metabólica foram reduzidas de forma significativa (p<0,05), principalmente, em S. brasiliensis. Os antifúngicos testados mostraram redução na atividade metabólica e biomassa, principalmente, em concentrações 50 vezes maiores que os MICs planctônicos, demonstrando o incremento protetivo que a forma séssil possui frente à forma planctônica.

SILVA, M. L. Q. Efeito inibitório, in vitro, do iodeto de potássio e da miltefosina frente a cepas do complexo Sporothrix schenckii em biofilme nas formas filamentosa e leveduriforme. 2017. 101 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Carolinda Oliveira (ppgmm@ufc.br) on 2017-07-25T13:00:39Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_mlqsilva.pdf: 3395668 bytes, checksum: 9d859dba369e701a53a5f7efc26ee845 (MD5) / Rejected by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com), reason: O arquivo não contém a ficha catalográfica on 2017-07-25T14:07:14Z (GMT) / Submitted by Carolinda Oliveira (ppgmm@ufc.br) on 2017-07-25T14:26:30Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_mlqsilva.pdf: 2729686 bytes, checksum: d1a30aeaf4deef4c304eae181976aaa2 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-07-25T15:37:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_mlqsilva.pdf: 2729686 bytes, checksum: d1a30aeaf4deef4c304eae181976aaa2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-25T15:37:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_mlqsilva.pdf: 2729686 bytes, checksum: d1a30aeaf4deef4c304eae181976aaa2 (MD5) Previous issue date: 2017-07-13 / The most infections are caused by microorganisms associated with biofilms and it has been recently demonstrated that dimorphic fungus, belonging the etiological agent of Sporotrichosis Sporothrix schenkii complex, is also able to form biofilm. Microorganisms when associated in biofilms may develop resistance to antibiotic therapy. The objective of this study was to evaluate the ability of S. schenckii complex yeasts to form biofilm, in vitro, as well as characterize the growth kinetics and susceptibility of filamentous and yeast biofilms to potassium iodode (KI) and miltefosine (MIL). Eighteen strains of S. schenckii complex (10 S. brasiliensis, 4 S. mexicana, 2 S. globosa and 2 S. schenckii sensu stricto) were used. For the formation of yeast biofilms, inoculums at the concentration of approximately 1 x 106 CFU / mL were used in 0.9% saline solution and maturation was done in RPMI medium. For the growth kinetics and sensitivity of biofilms, the techniques of metabolic activity and biomass evaluation were performed. For the planktonic sensitivity, the broth dilution technique was used, according to the CLSI methodologies. And for the biofilm morphology were evaluated by optical microscopy, SEM and confoval.The maturation time of yeast biofilms was, in average, 96 h. Results showed that KI and MIL had an inhibitory effect against all strains, in planktonic form (filamentous and yeast phases). The MICvalues ranged from 62.5 to 250 mg/mL for KI and from 0.125 to 4 μg/mL for MIL. Afterward, drugs were tested against mature biofilms of Sporothrix spp., at following concentrations: MIC, 10 x MIC and 50 x MIC.The metabolic activity and biomass of filamentous biofilms was inhibited by KI (10 x MIC) with a meanof 75.4%and MIL (50xMIC) inhibited, on average, 55.1%. For biofilms in yeast phase, the mean inhibition for KI (10 x MIC) and MIL (50 x MIC) was 67.7% and 51.6%, respectively. This study demonstrated that strains of various species of S. schenckii complex in yeast phase are able to form biofilm in vitro, and that potassium iodide and miltefosine have an inhibitory effect against filamentous and yeast biofilms. / Sabe-se que a maior parte das infecções são ocasionadas por microrganismos associados em biofilme e estudos demonstram que o fungo dimórfico, pertencente ao complexo Sporothrix schenkii, agente etiológico da esporotricose, também é capaz de formar biofilme. Os micro-organismos quando associados em biofilme, podem desenvolver resistência aos antimicrobianos. O objetivo desde estudo foi avaliar a capacidade do complexo S. schenckiide formar biofilme na forma leveduriforme,in vitro, assim como caracterizar a cinética de crescimento e a sensibilidade dos biofilmes na forma filamentosa e leveduriforme ao iodeto de potássio (KI) e à miltefosina (MIL). Foram utilizadas 18 cepas do complexo S. schenckii (10 S. brasiliensis, 4 S. mexicana, 2 S. globosa e 2 S. schenckii stricto sensu). Para a formação dos biofilmes leveduriformes foram utilizados inóculos na concentração de aproximadamente 1 x 106 UFC/mL em solução salina 0,9% e a maturação foi feita em meio RPMI. Para a cinética de crescimento e a sensibilidade dos biofilmes foram realizadas as técnicas de atividade metabólica e avaliação da biomassa. Para a sensibilidade plânctônica foi utilizada a técnica de diluição em caldo, conforme metodologias do CLSI.E para a morfologia dos biofilmes foram avaliadas pela microscopia óptica, MEV e confoval. O tempo de maturação dos biofilmes leveduriformes, foram em média de 96 h. Os resultados mostraram que KI e MIL tiveram efeito inibitório frente a todas as cepas, na forma planctônica, nas formas filamentosa e leveduriforme. Os valores de CIM variaram de 62,5 a 250 mg/mL para KI e de 0,125 a 4 µg/mL para MIL. Em seguida testou-se as drogas frente aos biofilmes maduros de Sporothrix spp., nas concentrações de CIM, 10xCIM e 50xCIM. Aatividade metabólica e a biomassa dos biofilmes filamentosos, foi inibida pelo KI (10xCIM) com média de 75,4%e a MIL(50xCIM) inibiu em média,55,1%. Para os biofilmes na forma leveduriforme, a média de inibição para KI (10 x CIM)e MIL (50 x CIM) foi de 67,7% e 51,6%, respectivamente. Este estudo demostrou que as cepas das diversas espécies do complexo S.schenckii na forma leveduriforme são capazes de formar biofilme in vitro, e que o iodeto de potássio e a miltefosina possuem efeito inibitório frente aos biofilmes filamentosos e leveduriformes.

