Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6764_Dissertação Mestrado Antonio Caus.pdf: 14347190 bytes, checksum: 14c2d4fbdfd7802db6d74d01a7ed1227 (MD5) Previous issue date: 2013-08-27 / FAPES / Introdução:A Esporotricose é uma doença infecciosa causada pelo Sporothrix schenckii, fungo dimórfico de distribuição universal, caracterizada por lesões nodulares dos tecidos cutâneo e subcutâneo de homens e animais, com envolvimento linfático adjacente. Trata-se de uma doença rara,que carece de informações sobre sua epidemiologia e características clínicas no estado do Espírito Santo. Materiais e métodos: Estudo descritivo de uma série histórica, delineado para identificar o perfil clínico e pidemiológico da Esporotricose humana no estado do Espírito Santo a partir dos dados dos pacientes portadores da doença atendidos no serviço de Doenças Infecciosas do Hospital Universitário Cassiano Antônio Moraes (HUCAM), no período compreendido entre julho de 1982 e junho de 2012, utilizando informações de seus prontuários médicos para a construção do banco de dados. Resultados:Entre os 171 casos de Esporotricose humana incluídos no estudo, a maioria era do sexo masculino (80,70%) e de cor branca (89,16%) e a mediana de idade encontrada foi de33(DQ: 24 -47) anose cinco meses. Todos executavam atividades ocupacionais ou de lazer envolvendo contato direto com solo ou plantas (por exemplo, agricultura e jardinagem). Houve maior tendência de concentração de casos na região montanhosado estado, correspondente à região Serrana, nos períodos mais quentes e chuvosos. A evolução da doença até seu diagnóstico definitivo durou, em média, três meses(DP: dois a dez meses), sendo a forma linfocutânea a mais comum (70,17%), seguida pela forma cutânea fixa (28,65%), e a mão foi o principalponto de inoculação inicial do agente etiológico (26,32%). O diagnóstico foi estabelecido em 93,57% dos casos a partir da visualização do crescimento de colônias de S. schenckiiem meio de cultura ágar Sabouraud dextrose, sendo o restante feito pelas características clínicas da doença. A aspiração de secreção de nódulo cutâneo foi, comparativamente, o melhor método de coleta de espécime clínico para diagnóstico da doença. Solução de Iodeto de Potássio a 25% (SKI 25%) foi o tratamento administrado a quase todos os pacientes (98,83%) com sucesso terapêutico. Houve uma perda de seguimento de 36 (21,05%) casos, aos quais também foi atribuída a cura das lesões. Conclusões: Este estudo apresenta dados de crucial relevância para o Espírito Santo ao evidenciar umadoença infecciosa que, apesar de rara, é endêmica no estado, pouco conhecida e faz diagnósticos diferenciais importantes com outras doenças também endêmicas nesta região. Palavras-chave: Sporothrix; Esporotricose; Epidemiologia;Brasil. / Introduction: Sporotrichosis is an infectious disease caused by Sporothrix schenckii, a dimorphic fungus that has worldwide distribution, usually localized at the skin and subcutaneous tissue of humans and animals. It is a rare condition and there are no data concerning its clinical or epidemiological features in Espírito Santo state, Brazil. Material and methods: Descriptive case-series study to determine the clinical and epidemiological aspects of patients with human Sporotrichosis seen at the Infectious Diseases Department of the Hospital Universitário Cassiano Antônio Moraes (HUCAM), Vitória, ES, from 1982 – 2012. Results: Among the 171 cases of human Sporotrichosis included, 80.70% were male, 89.16% were white and the median age founded was 33.5 (DQ: 24 - 74) years-old. All patients had direct contact with soil and plants in work or in their leisure activities. Most of the cases were from a specific mountainous region of the state, the Região Serrana. The duration of symptoms before the definitive diagnosis was, on average, of three months (SD: two – ten months) and the lymphocutaneous form was the most common manifestation (70.17%), followed by the fixed cutaneous form (28.65%). Laboratorial diagnosis was established in 93.75% of the cases by direct visualization of S. schenckii colonies when cultured in Sabouraud dextrose agar and the rest of them were diagnosed only by clinical features of the disease. Comparatively, aspirate with purulent and seropurulent contents from gummy skin lesions was the best way to collect clinical specimens for diagnosing the Sporotrichosis. Treatment with oral 25% Potassium Iodide solution was implemented for almost all patients (98,83%) successfully. Treatment loss to follow-up occurred in only 36 patients (21.05%). Conclusions: The relevance of this study rests on showing the characteristics of a disease that, despite its rareness, is endemic in Espírito Santo state, not very known and makes important differential diagnosis with other common conditions in this region.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-04-17T13:33:41Z No. of bitstreams: 1 rebecamollima.pdf: 1811573 bytes, checksum: 85964eefdd3a90513fcac0f172c11491 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-04-18T13:41:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 rebecamollima.pdf: 1811573 bytes, checksum: 85964eefdd3a90513fcac0f172c11491 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-18T13:41:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rebecamollima.pdf: 1811573 bytes, checksum: 85964eefdd3a90513fcac0f172c11491 (MD5) Previous issue date: 2017-01-24 / A esporotricose é uma micose subcutânea de evolução subaguda a crônica capaz de afetar seres humanos e animais. Distribuída mundialmente, possui maior prevalência nas áreas de clima tropical e temperado, sendo a micose subcutânea mais comum na América do Sul. Seus agentes etiológicos são fungos do complexo Sporothrix schenckii, saprófitas e