β-1,3-glucanases são enzimas encontradas em muitos organismos, como fungos, bactéria e plantas. Suas funções incluem remodelamento de parede celular, defesa e digestão. É um alvo interessante para o controle populacional de insetos-praga, porque é ausente em vertebrados. Em insetos, é encontrada no intestino de muitas ordens diferentes, e hidrolizam β-1,3 ou β-1,3(4)-glucanas ingeridas, mas pouco se sabe sobre as propriedades e a função dessas enzimas. Nós estudamos três espécies de insetos, de três ordens diferentes. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera), Tenebrio molitor (Coleoptera) e Abracris flavolineata (Orthoptera) são insetos herbívoros e pestes de plantações, mas suas beta-1,3-glucanases diferem significativamente. A β- 1,3-glucanase de S. frugiperda (SLAM) foi purificada do intestino médio da larva. Ela apresenta uma massa molecular de 37,5 kDa, um pH ótimo alcalino de 9,0, é ativa contra β-1,3-glucana (laminarina), mas é incapaz de hidrolizar β-1,3-1,6-glucana de levedura ou outros polisacarídeos. SLAM é não-processiva (0,4), e não é inibida por altas concentrações de substrato. Diferente de outras β-1,3-glucanases digestivas de insetos, SLAM é incapaz de lisar células de Saccharomyces cerevisae. O cDNA correspondente à SLAM foi clonado e sequenciado, demonstrando que a proteína pertence à família 16 das Glicosídeo-Hidrolases. A modelagem tridimensional de SLAM, feito com base em homologia de sequência, sugere que o resíduo E228 possa afetar a ionização dos resíduos catalíticos, causando o deslocamento do pH ótimo da enzima. Anti-corpos específicos para SLAM foram produzidos, e estes reagem com uma única proteína oriunda do intestino médio da larva, responsável pela atividade β-1,3- glucanásica majoritária. A imunocitolocalização de SLAM demonstra que a enzima é encontrada em vesículas secretórias e no glicocálix das células colunares, e portanto não é originária de simbiontes. Nós clonamos e sequenciamos o cDNA correspondente à β-1,3-glucanase majoritária presente no intestino médio da larva de T. molitor (TLAM). Ela pertence à família 16 das Glicosídeo-Hidrolases e está relacionada com proteínas ligantes de β -glucanas, da mesma forma que a enzima de S. frugiperda. A modelagem tridimensional por homologia de sequência permitiu identificar alguns resíduos de amino-ácidos (E174, E179, H204, Y304, R127 e R2181) no sítio ativo da enzima, que podem ser importantes para a atividade de TLAM. A β-1,3-glucanase digestiva do gafanhoto Abracris flavolineata (Orthoptera) é diferente das enzimas já estudadas em insetos. Ela apresenta uma estratégia catalítica processiva, liberando glicose como maior parte dos produtos, e é inibida por altas concentrações de substrato. Para estudar as bases estruturais desse mecanismo, nós procuramos obter a sequência de cDNA correspondente à enzima já caracterizada. O alinhamento múltiplo das β-1,3- glucanases de insetos e proteínas ligantes de beta-glucanas indicou que uma duplicação gênica da enzima do ancestral comum de moluscos e artrópodes. Uma cópia originou as beta-1,3-glucanase de insetos, perdendo uma região N-Terminal com cerca de 100 pares de bases, enquanto a outra cópia originou as proteínas ligantes de beta-glucana, perdendo os resíduos catalíticos. / β-1,3-glucanases are widespread enzymes, found in all major groups of invertebrates, fungi, bacteria and plants. Since this enzyme is absent in vertebrates, it constitutes an interesting target for control of insect pests population. Its functions range from cell wall remodeling, defense and digestion. In insects, it is found in the gut of many different orders, hydrolyzing β-1,3 or β-1,3(4)-glucanas, but little is known about the properties and function of these enzymes. We studied three insect species each pertaining to a different order. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera), Tenebrio molitor (Coleoptera) and Abracris flavolineata are herbivores and crops pests, but their β-1,3- glucanases differ significantly. S. frugiperda β -1,3-glucanase (SLAM) was purified from the larval midgut. It has a molecular mass of 37.5 kDa, an alkaline optimum pH of 9.0, is active against β-1,3-glucan (laminarin), but cannot hydrolyze yeast β-1,3-1,6-glucan or other polysaccharides. The enzyme is an endoglucanase with low processivity (0.4), and is not inhibited by high concentrations of substrate. In contrast to other digestive β-1,3- glucanases from insects, SLAM is unable to lyse Saccharomyces cerevisae cells. The cDNA encoding SLAM was cloned and sequenced, showing that the protein belongs to glycosyl hydrolase family 16 as other insect glucanases and glucan-binding proteins. SLAM homology modeling suggests that E228 may affect the ionization of the catalytic residues, thus displacing the enzyme pH optimum. SLAM antiserum reacts with a single protein in the insect midgut. Immunocytolocalization reveals the presence of the enzyme in secretory vesicles and glycocalyx from columnar cells. We cloned and sequenced the cDNA of T. molitor β-1,3-glucanase. It belongs to glycoside hydrolase family 16, and is related to other insect glucanases and glucan-binding proteins. Sequence analysis and homology modeling allowed the identification of some residues (E174, E179, H204, Y304, R127 and R181) at the active site of the enzyme, which may be important for TLAM activity. The grasshopper A. flavolineata has a β-1,3-glucanase with a processive catalytic strategy. To study the structural basis of this property, we aimed to obtain its encoding sequence to better understand this catalytic mechanism. Multiple sequence alignment of insects β-1,3-glucanases and β-glucan-binding protein indicates that the β- 1,3-glucanase gene duplicated in the ancestor of mollusks and arthropods. One copy originated the insect β-1,3-glucanases after losing a 100 bp N-terminal portion and the arthropode β-glucan-binding proteins by the loss of the catalytic residues.

β-1,3-glucanases são enzimas encontradas em muitos organismos, como fungos, bactéria e plantas. Suas funções incluem remodelamento de parede celular, defesa e digestão. É um alvo interessante para o controle populacional de insetos-praga, porque é ausente em vertebrados. Em insetos, é encontrada no intestino de muitas ordens diferentes, e hidrolizam β-1,3 ou β-1,3(4)-glucanas ingeridas, mas pouco se sabe sobre as propriedades e a função dessas enzimas. Nós estudamos três espécies de insetos, de três ordens diferentes. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera), Tenebrio molitor (Coleoptera) e Abracris flavolineata (Orthoptera) são insetos herbívoros e pestes de plantações, mas suas beta-1,3-glucanases diferem significativamente. A β- 1,3-glucanase de S. frugiperda (SLAM) foi purificada do intestino médio da larva. Ela apresenta uma massa molecular de 37,5 kDa, um pH ótimo alcalino de 9,0, é ativa contra β-1,3-glucana (laminarina), mas é incapaz de hidrolizar β-1,3-1,6-glucana de levedura ou outros polisacarídeos. SLAM é não-processiva (0,4), e não é inibida por altas concentrações de substrato. Diferente de outras β-1,3-glucanases digestivas de insetos, SLAM é incapaz de lisar células de Saccharomyces cerevisae. O cDNA correspondente à SLAM foi clonado e sequenciado, demonstrando que a proteína pertence à família 16 das Glicosídeo-Hidrolases. A modelagem tridimensional de SLAM, feito com base em homologia de sequência, sugere que o resíduo E228 possa afetar a ionização dos resíduos catalíticos, causando o deslocamento do pH ótimo da enzima. Anti-corpos específicos para SLAM foram produzidos, e estes reagem com uma única proteína oriunda do intestino médio da larva, responsável pela atividade β-1,3- glucanásica majoritária. A imunocitolocalização de SLAM demonstra que a enzima é encontrada em vesículas secretórias e no glicocálix das células colunares, e portanto não é originária de simbiontes. Nós clonamos e sequenciamos o cDNA correspondente à β-1,3-glucanase majoritária presente no intestino médio da larva de T. molitor (TLAM). Ela pertence à família 16 das Glicosídeo-Hidrolases e está relacionada com proteínas ligantes de β -glucanas, da mesma forma que a enzima de S. frugiperda. A modelagem tridimensional por homologia de sequência permitiu identificar alguns resíduos de amino-ácidos (E174, E179, H204, Y304, R127 e R2181) no sítio ativo da enzima, que podem ser importantes para a atividade de TLAM. A β-1,3-glucanase digestiva do gafanhoto Abracris flavolineata (Orthoptera) é diferente das enzimas já estudadas em insetos. Ela apresenta uma estratégia