MALAQUIAS, Ângela Donato Maia. Efeito inibitório in vitro de miltefosina frente à cepas de histoplasma capsulatum var. capsulatum e sporothrix spp. 2013. 88 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-12-08T14:21:57Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_âdmmalaquias.pdf: 1142026 bytes, checksum: ae8a52759fb515a2f09f79d7d4c3f6e0 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-12-08T14:22:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_âdmmalaquias.pdf: 1142026 bytes, checksum: ae8a52759fb515a2f09f79d7d4c3f6e0 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-08T14:22:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_âdmmalaquias.pdf: 1142026 bytes, checksum: ae8a52759fb515a2f09f79d7d4c3f6e0 (MD5) Previous issue date: 2013 / istoplasma capsulatum var. capsulatum and Sporothrix spp. are dimorphic fungi, pathogenic, causing histoplasmosis and sporotrichosis, respectively, being able to affect humans and other animals. Although the commonly used antifungal therapy is effective for the treatment of such fungal infections, some drawbacks may be mentioned, as the need for treatment for prolonged periods, as well as by the high toxicity of amphotericin B. Moreover, refractory cases and recurrences have been described. This scenario has driven the search for new agents that have antifungal activity. Some studies have shown that certain drugs already used clinically in the treatment of non-fungal etiology diseases may have significant antifungal potential. The miltefosine, originally developed as anticancer agent and currently used in the treatment of leishmaniasis, has demonstrated a significant antifungal activity against various fungal pathogens. Based on the above, this study aimed to evaluate the antifungal activity in vitro of miltefosine against the dimorphic fungi H. capsulatum var. capsulatum and S schenckii complex species including S. brasiliensis, S. schenckii, S. globosa and S. mexican, by broth microdilution technique standard by CLSI. The results showed that miltefosine inhibitory effect in vitro against H. capsulatum var. capsulatum and Sporothrix spp. being able to inhibit the growth of all strains analyzed. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) values obtained ranged from 0.25 to 2 mg.L-1 for H. capsulatum var. capsulatum the filamentous phase and from 0.125 to 1 ug.mL-1 in the yeast phase. For Sporothrix spp. filamentous phase in the MIC range was from 0.25 to 2 mg.L-1. The Minimum Fungicidal Concentration (MFC) values were ≤ 4 mg L-1 for both species analyzed. Thus, the present study demonstrated for the first time the relevant antifungal activity of miltefosine against H. capsulatum var. capsulatum and Sporothrix spp. It is noteworthy that more studies are necessary to evaluate the applicability of miltefosine in vivo and validate its use as an alternative to support the treatment of patients with histoplasmosis and sporotrichosis. / Histoplasma capsulatum var. capsulatum e Sporothrix spp. são fungos dimórficos, patogênicos, causadores da histoplasmose e da esporotricose, respectivamente, sendo capazes de acometer o homem e outros animais. Embora a terapia antifúngica comumente utilizada seja eficiente para o tratamento dessas micoses, algumas desvantagens podem ser apontadas, como a necessidade de tratamento por tempo prolongado, bem como, a elevada toxicidade apresentada pela anfotericina B. Ademais, casos de refratariedade e recidivas já foram descritos. Esse cenário tem impulsionado a busca por novos agentes que apresentem atividade antifúngica. Alguns estudos tem demonstrado que determinadas drogas já empregadas clinicamente no tratamento de doenças de etiologia não-fúngica podem apresentar potencial antifúngica relevante. A miltefosina, originalmente desenvolvida como agente anticâncer e atualmente utilizada no tratamento da Leishmaniose, tem demonstrado uma importante atividade antifúngica contra diferentes patógenos fúngicos. Baseado no exposto, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a atividade antifúngica in vitro da miltefosina ante aos fungos dimorficos H. capsulatum var. capsulatum e as espécies do complexo S. schenckii, incluindo S. brasiliensis, S. schenckii, S. globosa e S. mexicana, por meio da técnica de microdiluição em caldo padronizada pelo CLSI. Os resultados obtidos mostraram que a miltefosina possui efeito inibitório in vitro frente H. capsulatum var. capsulatum e Sporothrix spp. sendo capaz de inibir o crescimento de todas as cepas analisadas. Os valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) obtidos variaram de 0,25 a 2 μg mL-1 para H. capsulatum var. capsulatum na fase filamentosa e de 0,125 a 1 μg mL-1 na fase leveduriforme. Para Sporothrix spp. na fase filamentosa o intervalo de CIM foi de 0,25 a 2 μg mL-1. Os valores de Concentração Fungicida Mínima (CFM) foram ≤ 4 μg mL-1 para ambas as espécies analisadas. Assim, o presente estudo demonstrou pela primeira vez a relevante atividade antifúngica da miltefosina ante H. capsulatum var. capsulatum e Sporothrix spp. Vale ressaltar, que mais estudos ainda são necessários para avaliar a aplicabilidade da miltefosina in vivo e validar a sua utilização como uma alternativa para subsidiar o tratamento de pacientes com histoplasmose e esporotricose.