dimórficos, encontrados no ambiente. No Brasil, o aumento exponencial dos casos em humanos e animais vem sendo observado nas últimas décadas. Nos arredores do estado do Rio de Janeiro, já é observada uma epidemia de origem zoonótica. Aliado a isso, o tratamento desta micose vem sendo motivo de preocupação. O alto custo e toxicidade dos medicamentos, o tempo prolongado de tratamento, e o surgimento de linhagens resistentes aos fármacos de escolha justificam a demanda crescente pela descoberta de novos fármacos. Neste contexto, o presente estudo tem como objetivo identificar os componentes dos óleos essenciais de Myrtus communis L. e Thymus vulgaris L., investigar seus potenciais antifúngicos in vitro frente às principais linhagens causadoras de esporotricose no Brasil, e determinar a citotoxicidade preliminar dos óleos essenciais. Os óleos essenciais de mirta e tomilho foram obtidos comercialmente. O perfil cromatográfico obtido por CG para os dois óleos indicou elevados valores de monoterpernos, 87,1% para a mirta e 98,8% para o tomilho, tendo como componentes majoritários o 1-8 cineol e o timol, respectivamente. Para a avaliação da atividade antifúngica foram utilizadas as seguintes linhagens fúngicas: Sporothrix schenckii ATCC 1099-18, Sporothrix schenckii IPEC 15383, Sporothrix brasiliensis ATCC 5110 e Sporothrix brasiliensis IPEC 17943 e duas linhagens clínicas de Sporothrix schenckii, denominadas genericamente como A e B. O óleo essencial de mirta apresentou atividade antifúngica frente a todas as linhagens em concentrações que variaram de 31,25 a 62,5 µg/mL. Foi observada atividade fungicida frente a todas as linhagens em concentrações acima de 62,5 µg/mL. O óleo essencial de tomilho foi capaz de inibir todas as linhagens em concentrações que variaram de 125 a 250 µg/mL. Foi observada atividade fungicida frente a todas as linhagens em concentrações acima de 250 µg/mL. A anfotericina B e o itraconazol foram utilizados como fármacos de referência. Para estes foi observado que somente duas das linhagens estudadas apresentaram susceptibilidade à anfotericina B e ao itraconazol, todas as linhagens estudadas foram consideradas resistentes, com valores de CIM > 16 µg/mL. Estes resultados sugerem indícios de resistência fúngica das linhagens estudadas em relação aos fármacos de referência empregados no tratamento da esporotricose. As microscopias eletrônicas de varredura das linhagens fúngicas revelaram que, tanto nos fungos expostos aos tratamentos experimentais, quanto naqueles expostos aos fármacos de referência, deformidades na estrutura fúngica quando comparadas ao grupo não tratado foram observadas. Em relação aos ensaios de citotoxicidade realizados com queratinócitos humanos (HACAT) pelo método de redução do MTT, os óleos não apresentaram citotoxicidade nas concentrações equivalentes a seus valores de CIM. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis with subacute to chronic evolution that can affect humans and animals. Distributed worldwide, it is more prevalent in tropical and temperate climates, being the most common subcutaneous mycosis in South America. Its etiological agents are fungi of the Sporothrix schenckii complex, saprophytic and dimorphic, found in the environment. In Brazil, the exponential increase in cases in humans and animals has been observed in recent decades. In the surroundings of the state of Rio de Janeiro, an epidemic of zoonotic origin is already observed. Allied to this, the treatment of this mycosis has been cause of concern. The high cost and toxicity of the drugs, the prolonged treatment time, and the emergence of resistant strains on drugs of choice justify the growing demand for the discovery of new drugs. In this context, the present study aims to identify the components of the essential oils of Myrtus communis L. and Thymus vulgaris L., to investigate their antifungal potentials in vitro against the main sporotrichosis strains in Brazil, and to determine the preliminary cytotoxicity of essential oils. The essential oils of myrtle and thyme were obtained commercially. The chromatographic profile obtained by GC for the two oils showed high values of monoterpere, 87.1% for myrtle and 98.8% for thyme, with 1-8 cineole and thymol, respectively. The following fungal strains were used: Sporothrix schenckii ATCC 1099-18, Sporothrix schenckii IPEC 15383, Sporothrix brasiliensis ATCC 5110 and Sporothrix brasiliensis IPEC 17943 and two clinical strains of Sporothrix schenckii, referred as A and B. Myrtle essential oil showed antifungal activity against all strains at concentrations ranging from 31.25 to 62.5 μg / mL. Fungicidal activity against all strains was observed at concentrations above 62.5 μg / mL. Thyme essential oil was able to inhibit all lineages at concentrations ranging from 125 to 250 μg / ml. Fungicidal activity was observed against all strains at concentrations above 250 μg / mL. Amphotericin B and itraconazole were used as standard drugs. For these, it was observed that only two of the studied strains showed susceptibility to amphotericin B and itraconazole, all strains studied were considered resistant, with MIC values > 16 μg / mL. These results suggest evidence of fungal resistance of the lines studied in relation to the reference drugs used in the treatment of sporotrichosis. Scanning electron microscopy of fungal lines revealed that, both in the fungi exposed to the experimental treatments and in those exposed to the reference drugs, deformities in the fungal structure when compared to the untreated group were observed. In relation to the cytotoxicity assays performed with human keratinocytes (HACAT) by the MTT reduction method, the oils did not present cytotoxicity at concentrations equivalent to their MIC values.