catalítica processiva, liberando glicose como maior parte dos produtos, e é inibida por altas concentrações de substrato. Para estudar as bases estruturais desse mecanismo, nós procuramos obter a sequência de cDNA correspondente à enzima já caracterizada. O alinhamento múltiplo das β-1,3- glucanases de insetos e proteínas ligantes de beta-glucanas indicou que uma duplicação gênica da enzima do ancestral comum de moluscos e artrópodes. Uma cópia originou as beta-1,3-glucanase de insetos, perdendo uma região N-Terminal com cerca de 100 pares de bases, enquanto a outra cópia originou as proteínas ligantes de beta-glucana, perdendo os resíduos catalíticos. / β-1,3-glucanases are widespread enzymes, found in all major groups of invertebrates, fungi, bacteria and plants. Since this enzyme is absent in vertebrates, it constitutes an interesting target for control of insect pests population. Its functions range from cell wall remodeling, defense and digestion. In insects, it is found in the gut of many different orders, hydrolyzing β-1,3 or β-1,3(4)-glucanas, but little is known about the properties and function of these enzymes. We studied three insect species each pertaining to a different order. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera), Tenebrio molitor (Coleoptera) and Abracris flavolineata are herbivores and crops pests, but their β-1,3- glucanases differ significantly. S. frugiperda β -1,3-glucanase (SLAM) was purified from the larval midgut. It has a molecular mass of 37.5 kDa, an alkaline optimum pH of 9.0, is active against β-1,3-glucan (laminarin), but cannot hydrolyze yeast β-1,3-1,6-glucan or other polysaccharides. The enzyme is an endoglucanase with low processivity (0.4), and is not inhibited by high concentrations of substrate. In contrast to other digestive β-1,3- glucanases from insects, SLAM is unable to lyse Saccharomyces cerevisae cells. The cDNA encoding SLAM was cloned and sequenced, showing that the protein belongs to glycosyl hydrolase family 16 as other insect glucanases and glucan-binding proteins. SLAM homology modeling suggests that E228 may affect the ionization of the catalytic residues, thus displacing the enzyme pH optimum. SLAM antiserum reacts with a single protein in the insect midgut. Immunocytolocalization reveals the presence of the enzyme in secretory vesicles and glycocalyx from columnar cells. We cloned and sequenced the cDNA of T. molitor β-1,3-glucanase. It belongs to glycoside hydrolase family 16, and is related to other insect glucanases and glucan-binding proteins. Sequence analysis and homology modeling allowed the identification of some residues (E174, E179, H204, Y304, R127 and R181) at the active site of the enzyme, which may be important for TLAM activity. The grasshopper A. flavolineata has a β-1,3-glucanase with a processive catalytic strategy. To study the structural basis of this property, we aimed to obtain its encoding sequence to better understand this catalytic mechanism. Multiple sequence alignment of insects β-1,3-glucanases and β-glucan-binding protein indicates that the β- 1,3-glucanase gene duplicated in the ancestor of mollusks and arthropods. One copy originated the insect β-1,3-glucanases after losing a 100 bp N-terminal portion and the arthropode β-glucan-binding proteins by the loss of the catalytic residues.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-12-04T20:39:16Z No. of bitstreams: 1 AleidaMariaDaSilvaLima_DISSERT.pdf: 1394996 bytes, checksum: b7dfff2dc66acf246836f373fbcdae6b (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-12-06T23:54:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AleidaMariaDaSilvaLima_DISSERT.pdf: 1394996 bytes, checksum: b7dfff2dc66acf246836f373fbcdae6b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-06T23:54:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AleidaMariaDaSilvaLima_DISSERT.pdf: 1394996 bytes, checksum: b7dfff2dc66acf246836f373fbcdae6b (MD5) Previous issue date: 2012-02-27 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / A candis?ase vulvovaginal (CVV) ? uma doen?a inflamat?ria, no tecido vaginal, causada principalmente por leveduras patog?nicas de Candida albicans. E atualmente CVV ? um problema significativo na sa?de da mulher. As ? glucanas s?o polissacar?deos estruturais da parede celular da levedura Saccharomyces cerevisiae e existem v?rios relatos que demonstram o efeito imunomodulador desta estrutura em infec??es bacterianas, virais, f?ngicas e parasit?rias. Sabendo disso, o presente estudo avaliou se a ?