A esporotricose é uma doença crônica que envolve o tecido subcutâneo afetando seres humanos e animais, causada pelo fungo termodimórfico Sporothrix spp.. A esporotricose é endêmica na América latina, principalmente no Brasil que teve o maior surto zoonótico já registrado, ocorrendo na cidade do Rio de Janeiro. A espécie Sporothrix brasiliensis é a mais diagnosticada no surto e a mais virulenta entre as especies de Sporothrix spp., causando formas mais graves da doença. A esporotricose em gatos é endêmica, fatal e um dos principais fatores pelo alto número de casos no Rio de Janeiro. O tratamento é longo e não vem sendo o suficiente para conter o número de casos da doença. Uma vacina contra a esporotricose poderia mudar esse paradigma no Brasil. O presente trabalho obteve o proteoma da cepa S. brasiliensis 5110 por meio de uma eletroforese 2D, e caracterizou e identificou as possíveis proteínas imunogênicas do fungo por espectrometria de massa. Por meio de programas de predição, foi avaliado e sintetizado 7 sequências de aminoácidos,das proteínas identificadas com maiores chances de se acoplar a molécula MHC de classe II. Apenas 3 foram capazes de induzir proliferação in vitro, os peptídeos ZR3, ZR4 e ZR8, que foram utilizados como vacina na esporotricose subcutânea e avaliados sua eficácia por meio da carga fúngica, diâmetro das lesões, perfil celular e níveis de citocinas. Neste trabalho concluímos que o peptídeo ZR8 foi o melhor candidato à vacina na esporotricose, pois foi capaz de diminuir o diâmetro das lesões, aumentar os níveis de citocinas protetoras (IFN-&#947;, IL-17A e IL-1&#946;) e aumentar o número de células TCD4+ e CD3-/CD19+, sendo assim induzindo uma resposta imunológica protetora na esporotricose subcutânea. / Sporotrichosis is a chronic disease, which involves the subcutaneous tissue affecting humans and animals caused by the thermodymorphic fungus Sporothrix spp. Sporotrichosis is endemic in Latin America, mainly in Brazil that had the largest zoonotic outbreak ever recorded, occurring in the city of Rio de Janeiro. The Sporothrix brasiliensis is the species more diagnosed in the outbreak and most virulent, causing severe forms of the disease. Sporotrichosis in cats is endemic, fatal and the main factors due to the high number of cases of the disease in Rio de Janeiro. The treatment is long, and has not been enough to contain the number of cases of sporotrichosis. A vaccine against sporotrichosis could change this paradigm in Brazil. The present work obtained the proteome of S. brasiliensis 5110 strain by 2D electrophoresis, and characterized and identified possible immunogenic proteins by mass spectrometry. By prediction programs were evaluated and synthesized 7 peptide sequence from antigenic proteins that have the highest chances of coupling to the MHC class II molecule. From these 7 peptides only 3 were able to induce proliferation in vitro, called ZR3, ZR4 and ZR8 peptides, that were used as a vaccine in subcutaneous sporotrichosis and evaluated their efficacy through fungal load, lesion diameter, cell profile and cytokine levels. We conclude that ZR8 peptide was the best candidate for sporotrichosis vaccine, since it was able to decrease the lesion diameter, increase the levels of protective cytokines (IFN-&#947;, IL-17A and IL-1&#946;) and increase the number of CD4+ T cells and CD3-/CD19+ inducing a protective immune response in subcutaneous sporotrichosis.