Camundongos da linhagem BALB/ c foram infectados com 5x106 leveduras de S. schenckii e acompanhados durante vinte e oito dias de infecção. Através da contagem do número de UFC nos baços fígados verificou-se que a carga fúngica nos órgãos dos animais diminui drasticamente na segunda semana de infecção. O teste ELISA revelou que nos órgãos destes animais a citocina IL-10 produzida em níveis mais elevados durante toda a infecção, assim modulando o controle da infecção. O padrão de proteínas secretadas pelas células leveduriformes de S. schenckii quando cultivadas em meio de cultura líquido e visualizado através de SDS-PAGE, apresentou bandas com pesos moleculares entre 97kDa e 20,1 kDa. Uma banda de 70 kDa foi reconhecida pelos soros dos animais infectados somente após a segunda semana de infecção e persistiu até o final desta. Os níveis de Ig total produzidos contra o antígeno solúvel e a proteína de 70 kDa aumentaram na segunda semana infecção e os títulos mantiveram-se durante a infecção. A isotipagem dos anticorpos revelou a predominância dos isotipos IgG1 e IgG3 para os dois antígenos testados. Notou-se que o aumento dos níveis de Ig contra o exoantígeno e a proteína imunorreativa de 70kDa, assim como o reconhecimento desta proteína, ocorreu inversamente proporcional à diminuição da carga fúngica nos órgão dos animais infectados. As proteínas secretadas pelas leveduras de S. schenckii, principalmente a proteína de 70 kDa, são capazes de ativar uma resposta humoral e conseqüente produção de altos níveis anticorpos e inibir a fagocitose do fungo pelos macrófagos. Desta maneira, estes antígenos modulam a resposta imune na esporotricose e contribuem para a patogenicidade do fungo. / BALB/c mice had been infected with 5xl06 yeasts of S. schenckii and followed during twenty and eight days of infection. Through the counting of the number of UFC in the livers and spleens it was verified that the fungaI load in the organs of the animais decreased drastically in the second week of infection. The ELISA test disclosed that in the organs of these animaIs the cytokine IL-10 was produced in leveIs more raised during alI the infection, thus modulating the control of the infection. The protein standard secreted for the yeasts of S. schenckii when cultivated in liquid medium and visualized through SDS-PAGE, it presented bands with molecular weights between 97 and 20,1 kDa. A band of 70 kDa was recognized for the sera of the infected animals after the second week of infection and persisted until the end of this. The leveIs of total Ig produced against the exoantigen and the protein of 70 kDa had increased in the second week of infection and the titers had been remained during the infection. The isotyping of the antibodies disclosed the predominance of the IgG1 and IgG3 for two tested antigens. One noticed that the increase of the leveIs of Ig against antigens and the recognition of the protein of 70 kDa occurred parallel with the reduction of the fungal load in the organs of the infected animals. The proteins secreted by the yeasts of S. schenckii, mainly the protein of 70 kDa, they are capable to activate a humoral response and consequent production high leveIs of antibodies and to inhibit phagocytosis of the fungi for the macrophages. In this way, these antigens modulate the immune response in sporotricosis and contribute for the pathogenic potential of fungi.

Orientador: James Ventirini / Resumo: A esporotricose é uma infecção fúngica granulomatosa crônica, subcutânea ou sistêmica, causada por fungos do gênero Sporothrix, que afeta principalmente homens e animais, em especial os gatos. São fungos dimórficos e saprófitos, encontrados em solos e vegetações. Por essa característica, foi considerada uma doença ocupacional e de perfil fortemente rural. Atualmente, é considerada uma doença presente em centros urbanos e diversos municípios brasileiros têm vivenciado epidemias de esporotricose devido à transmissão zoonótica por felinos. Ausências de conhecimento sobre a ocorrência da doença, diagnóstico precoce, vigilância em saúde, programas educacionais e tratamento adequado favorecem a disseminação do fungo e são responsáveis pelos surtos e epidemias em humanos. Assim, o presente estudo teve por objetivo avaliar aspectos epidemiológicos e de georreferenciamento referente à incidência de esporotricose de pacientes residentes na região de Bauru, São Paulo e atendidos no Instituto Lauro de Souza Lima, Bauru-SP. Para tanto, foram coletados dados de prontuários de 43 pacientes com o diagnóstico confirmado de esporotricose entre os anos de 1996 a 2016. Os dados foram processados e analisados utilizando os softwares EpiInfo, SSPS e QGIS. Os resultados revelaram ao longo do período estudado não houve alteração significativa de número de casos anuais. Foi observada distribuição semelhante de casos de esporotricose por exposição animal e ambiental. A análise de georreferenciamento d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Sporotrichosis is a chronic, subcutaneous or systemic granulomatous fungal infection caused by fungi of the genus Sporothrix, which mainly affects men and animals, especially cats. They are dimorphic and saprophytic fungi found in soils and vegetation. Due to this characteristic, it was considered an occupational disease with a strongly rural profile. Currently, it is present in urban centers and several Brazilian metropolitan areas have experienced epidemic outbreaks due to zoonotic transmission by felines. Lack of knowledge about the occurrence of the disease, early diagnosis, health surveillance, educational programs and adequate treatment favor the spread of the fungus and it is responsible for outbreaks and epidemics in humans and animals. Thus, the present study aimed to evaluate epidemiological and georeferencing aspects related to the incidence of sporotrichosis of patients living in the region of Bauru, São Paulo, Brazil. For this, data from medical records of 43 patients admitted at the Lauro de Souza Lima, Institute, Bauru, SP, Brazil with confirmed diagnosis of sporotrichosis were collected between 1996 and 2016. Data were processed and analyzed using EpiInfo, SSPS and QGIS software. The results revealed that no significant change in the number of annual cases was observed. Similar distribution of animal and environmental exposure was also observed. Georeferencing analysis showed cases of environmental exposure in urban areas associated to remaining areas of veget... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A esporotricose é uma micose zoonótica que no Brasil afeta centros urbanos. O gato tem papel chave na transmissão fúngica desta doença. Nos últimos 3 anos, a cidade de Guarulhos já registrou mais de 1500 casos em gatos e assumiu o status de notificação compulsória. O objetivo do presente trabalho foi analisar a epidemiologia das cepas do clado clínico patogênico Sporothrix schenckii em relação aos aspectos fenotípicos, moleculares e de suscetibilidade aos fármacos das amostras isoladas de gatos no município de Guarulhos (São Paulo). O estudo foi dividido em dois experimentos, sendo o primeiro composto por 119 gatos divididos em três grupos: Caso, Contactante e Não-Contactante. As amostras foram obtidas por meio de suabe nas lesões dos animais do grupo Caso e dos demais grupos de suabe oral e submetidas à cultura micológica; em paralelo, amostras foram obtidas para processamento de citologia em meio líquido por emblocado celular (CB). As amostras isoladas foram submetidas a PCR para identificação da espécie, bem como aos testes de sensibilidade aos fármacos microdiluição e E-Test. Durante as colheitas 25 gatos foram submetidos à eutánasia e as amostras de pele e órgãos submetidos à análise histopatológica e imunohistoquímica. O segundo estudo foi composto por 135 gatos divididos em dois grupos: Sintomático e Assintomático. As amostras obtidas foram processadas para cultura micológica e PCR, só que desta vez, a PCR foi realizada diretamente da lesão e não após o isolamento fúngico. Neste estudo, foi obtido 92,31% de positividade dentre os gatos suspeitos com esporotricose em cultivo micológico. No projeto, 100% das amostras foram identificadas como S. brasiliensis. A técnica proposta de citologia em meio líquido por emblocado celular (CB) apresentou 93% de positividade para Sporothrix spp, com sensibilidade de 97,50% entre o isolamento fúngico e 94,87% para a imunocitoquímica. Concluindo deste modo, que o CB pode ser uma boa opção para diagnóstico em saúde pública. A investigação da susceptibilidade dos isolados aos fármacos: terbinafina, a anfotericina B, o itraconazol, fluconazol e o voriconazol foram de 0,06 0,5 µg/ml, 0,002 2 µg/mL e 0,023 - > 32 µg/ml, > 256 µg/mL e 1 - 8 µg/mL, respectivamente. As amostras submetidas à histopatologia e imunhistoquímica demonstraram presença do Sporothrix spp em pele, linfonodo mesentérico, baço, fígado, pulmão e coração. Não foi observado elemento fúngico no rim. Não foi estabelecida relação entre intensidade de infiltrado inflamatório e intensidade de Sporothrix na pele. Conclui-se que a PCR realizada de amostra diretamente de lesão pode ser utilizada em áreas cuja frequência da doença é alta, visto que a sensibilidade diagnóstica foi de 90,20%, contudo a especificidade foi de 42,11%. Sendo assim, em áreas de baixa frequência da esporotricose, recomenda-se o emprego do padrão ouro que é a cultura micológica para pesquisa de Sporothrix spp e com a realização da PCR para as amostras cuja isolamento for obtido. As variáveis de tipo de lesão e início do tratamento interferem no resultado diagnóstico de PCR direto da lesão. / Sporotrichosis is a zoonotic mycosis that affects urban centers in Brazil. The cat plays key role in the fungal transmission of this disease. In the last 3 years, the city of Guarulhos has registered more than 1500 cases in cats and this situation received a status of compulsory notification. The objective of the present work was to analyze the epidemiology from the strains of Sporothrix schenckii complex in relation to the phenotypic, molecular and drug susceptibility aspects of isolated samples collected in cats from Guarulhos city (São Paulo). The study was divided in two experiments: the first one consisting of 119 cats divided into three groups: Case, Contacting and Non-Contacting. Samples were obtained by swab lesions from the cats of Case group and from the other oral swab groups and submitted to mycological culture; at the same time, samples were obtained for cytology processing in liquid medium by cell block (CB). The isolated samples were submitted to PCR for species identification, as well the drug sensibility tests - microdilution and E-Test. During the process, 25 cats were euthanized and skin and organ samples were submitted to histopathological and immunohistochemical analysis. The second study was made with 135 cats divided into two groups: Symptomatic and Asymptomatic. The obtained samples were processed for mycological culture and PCR, but this time PCR was performed directly from the lesion and not after fungal isolation. This study obtained 92.31% of positivity among the cats with suspected of sporotrichosis in mycological culture. In this project, 100% of the samples were identified as S. brasiliensis. The proposed technique of cytology in liquid medium by cell block (CB) presented 93% of positivity for Sporothrix spp, with sensitivity of 97.50% between fungal isolation and 94.87% for immunocytochemistry. In conclusion, CB may be a good option for public health diagnosis. Investigations about the susceptibility of the isolates to the drugs: terbinafine, amphotericin B, itraconazole, fluconazole and voriconazole were 0.06 - 0.5 µg/ml, 0.002 - 2 µg/mL and 0.023 -> 32 µg/mL, > 256 µg/mL and 1-8 µg/mL, respectively. Samples submitted to histopathology and immunhistochemistry pointed the presence of Sporothrix spp on the skin, mesenteric lymph node, spleen, liver, lung and heart. No fungal element was observed in the kidney. There was no relationship between inflammatory infiltrate intensity and Sporothrix intensity in the skin. It is concluded that the PCR performed directly from the lesion can be used in areas with a high disease frequency, since the diagnostic sensitivity was 90.20%, but the specificity was 42.11%. Thus, in areas of low frequency of sporotrichosis, it is recommended to use the gold standard, which is the mycological culture for Sporothrix spp research, and to perform the PCR for samples whose isolation is obtained. The variables of lesions type and beginning of the treatment interfere in the diagnostic result of direct PCR of the lesion.