-glucana tem atividade imunomoduladora em camundongos com candid?ase vulvovaginal sob a influ?ncia do estr?geno. Os animais foram inoculados com C. albicans, por via intravaginal, e tratados com glucana, vaginal e intraperitonealmente, e os animais do grupo de controle receberam por via intraperitoneal, solu??o salina. Os animais tratados com glucana intraperitoneal e vaginal mostraram menor n?mero de UFC, no fluido vaginal, em compara??o com animais controles. No entanto, os resultados mais marcantes foram do intraperitoneal, confirmando com o histopatol?gico, por?m sem diferen?a estatisticamente significante. Em rela??o ao influxo dos neutr?filos polimorfonucleares (PMNs), os grupos tratados com glucana mostraram maior infiltra??o desses. Al?m disso, observou-se que os animais tratados com glucana apresentaram uma maior quantidade de IFN-?, no lavado vaginal, em compara??o com o controle. Os dados sugerem que glucana pode ter uma atividade importante na prote??o contra C. albicans. / Vulvovaginal candidiasis (VVC) is an inflammatory disease, on vaginal tissue, caused mainly by pathogenic yeasts of Candida albicans. And actually, VVC is currently a significant problem in women's health. The ?-glucans are structural polysaccharides of the cell wall of the fungi Saccharomyces cerevisiae and there are several reports that demonstrate the immunomodulatory effect this structure in infections of bacterial, viral, fungal and parasitic. Knowing this, the present study evaluated whether ?- glucan has immunomodulatory activity in mice with vulvovaginal candidiasis under the influence of estrogen. The animals were inoculated with C. albicans, intravaginally, and treated with glucan, vaginally and intraperitoneally, and the control group animals received saline, intraperitoneally. The animals treated with intraperitoneal and vaginal glucan showed smaller number of the CFU, in the vaginal fluid, compared with control animals. However the results more marked was of the intraperitonel, confirmed with histopathological, but in neither case the results were statistically significant. Relative to influx of the polymorphonuclear neutrophilis (PMNs), the groups treated with glucan showed greater infiltration. Moreover, it was observed that animals treated with glucan showed a higher quantity of IFN-?, in vaginal washed, compared with the control. The data suggest that glucan may have an important activity in protection against C. albicans.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-02-17T19:43:30Z No. of bitstreams: 1 AlminoAfonsoDeOliveiraPaiva_TESE.pdf: 2456253 bytes, checksum: 8fb79cebdf6af9ae6e52d7c2b6873b85 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-02-18T00:27:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AlminoAfonsoDeOliveiraPaiva_TESE.pdf: 2456253 bytes, checksum: 8fb79cebdf6af9ae6e52d7c2b6873b85 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-18T00:27:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AlminoAfonsoDeOliveiraPaiva_TESE.pdf: 2456253 bytes, checksum: 8fb79cebdf6af9ae6e52d7c2b6873b85 (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico (CNPq) / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / Macroalgas marinhas s?o importantes fontes de polissacar?deos neutros e negativos com importante potencial industrial e farmacol?gico. A macroalga marrom Lobophora variegata ? conhecida por apresentar polissacar?deos sulfatados (heterofucanas) e neutros (laminarinas). Neste trabalho, mostra-se a obten??o de 6 fra??es polissacar?dicas (F0.3; F0.5; F0.8; F1; F1.5 e F2). A partir dos dados de caracteriza??o f?sico-qu?mica das fra??es, escolheu-se a F1 para purifica??o de seus componentes polissacar?dicos. An?lises de cromatografia l?quida de exclus?o molecular levaram a observa??o que F1 apresenta polissacar?dicos de baixa (~ 5 kDa) at? alta (> 100 kDa) massa molecular. Estes componentes foram separados de acordo com sua massa molecular, utilizando-se dispositivos de separa??o por tamanho molecular. Com isso, obteve-se