A esporotricose é uma doença crônica que envolve o tecido subcutâneo afetando seres humanos e animais, causada pelo fungo termodimórfico Sporothrix spp.. A esporotricose é endêmica na América latina, principalmente no Brasil que teve o maior surto zoonótico já registrado, ocorrendo na cidade do Rio de Janeiro. A espécie Sporothrix brasiliensis é a mais diagnosticada no surto e a mais virulenta entre as especies de Sporothrix spp., causando formas mais graves da doença. A esporotricose em gatos é endêmica, fatal e um dos principais fatores pelo alto número de casos no Rio de Janeiro. O tratamento é longo e não vem sendo o suficiente para conter o número de casos da doença. Uma vacina contra a esporotricose poderia mudar esse paradigma no Brasil. O presente trabalho obteve o proteoma da cepa S. brasiliensis 5110 por meio de uma eletroforese 2D, e caracterizou e identificou as possíveis proteínas imunogênicas do fungo por espectrometria de massa. Por meio de programas de predição, foi avaliado e sintetizado 7 sequências de aminoácidos,das proteínas identificadas com maiores chances de se acoplar a molécula MHC de classe II. Apenas 3 foram capazes de induzir proliferação in vitro, os peptídeos ZR3, ZR4 e ZR8, que foram utilizados como vacina na esporotricose subcutânea e avaliados sua eficácia por meio da carga fúngica, diâmetro das lesões, perfil celular e níveis de citocinas. Neste trabalho concluímos que o peptídeo ZR8 foi o melhor candidato à vacina na esporotricose, pois foi capaz de diminuir o diâmetro das lesões, aumentar os níveis de citocinas protetoras (IFN-&#947;, IL-17A e IL-1&#946;) e aumentar o número de células TCD4+ e CD3-/CD19+, sendo assim induzindo uma resposta imunológica protetora na esporotricose subcutânea. / Sporotrichosis is a chronic disease, which involves the subcutaneous tissue affecting humans and animals caused by the thermodymorphic fungus Sporothrix spp. Sporotrichosis is endemic in Latin America, mainly in Brazil that had the largest zoonotic outbreak ever recorded, occurring in the city of Rio de Janeiro. The Sporothrix brasiliensis is the species more diagnosed in the outbreak and most virulent, causing severe forms of the disease. Sporotrichosis in cats is endemic, fatal and the main factors due to the high number of cases of the disease in Rio de Janeiro. The treatment is long, and has not been enough to contain the number of cases of sporotrichosis. A vaccine against sporotrichosis could change this paradigm in Brazil. The present work obtained the proteome of S. brasiliensis 5110 strain by 2D electrophoresis, and characterized and identified possible immunogenic proteins by mass spectrometry. By prediction programs were evaluated and synthesized 7 peptide sequence from antigenic proteins that have the highest chances of coupling to the MHC class II molecule. From these 7 peptides only 3 were able to induce proliferation in vitro, called ZR3, ZR4 and ZR8 peptides, that were used as a vaccine in subcutaneous sporotrichosis and evaluated their efficacy through fungal load, lesion diameter, cell profile and cytokine levels. We conclude that ZR8 peptide was the best candidate for sporotrichosis vaccine, since it was able to decrease the lesion diameter, increase the levels of protective cytokines (IFN-&#947;, IL-17A and IL-1&#946;) and increase the number of CD4+ T cells and CD3-/CD19+ inducing a protective immune response in subcutaneous sporotrichosis.

SILVA, Natalya Fechine. Estratégias de estocagem de sporothrix spp. e análise da sensibilidade das cepas ante aos derivados terpênicos farnesol e terpinen-4-ol in vitro. 2014. 62 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-04-29T13:40:44Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_nfsilva.pdf: 1031976 bytes, checksum: f1b00a7bbed02907d8e918295451ee8e (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-04-29T13:45:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_nfsilva.pdf: 1031976 bytes, checksum: f1b00a7bbed02907d8e918295451ee8e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-29T13:45:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_nfsilva.pdf: 1031976 bytes, checksum: f1b00a7bbed02907d8e918295451ee8e (MD5) Previous issue date: 2014 / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis that affects humans and animals caused by the dimorphic fungi of the genus Sporothrix. The storage of such microorganisms in culture collections is necessary to monitor the strains of Sporothrix spp. over the years. Despite the existence of effective antifungal therapies against this disease the search for new drugs for the treatment is necessary. Compounds such as farnesol and terpinen-4-ol have been tested against yeasts and filamentous fungi and have shown a broad antifungal spectrum. Thus, the present study aimed to seek new strategies for the preservation of biological and genetic patrimony of the genus Sporothrix, evaluate the in vitro inhibitory activity of farnesol and terpinen-4-ol against strains of Sporothrix spp., as well as evaluating the mechanisms of action of these compounds. Regarding the storage, 20 Sporothrix spp. strains were used and stocked under the following conditions: saline (0.9% NaCl) at 4 °C, 10% glycerol plus 10% lactose and 10% glycerol plus 10% sucrose maintained at -20 °C and -80 °C, stocked in intervals of 3, 6 and 9 months. The viability of the strains was evaluated by the macro and micromorphological aspects. For this purpose, the samples were subcultured in potato agar for seven days at 28 °C and evaluated for texture and pigmentation of the strains. For the micromorphological analysis, conidia count was performed using the ranges of 0-10, 10-50, 50-100 and >150 conidia as reference ranges. 