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sporothrix schenckii é um fungo dimórfico e agente etiológico da esporotricose, uma micose profunda que apresenta diferentes manifestações clínicas. As diversas manifestações clínicas desta e de outras doenças infecciosas podem ser relacionadas ao status imune do hospedeiro, a fatores de virulência do patógeno ou a diferentes genótipos. Dados anteriores do nosso grupo demonstram que diferenças na expressão de adesinas do S. schenckii para fibronectina estão diretamente relacionadas à virulência de diferentes cepas. Neste trabalho visamos avaliar caracteres morfológicos bioquímicos e genotípicos de doze isolados de geofílicos, zoofílicos e antropofílicos de S. schenckii, de diferentes origens geográficas, que apresentam diferentes graus de virulência. Foi analisada a morfologia das formas de micélio e levedura de cada isolado. Foi observado que a fase de micélio dos isolados estudados apresentaram morfologia típica com hifas finas e septadas, com conídios obovóides ou ovóides alongados. As leveduras apresentaram pleomorfismo típico da espécie, com células variando do formato ovóide ao alongado. Verificamos ainda a expressão de adesinas para fibronectina e laminina, do antígeno gp70 e, o padrão de bandas antigênicas reconhecidas por anticorpos IgG presentes em soro de pacientes com esporotricose ou de camundongos infectados. Para isso, foram extraídas proteínas de superfície da forma de levedura de cada isolada, sendo os extratos ensaiados por Western blot. Nestes ensaios observamos que os isolados mais virulentos de S. schenckii expressavam mais adesinas para fibronectina e laminina. A presença da gp70 foi detectada em dez dos doze isolados, sendo que apenas os isolados zoofílicos não expressam esta glicoproteína. O padrão antigênico foi variável entre os isolados, não havendo clara relação com a origem e/ou distribuição geográfica. Os dados fenotípicos foram confrontados com dados genotípicos. Para isso, sequenciamos os loci da calmodulina (CAL) e do Internal Transcribed Spacer 1/2 (ITS 1/2) a fim de averiguar se haviam diferenças genotípicas entre os isolados estudados. As análises do sequenciamento do loci CAL e ITS, contudo, apontam a divisão dos isolados em duas espécies filogenéticas, S. schenckii e S. brasiliensis não correlacionada com a distribuição geográfica dos mesmos. Nosso estudo reforça a hipótese de haver uma correlação entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre a distribuição geográfica dos isolados zoofilicos, antropofílicos ou geofílicos, bem como dos genótipos encontrados. / The dimorphic fungus Sporothrix schenckii is the etiological agent of sporotrichosis, a deep mycosis that presents different clinical manifestations. The diverse manifestations of this and other infections can be related the host immunity, virulence factors or different genotypes of the pathogen. Previous data of our group demonstrated that differences in the expression of adhesins to fibronectin are directly related to the virulence of the different strains of S. schenckii. In the present work we have evaluated the morphological, biochemical and genotypic characteristics of twelve strains of S. schenckii (isolated from human and cat cases of sporotrichosis and from environment) from different geographic regions that present distinct virulence levels. The mycelium and yeast phases of each strain were morphologically analyzed. The strains has presented the typical morphology, with thin and septated hyphae. The conidia exhibited obovoidal or ovoidal elongated form. The yeast phase presented the ovoid or elongated cell form. Furthermore, we have verified the adhesins expression to fibronectin, to laminin, to gp70 antigen and to the antigenic bands pattern of all protein extracts, recognized by patients or infected mice sera antibodies. For this, the proteins were extracted from the surface of each strain yeast phase and assayed by Western blot technique. We have observed that the most virulent strains of S. schenckii expressed more adhesins to fibronectin and to laminina than less virulent strains. The presence of the gp70 was confirmed in ten isolates of twelve. Just strains isolated from infected cats did not present this glycoprotein. The antigenic bands pattern was variable between the different extracts, with no clear correlation with origin or geographical distribution of the isolates of S. schenckii. In order to cross phenotypic and genotypic data we have sequenced the calmodulin loci (CAL) and the Internal Transcribed Spacer 1/2 (ITS 1/2) in order to check if there was differences between the strains studied. In this analysis we found that this strains are divided in two species, S. schenckii and S. brasiliensis, again with no correlation with the geographical distribution. Our study reinforces the hypothesis on the correlation between adhesins expression pattern and virulence levels with no connection among geographical distribution or genotype of the different strains of S. schenckii.

Submitted by Celso Magalhaes (celsomagalhaes@ufrrj.br) on 2017-09-13T12:31:48Z No. of bitstreams: 1 2017 - Daniel Paiva Barros de Abreu.pdf: 1307092 bytes, checksum: b384d4db2cb316d3f640b111bc8efba4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-13T12:31:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017 - Daniel Paiva Barros de Abreu.pdf: 1307092 bytes, checksum: b384d4db2cb316d3f640b111bc8efba4 (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / Dimorphic fungi belonging to Sporothrix schenckii complex are responsible for sporotrichosis, important fungal infection with worldwide distribution. The anthropozoonotic characteristic is of high relevance in the state of Rio de Janeiro, where an increasing in the number of cases in human patients was observed in the last decades, highlighting the role of domestic cat as a transmitter agent. The description of new species compounding de Sporothrix genus, based on phenotypic and genotypic evaluations, showed the involvement of other members of this group in the epidemic status installed in Rio de Janeiro. The verification of strains resistant to itraconazole, a widely used antifungal in human and animal medicine for the treatment of this mycosis, is an important factor that possibly results in relapse and therapeutic failure of this disease. The present study aimed to identify, by phenotypic and molecular approaches, 168 isolates obtained from the routine of Veterinary Clinical Microbiology Laboratory ? UFRRJ, and the determination of minimal inhibitory concentration (MIC) for amphotericin B (AMB), ketoconazole (KTC), itraconazole (ITC), terbinafine (TRB) and voriconazole (VRC). Based on morphophysiological characteristics it was possible to identify 159 (94.64%) isolates as S. brasiliensis and 9 (5.36%) as S. luriei. However, applying PCR-RFLP of calmodulin 168 (100%) samples were identified as S. brasilensis. The susceptibility test, based on M38-A2 document (CLSI), showed that TRB was the most effective antifungal tested, followed by ITC, KTC, AMB, and VRC, respectively. No ITC resistant isolates were detected in the present study. These results demonstrate that the identification reached only by phenotypic evaluation is not recommended for the characterization of Sporothrix schenckii complex components. It also proves the predominance of S. brasiliensis in other regions of RJ state. The better efficacy of TRB added to the absence of isolates resistant to ITC support the necessity of pharmacodynamics and pharmacokinetics studies for the optimization of the therapeutic protocols. More information about isolates from dogs and cats correlated with the species from the S. schenckii complex, as well as in vitro antifungal efficacy evaluation provide knowledge about therapeutic alternatives. In this way, the