subfra??es polissacar?dicas com tamanhos m?dios de 5, 20, 40, 75 e acima 100 kDa, denominadas de F1-5, F1-20, F1-40. F1-75 e F1>100 kDa, respectivamente. Estas subfra??es foram analisadas f?sico-qu?micamente por eletroforese em gel de agarose, cromatografia l?quida de alta efici?ncia, assim como, por an?lises de suas propriedades antioxidantes, imunoestimulantes e citot?xicas/antiproliferativas. Como resultados, detectou-se um teor de a??cares totais acima de 55% em todas as subfra??es, j? prote?nas e compostos fen?licos n?o foram observados. As fra??es F1-5, F1-20 e F1-40 apresentaram somente glucose (glucanas), j? F1-75 e F1>100 apresentam glucose, galactose e fucose (heterofucanas). Todas as subfra??es apresentaram atividade quelante de metais, mas somente F1-75 e F1>100 foram mais efetivas em sequestrar radicais. A produ??o/libera??o de ?xido n?trico (NO) por c?lulas RAW 264.7 ficou aumentada apenas na presen?a F1-5 (10 ?M, p<0,05), F1-75 (10 ?M, p<0,001) e, com destaque, F1>100 (10 ?M, p<0,001) cuja presen?a aumentou em cerca de 12 vezes a quantidade de NO. Entretanto, quando estas c?lulas foram ativadas com LPS, somente F1-20 e F1>100 (10 ?M) (p<0,001) proporcionaram produ??o/libera??o de ON. As demais fra??es n?o interferiram na a??o do LPS. Somente F1-5 e F1>100 estimularam a produ??o/libera??o de citocinas. Somente F1>100 (10 ?M) foi citot?xica para a linhagem 3T3 (fibroblastos) (p<0,01). Nenhuma das subfra??es apresentaram efeito citot?xico para linhagem de c?lulas RAW 264.7 (macr?fagos) ou para linhagem de c?lulas tumorais Hep-G2 (carcinoma hep?tico). J? com a linhagen de c?lulas 786-0 (adenocarcinoma renal) somente a glucana F1-40 n?o apresentou atividade citot?xica (p>0,05). Os maiores valores de citotoxidade foram obtidos com a subfra??o F1-20, no caso contra c?lulas B16F10 (melanoma). Dados de citometria de fluxo indicaram que esta subfra??o promove uma parada das c?lulas na fase G1 do ciclo celular (10 ?M, p<0,01). An?lises de resson?ncia magn?tica nuclear levaram a proposta de que F1-20 ? uma ?-glucana formada por ?-(1?3) glucoses com ramifica??es, compostas por um res?duo de glicose, na posi??o 6. A propor??o ? de nove res?duos de glucose 1?3 ligados para cada ponto de ramifica??o. Os dados apontam F1-20, por ser antioxidante, imunomoduladora e citot?xico, como um composto pluripotente cujo potencial deva ser melhor investigado. / Seaweeds are important sources of neutral and negative polysaccharides with important industrial and pharmacological potential. The brown macroalgae Lobophora variegata is known for presenting sulfated polysaccharides (heterofucans) and neutral (laminarins). In this work, it is shown getting 6 polysaccharide fractions (F0.3, F0.5, F0.8, F1, F1.5 and F2). From the data of physicochemical characterization of fractions, F1 was chosen for next purification steps. Liquid chromatography of molecular exclusion analysis showed that F1 contain polysaccharide from low (~ 5 kDa) to high (> 100 kDa) molecular weight. These components were separated according to their molecular weight using separation by molecular size devices. Thus, it was obtained subfractions with an average polysaccharide size of 5, 20, 40, 75 and above 100 kDa, named F1-5, F1-20, F1-40. F1-75 and F1>100 kDa, respectively. These subfractions were analyzed physico-chemically by agarose gel electrophoresis, high-performance liquid chromatography, as by analysis of their antioxidant, immunomodulatory and cytotoxic/antiproliferative properties. As result, total sugar content in all subfractions was above 55%, since proteins and phenolic compounds were not observed. The fractions F1-5, F1-20 and F1-40 showed only glucose (glucans), as F1-75 and F1> 100 exhibit glucose, galactose and fucose (heterofucans). All subfractions showed chelating activity of metals, but only F1-75 and F1>100 were more effective as radical scavenger. The production/release of nitric oxide (NO) by RAW cells was increased only in the presence F1-5 (10 ?M, p <0.05), F1-75 (10 ?M, p<0.001) and, especially, F1>100 (10 ?M, p <0.001) whose its presence increased about 12 times the amount of NO. However, when these cells were activated with LPS only F1-20 and F1>100 (10 ?M) (p<0.001) yielded production/release of NO. The other fractions did not interfere