40 Sporothrix spp. strains in the filamentous phase were used for the analysis of the inhibitory activity of the terpenes. The study was conducted using broth microdilution assay, described in M38-A2 document, standardized by CLSI. 16 Sporothrix spp. strains were used for the investigation of the mechanism of action of the terpenes in relation to the cell membrane permeability and readings were performed in a spectrophotometer at a wavelength of λ=260 nm, in order to verify the amount of nucleic acid and at λ=280 nm, in order to verify the amount of protein released into the medium. Sporothrix spp. strains showed 100% viability for growth on potato agar in all stock conditions tested, while in relation to the conidia count the stock methods that showed better results were saline at 4 °C, glycerol plus lactose and glycerol plus sucrose kept at -20 °C. The terpenes farnesol and terpinen-4-ol inhibited all Sporothrix spp. isolates tested with MIC values ranging from 0.015 to 1.0 mM for farnesol (geometric mean of 0.09) and 0.57 to 9.27 mM for terpinen-4-ol (geometric mean of 2.35). CFM values ranged between 0.125 to 4.0 mM and 1.15 to 37.1 mM for farnesol and terpinen-4-ol, respectively. Farnesol was the most active compound for all Sporothrix strains. There was no significant loss of intracellular material after treatment of fungal cells with concentrations of MIC and MIC/2 of terpenes tested when compared to the corresponding untreated samples. Therefore, it was observed that the terpenes showed no ability to lyse the Sporothrix cells, suggesting that its main mechanism of action is not associated with irreversible damage to the cell membrane structure. Thus, further studies are needed to better understand the mechanisms involved in the antifungal activity of the terpenes evaluated. / A esporotricose é uma micose subcutânea que acomete humanos e animais, causada pelos fungos dimórficos do gênero Sporothrix. A estocagem de tais micro-organismos em coleções de culturas se faz necessária para o monitoramento das cepas de Sporothrix spp. ao longo dos anos. Apesar da existência de terapias antifúngicas eficazes contra esta doença, a busca por novas drogas para o tratamento se faz necessária. Compostos como farnesol e terpinen-4-ol foram testados frente a leveduras e fungos filamentosos e têm demonstrado um amplo espectro antifúngico. Desta maneira, o presente trabalho teve por objetivo buscar novas estratégias de preservação do patrimônio biológico e genético de espécies do gênero Sporothrix, avaliar a atividade inibitória in vitro de farnesol e terpinen-4-ol frente a cepas de Sporothrix spp., bem como avaliar os mecanismos de ação desses compostos. Em relação à estocagem foram utilizadas 20 cepas de Sporothrix spp. nas seguintes condições: em solução salina (NaCl a 0,9%) à 4 °C, glicerol 10% acrescido de lactose 10% e glicerol 10% acrescido de sacarose 10% mantidas nas temperaturas de -20 °C e -80 °C, estocadas nos intervalos de tempo de 3, 6 e 9 meses. A viabilidade das cepas foi avaliada através dos aspectos macro e micromorfológicos. Para tanto, as amostras foram repicadas em ágar batata e, após sete dias de incubação a 28 °C foram avaliados quanto à textura e pigmentação das cepas. Para a análise micromorfológica foi feita a contagem de conídios, tendo como referência os seguintes intervalos de 0-10, 10-50, 50-100 e >150 conídios. Para a análise da atividade inibitória dos compostos foram utilizadas 40 cepas de Sporothrix spp. na fase filamentosa. O estudo foi desenvolvido utilizando ensaio de microdiluição em caldo, descrito no documento M38-A2, padronizado pelo CLSI. Para a investigação do mecanismo de ação das drogas em relação à permeabilidade da membrana celular, foram utilizadas 16 cepas de Sporothrix spp. e realizadas leituras em espectrofotômetro nos comprimentos de onda de λ = 260 nm, com intuito de verificar a quantidade de ácido nucleico e λ = 280 nm, com intuito de verificar a quantidade de proteína liberada no meio. As cepas de Sporothrix spp. apresentaram viabilidade de 100% para o crescimento em ágar batata em todas as condições de estoque testadas, enquanto que em relação à contagem de conídios os métodos de estoque que apresentaram melhor resultado foram a solução salina a 4°C, glicerol acrescido de lactose e glicerol acrescido de sacarose mantidos a -20°C. Os derivados terpênicos farnesol e terpinen-4-ol inibiram todos os isolados de Sporothrix spp. testados com valores de CIM variando de 0,015 a 1,0 μM para o farnesol (média geométrica de 0,09) e de 0,57 a 9,27 mM para terpinen-4-ol (média geométrica de 2,35). Os valores CFM variaram entre de 0,125 a 4,0 μM e de 1,15 a 37,1 mM para farnesol e terpinen-4-ol, respectivamente. Farnesol foi o composto mais ativo para as todas as cepas de Sporothrix. Não houve perda significativa de material intracelular após tratamento das células fúngicas com concentrações de CIM e CIM/2 dos terpenos testados quando comparados com as correspondentes amostras não tratadas. Dessa forma, foi possível observar que os terpenos não apresentaram capacidade de lise frente às células de Sporothrix, o que sugere que seu principal mecanismo de ação não está relacionado com danos irreversíveis na estrutura da membrana celular. Assim, novos estudos são necessários para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na atividade antifúngica dos terpenos avaliados.