present study also provides relevant information about the endemic status in Rio de Janeiro and important data for the treatment of human and animal sporotrichosis. / Fungos dim?rficos pertencentes ao complexo Sporothrix schenckii s?o respons?veis pela esporotricose, importante infec??o f?ngica que apresenta distribui??o mundial. Sua conhecida caracter?stica antropozoon?tica apresenta grande relev?ncia no estado do Rio de Janeiro, onde se verifica aumento significativo no n?mero de pacientes humanos e animais acometidos pela doen?a nas ?ltimas d?cadas, destacando-se em tais casos o papel do felino como agente transmissor. A descri??o de novas esp?cies pertencentes ao g?nero Sporothrix, baseada em caracter?sticas fenot?picas e genot?picas, demonstrou o envolvimento de outros componentes deste g?nero na epidemia instalada no estado. A verifica??o de isolados resistentes a itraconazol, antif?ngico amplamente utilizado na medicina humana e veterin?ria para o tratamento da doen?a, ? fato preocupante e tem poss?vel associa??o a recidivas e falhas terap?uticas. O presente estudo objetiva a identifica??o fenot?pica e genot?pica de 168 exemplares oriundos de pacientes felinos e caninos, obtidos na rotina do Diagn?stico Microbiol?gico Veterin?rio - UFRRJ, com determina??o da Concentra??o Inibit?ria M?nima (CIM) frente ? anfotericina B (AMB), cetoconazol (KTC), itraconazol (ITC), terbinafina (TRB) e voriconazol (VRC). A partir de caracter?sticas morfofisiol?gicas foi poss?vel identificar 159 (94,64%) isolados como S. brasiliensis e 9 (5,36%) como S. luriei. Contudo, metodologias moleculares identificaram 168 (100%) S. brasiliensis, a partir de PCR-RFLP em gene respons?vel pela s?ntese de calmodulina. O teste de sensibilidade, realizado a partir do documento M38-A2 (CLSI) determinou maior efic?cia in vitro para TRB, seguido por ITC, KTC, AMB e VRC, respectivamente. Cepas resistentes a ITC n?o foram detectadas no presente estudo. Tais resultados demonstram que a identifica??o alcan?ada exclusivamente por m?todos fenot?picos n?o ? recomendada para caracteriza??o de componentes do complexo Sporothrix schenckii. Comprova-se ainda a predomin?ncia de S. brasiliensis em outras regi?es do estado do RJ. A maior efic?cia de TRB, somada a aus?ncia de exemplares resistentes a ITC, refor?a a necessidade de estudos farmacodin?micos e farmacocin?ticos para otimiza??o dos protocolos terap?uticos atualmente utilizados. Obten??o de maiores informa??es acerca dos isolados provenientes de amostras provenientes de c?es e gatos correlacionados a esp?cies dentro do complexo S. schenckii, bem como a avalia??o da efic?cia in vitro de antif?ngicos proporcionam conhecimento sobre alternativas terap?uticas. Tais informa??es auxiliam no entendimento do quadro instalado no estado do Rio de Janeiro e fornece dados de grande utilidade para o tratamento humano e veterin?rio

A esporotricose, micose subcutânea causada pelo fungo dimórfico Sporothrix schenckii, acomete o homem e várias espécies de animais, sendo os felinos domésticos a espécie mais comumente envolvida nos relatos zoonóticos da enfermidade. Considerando as dificuldades terapêuticas no tratamento da micose, incluindo toxicidade e o desenvolvimento de resistência aos antifúngicos disponíveis, o estudo objetivou avaliar a eficácia in vivo do imunomodulador (1-3) glucana e em associação ao Itraconazol no tratamento da esporotricose sistêmica experimental, além de avaliar a presença do S. schenckii na cavidade oral e a produção de óxido nítrico. Foram utilizados 96 ratos Wistar, machos, os quais foram divididos em seis grupos de 16 animais, sendo eles G1: 0,5mg de glucana previamente (três doses) e pós a inoculação; G2: 0,5 mg glucana pós inoculação; G3: grupo controle; G4: 0,5mg de glucana associada a 10mg/kg de itraconazol; G5: 10mg/kg de itraconazol; e grupo G6: duas doses de 0,5mg de glucana associado a 10mg/kg de itraconazol. Os animais foram inoculados com 0,1ml do inóculo fúngico pela via intraperitoneal e veia lateral da cauda, após uma semana iniciou-se o tratamento dos grupos, quando estes apresentavam sinais clínicos da enfermidade. Após acompanhamento clínico durante a cinco semanas de tratamento e isolamento do agente na cavidade oral dos animais, estes foram eutanasiados e necropsiados para a coleta de sangue, avaliação anatomopatológica dos órgãos, retroisolamento do agente, quantificação das unidades formadoras de colônias (UFC) do baço e quantificação de óxido nítrico. Na primeira avaliação foi observado no grupo G1, uma prevenção da enfermidade desencadeada pela glucana, uma vez que, os animais pertencentes a esse grupo não apresentaram sinais clínicos, lesões anatomopatológicas e obtiveram a menor quantificação de UFC (p<0,5). No entanto no final do período experimental o G4 foi significativamente melhor dentre os grupos de tratamento, pois, findou o período com 70% dos animais sem qualquer alteração clínica, lesões macroscópicas nos órgãos e retroisolamento do agente, além de demonstrar menor quantificação nas UFCs e não ocorrer nenhum óbito decorrente da enfermidade. Os grupos G2, G5 e G6 foram significativamente melhor que o grupo controle uma vez que este grupo apresentou uma mortalidade de 31,25%, além de que 100% dos animais permanceram com alterações clínicas, lesões em órgão como fígado, baço e testículo e demonstraram maior quantificação de UFC (p<0,5). Quanto á produção de óxido nítrico foi verificado maior quantidade nos grupos que receberam a glucana em detrimento aos demais grupos. Em vista dos resultados obtidos conclui-se que a glucana induz a produção de óxido nítrico e os cinco tratamentos demostraram resultados satisfatórios, no entanto, a associação do antifúngico e (1-3) glucana propiciou uma regressão mais precoce das lesões no tratamento da esportricose sistêmica experimental. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by the dimorphic fungus Sporothrix schenckii, which affects humans and a wide variety of animals, domestic cats involved in reports of zoonotic illness. Considering the difficulties in the therapeutic treatment of ringworm, including toxicity and the development of resistance to antifungals available, the study aimed to evaluate the efficacy of the immunomodulator in vivo (1-3) glucan and in combination with Itraconazole in the treatment of experimental systemic sporotrichosis, beyond to evaluate the presence of S. Schenckii in the oral cavity of experimental animals and the production of oxide nitric. Were used 96 male Wistar rats, which were divided into 6 groups of 16 animals, and they were G1: 0.5 mg of glucan in advance (three doses) and after inoculation G2: 0.5 mg glucan after inoculation; G3: control group; G4: 0.5 mg of glucan associated with 10mg/kg of itraconazole; G5: 10mg/kg of itraconazole, and G6: two doses of 0.5 mg of glucan associated 10mg/kg of the itraconazole. The animals were inoculated with 0.1 ml of fungal inoculum by intraperitoneal and lateral tail vein, after one week started treatment groups when they showed clinical signs of disease. After clinical monitoring during the five weeks of treatment and isolation of the agent in the oral cavity of animals, they were euthanized and necropsied to collect blood, anatomopathological evaluation of organs, organ cultures of the agent, and quantification of colony forming units (CFU) of spleen. In the first evaluation was observed in G1, a prevention of the disease triggered by glucan, since the animals from this group showed no clinical signs, anatomopathologicals lesions and obtained the smaller number of CFU (p <0.5). However at the end of experimental period the G4 was significantly better among the treatment groups, therefore, ended the period with 70% of animals without any clinical alteration, macroscopic lesions in organs and organ cultures of the agent, beyond to demonstrate smaller number in CFUs and not occur any deaths resulting from illnes .The groups G2, G5 and G6 were significantly better than the control group since this group had a mortality rate of 31.25%, besides that 100% of the animals remained with clinical changes, lesions in organs such as liver, spleen and testis and demonstrated greater quantification of CFU (p <0,5). As the production of nitric oxide has been found much in the groups receiving the glucan rather than to the other groups. In view of these obtained results it is concluded that glucan induces the production of nitric oxide and the five treatments demonstrated efficacy to the reference sporotrichosis experimental systemically, however, the combination of antifungal (1-3) glucan provided an early regression of the lesions.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sporothrix schenckii é um fungo dimórfico e agente etiológico da esporotricose, uma micose profunda que apresenta diferentes manifestações clínicas. As diversas manifestações clínicas desta e de outras doenças infecciosas podem ser relacionadas ao status imune do hospedeiro, a fatores de virulência do patógeno ou a diferentes genótipos. Dados anteriores do nosso grupo demonstram que diferenças na expressão de adesinas do S. schenckii para fibronectina estão diretamente relacionadas à virulência de diferentes cepas. Neste trabalho visamos avaliar caracteres morfológicos bioquímicos e genotípicos de doze isolados de geofílicos, zoofílicos e antropofílicos de S. schenckii, de diferentes origens geográficas, que apresentam diferentes graus de virulência. Foi analisada a morfologia das formas de micélio e levedura de cada isolado. Foi observado que a fase de micélio dos isolados estudados apresentaram morfologia típica com hifas finas e septadas, com conídios obovóides ou ovóides alongados. As leveduras apresentaram pleomorfismo típico da espécie, com células variando do formato ovóide ao alongado. Verificamos ainda a expressão de adesinas para fibronectina e laminina, do antígeno gp70 e, o padrão de bandas antigênicas reconhecidas por anticorpos IgG presentes em soro de pacientes com esporotricose ou de camundongos infectados. Para isso, foram extraídas proteínas de superfície da forma de levedura de cada isolada, sendo os extratos ensaiados por Western blot. Nestes ensaios observamos que os isolados mais virulentos de S. schenckii expressavam mais adesinas para fibronectina e laminina. A presença da gp70 foi detectada em dez dos doze isolados, sendo que apenas os isolados zoofílicos não expressam esta glicoproteína. O padrão antigênico foi variável entre os isolados, não havendo clara relação com a origem e/ou distribuição geográfica. Os dados fenotípicos foram confrontados com dados genotípicos. Para isso, sequenciamos os loci da calmodulina (CAL) e do Internal Transcribed Spacer 1/2 (ITS 1/2) a fim de averiguar se haviam diferenças genotípicas entre os isolados estudados. As análises do sequenciamento do loci CAL e ITS, contudo, apontam a divisão dos isolados em duas espécies filogenéticas, S. schenckii e S. brasiliensis não correlacionada com a distribuição geográfica dos mesmos. Nosso estudo reforça a hipótese de haver uma correlação entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre a distribuição geográfica dos isolados zoofilicos, antropofílicos ou geofílicos, bem como dos genótipos encontrados. / The dimorphic fungus Sporothrix schenckii is the etiological agent of sporotrichosis, a deep mycosis that presents different clinical manifestations. The diverse manifestations of this and other infections can be related the host immunity, virulence factors or different genotypes of the pathogen. Previous data of our group demonstrated that differences in the expression of adhesins to fibronectin are directly related to the virulence of the different strains of S. schenckii. In the present work we have evaluated the morphological, biochemical and genotypic characteristics of twelve strains of S. schenckii (isolated from human and cat cases of sporotrichosis and from environment) from different geographic regions that present distinct virulence levels. The mycelium and yeast phases of each strain were morphologically analyzed. The strains has presented the typical morphology, with thin and septated hyphae. The conidia exhibited obovoidal or ovoidal elongated form. The yeast phase presented the ovoid or elongated cell form. Furthermore, we have verified the adhesins expression to fibronectin, to laminin, to gp70 antigen and to the antigenic bands pattern of all protein extracts, recognized by patients or infected mice sera antibodies. For this, the proteins were extracted from the surface of each strain yeast phase and assayed by Western blot technique. We have observed that the most virulent strains of S. schenckii expressed more adhesins to fibronectin and to laminina than less virulent strains. The presence of the gp70 was confirmed in ten isolates of twelve. Just strains isolated from infected cats did not present this glycoprotein. The antigenic bands pattern was variable between the different extracts, with no clear correlation with origin or geographical distribution of the isolates of S. schenckii. In order to cross phenotypic and genotypic data we have sequenced the calmodulin loci (CAL) and the Internal Transcribed Spacer 1/2 (ITS 1/2) in order to check if there was differences between the strains studied. In this analysis we found that this strains are divided in two species, S. schenckii and S. brasiliensis, again with no correlation with the geographical distribution. Our study reinforces the hypothesis on the correlation between adhesins expression pattern and virulence levels with no connection among geographical distribution or genotype of the different strains of S. schenckii.