A esporotricose é uma micose subcutânea caracterizada por lesões na pele e no tecido subcutâneo, ocasionada pela inoculação do Sporothrix schenckii. Essa doença apresenta as seguintes formas clínicas: cutânea localizada, linfocutânea e disseminada, podendo evoluir para uma forma sistêmica. O fungo causador da doença se apresenta em forma de hifas entre 25° e 30°C no ambiente e na forma leveduriforme a 37ºC nos tecidos. No meio ambiente seu crescimento depende de condições climáticas como umidade e temperatura. Determinados grupos de pessoas podem estar mais expostos ao agente causador da doença, como por exemplo, moradores de áreas rurais. Apesar de possuir uma distribuição mundial, a esporotricose possui maior prevalência em países de clima tropical e subtropical. No Brasil, relatos sobre a doença são frequentes. Desta forma o trabalho teve como objetivo a realização de um inquérito soroepidemiológico sobre a prevalência da esporotriciose em localidades rurais de quatro cidades do sul de Minas Gerais. Neste trabalho foi utilizado o teste de ELISA indireto no levantamento da soroprevalência da esporotricose. Dados obtidos nesta pesquisa numa população avaliada de 631 pessoas mostraram uma soroprevalência de 44,69%, ou seja, 282 pessoas com teste positivo para a esporotricose. A distribuição da soroprevalência para a esporotricose com relação a diferentes faixas etárias e gênero não apresentou diferença estatística significativa. É relatada, pela primeira vez, a soroprevalência da esporotricose em localidades rurais no sul do Estado de Minas Gerais, Brasil. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis characterized by lesions in the skin and subcutaneous tissue, caused by inoculation of Sporothrix schenckii. The disease has the following clinical forms: cutaneous fixed, lymphocutaneous and disseminated which can progress to a systemic infection. The fungus disease presents itself in the form of hyphae between 25° and 30° C in the ambient medium and yeast at 37 °C in tissues. Environmental growth depends on weather conditions such as humidity and temperature. Certain groups of people may be more exposed to the causative agent of disease, such as residents of rural areas. Despite having a worldwide distribution, sporotrichosis has most prevalent in tropical and subtropical countries. In Brazil, reports of the disease are frequent. In Brazil, reports of the disease are frequent. Thus the study aimed to carry out a seroepidemiological survey of the prevalence of esporotriciose in four rural locations in southern Minas Gerais. In this study we used indirect ELISA test on survey of the prevalence of sporotrichosis. Data obtained in this study evaluated a population of 631 individuals showed a prevalence of 44.69%, i.e. 282 people testing positive for sporotrichosis. The distribution of seroprevalence for sporotrichosis with respect to different age groups and gender showed no significant statistical difference. It is reported, for the first time, the seroprevalence of sporotrichosis in rural locations in the south of Minas Gerais State, Brazil. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Sporothrix schenckii és el fong dimòrfic responsable de la esporotricosi, una important infecció crònica de distribució mundial. En la present tesi a partir de la seqüenciació de tres gens estructurals (quitina sintasa, &#946;-tubulina i calmodulina) es demostra que S. schenckii és un complex d'espècies filogenètiques. S'ha realitzat un exhaustiu estudi fenotípic d'aquestes espècies i, combinant alguns dels diferents caràcters morfològics i fisiològics estudiats [presència/absència i morfologia de conidis sèssils pigmentats, taxes de creixement de les colònies (30, 35 i 37ºC) i assimilació de sacarosa, rafinosa i ribitol], es descriuen tres noves espècies per a la ciència: S. globosa, S. brasiliensis i S. mexicana. A més es demostra que S. albicans, fins ara considerada sinònima d'S. schenckii, i S. schenckii var. luriei són espècies diferents d'S. schenckii. En l'estudi de sensibilitat in vitro als antifúngics realitzat amb les diferents espècies del complex, es demostra que l'antifúngic més eficaç és la terbinafina, seguit del ketoconazol i el posaconazol. L'espècie més sensible ha resultat ser S. brasiliensis i les més resistents S. globosa i S. mexicana. En l'estudi de la patogènia en ratolins s'han trobat diferències en la virulència de les espècies del complex, essent S. brasiliensis i S. schenckii les més patògenes.Summary PhD ThesisMolecular and phenotypic characterization of Sporothrix schenckii Sporothrix schenckii is the pathogenic dimorphic fungus responsible for sporothrichosis, an important fungal infection with a worldwide distribution. Recently, molecular and phenotypic data seem to demonstrate that different genetic lineages exist within this species. For this reason we performed a morphological and molecular study involving numerous strains of clinical and environmental origins and from different countries. The analysis of partial sequences of the quitin synthase, &#946;-tubulin and calmodulin genes demonstrated that S. schenckii is a species complex. A combined analysis of the sequences of the three loci of 60 strains from different origins showed 6 phylogenetic species within this species demonstrating that most of these species prevail in different geographical regions. Since the delineation of of such species could be of extreme importance from a clinical point of view, we studied a total of 127 isolates, most of which were received as S. schenckii, including the available type strain of species currently considered synonyms, and also some close morphological species. We have phenotypically characterized all these isolates using different culture media, growth rates at different temperatures, and numerous nutritional tests and compared their calmodulin gene sequences, which previously was revealed as the most informative molecular marker of the three evaluated. The molecular analysis revealed that Sporothrix albicans, S. inflate and S. schenckii var. luriei are species that are clearly different from S. schenckii. The combination of these phonetic and genetic approaches allowed us to propose the new species Sporothrix brasiliensis, S. globosa, S. mexicana and S. luriei. The key phenotypic featudes for recognizing these species are the morphology of the sessile pigmented conidia, growth at 30, 35, and 37ºC, and the assimilation of sucrose, raffinose, and ribitol. In this thesis we also evaluated the in vitro activities of 12 drugs (amphotericin B, albaconazole, fluconazole, eberconazole itraconazole, ketoconazole, posaconazole, ravuconazole, voriconazole, terbinafine, micafungin and flucytosine) by using the microdilution method following the CLSI guidelines against 92 isolates belonging to the six species that constitute the sporotrhix schenckii complex. There were significant differences among the species, Sporothrix brasiliensis was the species that showed the best response to antifungals and S. mexicana was the worst. In general, terbinafine was the most active drug, followed by ketoconazole and posaconazole. Another objective of the present thesis was to perform a comparative study on the experimental pathogenicity of six species of Sporothrix of clinical interest, i.e. S. albicans, S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana, S. luriei and S. schenckii sensu stricto, it was performed using a murine model with immunocompetent mice. We used two different inocula, i.e., 1x108 conidia/ml and 1x105 conidia/ml, for each fungal strain tested. Two isolates of each species were used. Two inocula of each isolate, i.e. 1 x 108 and 1 x 105 conidia/ml, were tested, the animals being infected intravenously. Only the low inoculum of one isolate of S. brasiliensis and the high inoculum of the isolates of S. brasiliensis and S. schenckii were able to cause 100% mortality. The other inocula and species tested did not kill any animal.

Made available in DSpace on 2014-12-22T16:37:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 manoel_oliveira_ipec_mest_2009.pdf: 1307995 bytes, checksum: 3640ed583b88d4d2abacbd6bfad36521 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014-10-07 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A esporotricose, micose subcutânea causada pelo complexo Sporothrix schenckii, é cosmopolita e a mais freqüente na América Latina. Nos últimos anos tem aumentado significativamente o número de casos no Brasil, com destaque para o aumento no Estado do Rio de Janeiro na última década. Recentemente, foram consideradas quatro novas espécies dentro do gênero Sporothrix, sendo essas: Sporothrix brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e S. luriei. Entretanto somente 25 isolados de área endêmica no Rio de Janeiro foram incluídos nos estudos prévios. A caracterização destas foi realizada por meio da utilização de provas fenotípicas: morfologia de conídios, teste de crescimento à 30ºC, teste de termotolerância e auxonograma. No presente trabalho realizamos a caracterização de 248 isolados oriundos de pacientes atendidos no ambulatório de Dermatologia do IPEC, os quais tiveram diagnóstico de esporotricose durante a epidemia de esporotricose, no período de 1998 e 2008. De acordo com as características fenotípicas, 206 isolados (83,1%) foram caracterizados como S. brasiliensis, um isolado (0,4%) como S. mexicana, 15 (6,0%) como S. schenckii e em 26 isolados (10,5%) não foi possível realizar a caracterização da espécie sendo classificadas como Sporothrix spp Dentre esse isolados foi realizada a análise molecular de 8 (31%) isolados que apresentaram resultados inconclusivos nos estudos fenotípicos através do sequenciamento de um locus do gene calmodulina possibilitou a formação de um grande grupo constituído por 7 isolados todos caracterizados genotipicamente como pertencentes à espécie S. brasiliensis. A análise em nível de genótipo deve ser utilizada como ferramenta complementar na identificação de espécies do complexo Sporothrix. A correlação entre dados moleculares e características fenotípicas é fundamental na identificação de espécies complexo Sporothrix, possibilitando a implementação da taxonomia polifásica / Sporothrix schenckii is the species responsible for sporotrichosis, an important subcutaneous mycosis with a worldwide distri bution, and very frequent in Latin America, and it has been reported as endemic in Rio de Janeiro, Brazil. Recent