A esporotricose, micose subcutânea causada pelo fungo dimórfico Sporothrix schenckii, acomete o homem e várias espécies de animais, sendo os felinos domésticos a espécie mais comumente envolvida nos relatos zoonóticos da enfermidade. Considerando as dificuldades terapêuticas no tratamento da micose, incluindo toxicidade e o desenvolvimento de resistência aos antifúngicos disponíveis, o estudo objetivou avaliar a eficácia in vivo do imunomodulador (1-3) glucana e em associação ao Itraconazol no tratamento da esporotricose sistêmica experimental, além de avaliar a presença do S. schenckii na cavidade oral e a produção de óxido nítrico. Foram utilizados 96 ratos Wistar, machos, os quais foram divididos em seis grupos de 16 animais, sendo eles G1: 0,5mg de glucana previamente (três doses) e pós a inoculação; G2: 0,5 mg glucana pós inoculação; G3: grupo controle; G4: 0,5mg de glucana associada a 10mg/kg de itraconazol; G5: 10mg/kg de itraconazol; e grupo G6: duas doses de 0,5mg de glucana associado a 10mg/kg de itraconazol. Os animais foram inoculados com 0,1ml do inóculo fúngico pela via intraperitoneal e veia lateral da cauda, após uma semana iniciou-se o tratamento dos grupos, quando estes apresentavam sinais clínicos da enfermidade. Após acompanhamento clínico durante a cinco semanas de tratamento e isolamento do agente na cavidade oral dos animais, estes foram eutanasiados e necropsiados para a coleta de sangue, avaliação anatomopatológica dos órgãos, retroisolamento do agente, quantificação das unidades formadoras de colônias (UFC) do baço e quantificação de óxido nítrico. Na primeira avaliação foi observado no grupo G1, uma prevenção da enfermidade desencadeada pela glucana, uma vez que, os animais pertencentes a esse grupo não apresentaram sinais clínicos, lesões anatomopatológicas e obtiveram a menor quantificação de UFC (p<0,5). No entanto no final do período experimental o G4 foi significativamente melhor dentre os grupos de tratamento, pois, findou o período com 70% dos animais sem qualquer alteração clínica, lesões macroscópicas nos órgãos e retroisolamento do agente, além de demonstrar menor quantificação nas UFCs e não ocorrer nenhum óbito decorrente da enfermidade. Os grupos G2, G5 e G6 foram significativamente melhor que o grupo controle uma vez que este grupo apresentou uma mortalidade de 31,25%, além de que 100% dos animais permanceram com alterações clínicas, lesões em órgão como fígado, baço e testículo e demonstraram maior quantificação de UFC (p<0,5). Quanto á produção de óxido nítrico foi verificado maior quantidade nos grupos que receberam a glucana em detrimento aos demais grupos. Em vista dos resultados obtidos conclui-se que a glucana induz a produção de óxido nítrico e os cinco tratamentos demostraram resultados satisfatórios, no entanto, a associação do antifúngico e (1-3) glucana propiciou uma regressão mais precoce das lesões no tratamento da esportricose sistêmica experimental. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by the dimorphic fungus Sporothrix schenckii, which affects humans and a wide variety of animals, domestic cats involved in reports of zoonotic illness. Considering the difficulties in the therapeutic treatment of ringworm, including toxicity and the development of resistance to antifungals available, the study aimed to evaluate the efficacy of the immunomodulator in vivo (1-3) glucan and in combination with Itraconazole in the treatment of experimental systemic sporotrichosis, beyond to evaluate the presence of S. Schenckii in the oral cavity of experimental animals and the production of oxide nitric. Were used 96 male Wistar rats, which were divided into 6 groups of 16 animals, and they were G1: 0.5 mg of glucan in advance (three doses) and after inoculation G2: 0.5 mg glucan after inoculation; G3: control group; G4: 0.5 mg of glucan associated with 10mg/kg of itraconazole; G5: 10mg/kg of itraconazole, and G6: two doses of 0.5 mg of glucan associated 10mg/kg of the itraconazole. The animals were inoculated with 0.1 ml of fungal inoculum by intraperitoneal and lateral tail vein, after one week started treatment groups when they showed clinical signs of disease. After clinical monitoring during the five weeks of treatment and isolation of the agent in the oral cavity of animals, they were euthanized and necropsied to collect blood, anatomopathological evaluation of organs, organ cultures of the agent, and quantification of colony forming units (CFU) of spleen. In the first evaluation was observed in G1, a prevention of the disease triggered by glucan, since the animals from this group showed no clinical signs, anatomopathologicals lesions and obtained the smaller number of CFU (p <0.5). However at the end of experimental period the G4 was significantly better among the treatment groups, therefore, ended the period with 70% of animals without any clinical alteration, macroscopic lesions in organs and organ cultures of the agent, beyond to demonstrate smaller number in CFUs and not occur any deaths resulting from illnes .The groups G2, G5 and G6 were significantly better than the control group since this group had a mortality rate of 31.25%, besides that 100% of the animals remained with clinical changes, lesions in organs such as liver, spleen and testis and demonstrated greater quantification of CFU (p <0,5). As the production of nitric oxide has been found much in the groups receiving the glucan rather than to the other groups. In view of these obtained results it is concluded that glucan induces the production of nitric oxide and the five treatments demonstrated efficacy to the reference sporotrichosis experimental systemically, however, the combination of antifungal (1-3) glucan provided an early regression of the lesions.