molecular studies have demonstrated that this species constitutes a complex of numerous phylogenetic species, which were phenotipically characteri zed using different culture media, growth rates at different temperatur es, and nutritional tests as we ll comparison calmodulin genes and it was proposed four new species Sporothrix brasiliensis , Sporothrix globosa , Sporothrix mexicana and Sporothrix luriei . And just 25 isolates from the endemic occurring in Rio de Janeiro were included in this previous stu dy. We have studied a total of 248 Sporothrix isolates from this endemic obtaine d during the period of 1998 and 2008. The phenotypic characterization was based on th e morphology of conidia, growth rates at 30ºC and 37 ºC, ability to grow at 37 ºC, and auxonographic method. A ccording to the key features for species differentiation, 206 isolates (83.1%) were characterized as S. brasiliensis , one as S. mexicana (0.4%), 15 (6.0%) as S. schenckii and in 26 isolates (10.5%) the species was not differe ntiated being classified as Sporothrix spp. Among 8 (31%) of these unidentified isolates, molecular methodology, by sequence analysis of on protein coding locus (calmodulin) was perfor med, revealing the presence of one major clade, grouping 7 of these isolates with S. brasiliensis, representing this phylogenetic species. The analysis in genotype level should be used as complemental tool in the identification of species of the Sporothrix complex. The correlation among molecular data and phenotipe is fundamental in the identification of species Sporothrix complex , making possible the implementation of the polyphasic taxonomy

Made available in DSpace on 2015-10-16T12:52:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 raphael_rocha_ini_mest_2014.pdf: 642237 bytes, checksum: a802d37d83e724e2764f7f4a10726035 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-06-10 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A esporotricose é uma micose causada por espécies do complexo Sporothrix. Apesar do itraconazol ser o fármaco de escolha devido a sua efetividade e segurança, casos de falência terapêutica em gatos com esta micose têm sido descritos. O iodeto de potássio em cápsulas é uma opção terapêutica nos casos felinos. Adicionalmente, este fármaco é uma alternativa em pacientes humanos não responsivos ao itraconazol. A associação do iodeto de potássio e agentes antifúngicos pode apresentar melhores resultados quando comparada à monoterapia com estes fármacos. Foi realizado um estudo de coorte, o qual teve como objetivo descrever a resposta terapêutica ao iodeto de potássio em cápsulas via oral (5 mg/kg a cada 24 horas) associado ao itraconazol via oral (100 mg/gato a cada 24 horas) em gatos com esporotricose refratária ao itraconazol, assistidos no Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas/Fiocruz no período de 2012 a 2013. Foram incluidos no estudo 38 gatos, dos quais foi observado cura clínica em 24, falência terapêutica em cinco e óbito em três gatos Em seis casos houve abandono do tratamento. O tempo mediano de tratamento até a cura clínica foi 20 semanas. Vinte e nove animais apresentaram efeitos adversos clínicos, sendo 26 classificados como grau leve. Emagrecimento, hiporexia e vômitos foram os efeitos adversos clínicos mais observados. Quatro animais apresentaram efeitos adversos laboratoriais, representado pelo aumento dos valores das enzimas hepáticas. A utilização de iodeto de potássio em cápsulas associado ao itraconazol se mostrou um esquema terapêutico efetivo e seguro, sendo uma opção na esporotricose felina refratária ao itraconazol / Sporotrichosis is a fungal infection caused by Sporothrix species complex. Itraconazol is the drug of choice for the treatment of the disease due to its effectiveness and safety. However, cases of treatment failure in cats have been reported. Potassium iod ide capsules are an option for the feline cases. Additionally, the drug is an alternative to human patients unresponsive to itraconazole. The association of potassium iodide and antifungal agents may provide better results when compared to the monotherapy with these drugs. A cohort study was conducted, which aimed to describe the therapeutic response of oral potassium iodide (5 mg/kg every 24 hours) associated with oral itraconazole (100 mg/cat every 24 hours) in cats with sporotrichosis refractory to itrac onazole, followed up at the Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas/Fiocruz between 2012 and 2013. Of the 38 cats included in the study, 24 were cured, treatment failure oc urred in five and death in three cats. In six cases there was non - compliance with treatment. The median time from treatment until clinical cure with the combination was 20 weeks. Twenty - nine animals presented clinical adverse effects, which were classified as mild in 26 animals. Weight loss, hiporexia and vomiting were the most frequently observed. Four animals showed laboratory adverse effects represented by an increase in liver enzymes. The use of potassium iodide associated with itraconazole has proved to be an effective and safe therapeutic regimen and, therefore, represents an option in the treatment of feline sporotrichosis refractory to itraconazol.