in the LPS action. Only F1-5 and F1>100 stimulated the production/release of cytokines. Only F1>100 (10 ?M) was cytotoxic to line 3T3 (fibroblast) (p<0.01). None of subfractions showed cytotoxicity effect to cell line RAW 264.7 (macrophages) or tumor cell line Hep-G2 (hepatocellular carcinoma). On the other hand, only F1-40 did not showed cytotoxic activity (p>0.05) against 786-0 renal carcinoma cells. The highest cytotoxicity values were obtained with the subfraction F1-20, in the case against B16F10 cells (melanoma). Flow cytometry data indicate that this subfraction stopped of cells in the G1 phase of the cell cycle (10 ?M, p<0.01). Nuclear magnetic resonance analysis led to the proposal that F1-20 is a ?-glucan formed by ?-(1?3) glucosides with branches, comprising a glucose residue at position 6. The ratio is nine glucose residues 1,3 connected to each branching point. The data point F1-20, being an antioxidant, immunomodulating and cytotoxic as a compound pluripotent whose potential should be further investigated.

A esporotricose, micose subcutânea causada pelo fungo dimórfico Sporothrix schenckii, acomete o homem e várias espécies de animais, sendo os felinos domésticos a espécie mais comumente envolvida nos relatos zoonóticos da enfermidade. Considerando as dificuldades terapêuticas no tratamento da micose, incluindo toxicidade e o desenvolvimento de resistência aos antifúngicos disponíveis, o estudo objetivou avaliar a eficácia in vivo do imunomodulador (1-3) glucana e em associação ao Itraconazol no tratamento da esporotricose sistêmica experimental, além de avaliar a presença do S. schenckii na cavidade oral e a produção de óxido nítrico. Foram utilizados 96 ratos Wistar, machos, os quais foram divididos em seis grupos de 16 animais, sendo eles G1: 0,5mg de glucana previamente (três doses) e pós a inoculação; G2: 0,5 mg glucana pós inoculação; G3: grupo controle; G4: 0,5mg de glucana associada a 10mg/kg de itraconazol; G5: 10mg/kg de itraconazol; e grupo G6: duas doses de 0,5mg de glucana associado a 10mg/kg de itraconazol. Os animais foram inoculados com 0,1ml do inóculo fúngico pela via intraperitoneal e veia lateral da cauda, após uma semana iniciou-se o tratamento dos grupos, quando estes apresentavam sinais clínicos da enfermidade. Após acompanhamento clínico durante a cinco semanas de tratamento e isolamento do agente na cavidade oral dos animais, estes foram eutanasiados e necropsiados para a coleta de sangue, avaliação anatomopatológica dos órgãos, retroisolamento do agente, quantificação das unidades formadoras de colônias (UFC) do baço e quantificação de óxido nítrico. Na primeira avaliação foi observado no grupo G1, uma prevenção da enfermidade desencadeada pela glucana, uma vez que, os animais pertencentes a esse grupo não apresentaram sinais clínicos, lesões anatomopatológicas e obtiveram a menor quantificação de UFC (p<0,5). No entanto no final do período experimental o G4 foi significativamente melhor dentre os grupos de tratamento, pois, findou o período com 70% dos animais sem qualquer alteração clínica, lesões macroscópicas nos órgãos e retroisolamento do agente, além de demonstrar menor quantificação nas UFCs e não ocorrer nenhum óbito decorrente da enfermidade. Os grupos G2, G5 e G6 foram significativamente melhor que o grupo controle uma vez que este grupo apresentou uma mortalidade de 31,25%, além de que 100% dos animais permanceram com alterações clínicas, lesões em órgão como fígado, baço e testículo e demonstraram maior quantificação de UFC (p<0,5). Quanto á produção de óxido nítrico foi verificado maior quantidade nos grupos que receberam a glucana em detrimento aos demais grupos. Em vista dos resultados obtidos conclui-se que a glucana induz a produção de óxido nítrico e os cinco tratamentos demostraram resultados satisfatórios, no entanto, a associação do antifúngico e (1-3) glucana propiciou uma regressão mais precoce das lesões no tratamento da esportricose sistêmica experimental. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by the dimorphic fungus Sporothrix schenckii, which affects humans and a wide variety of animals, domestic cats involved in reports of zoonotic illness. Considering the difficulties in the therapeutic treatment of ringworm, including toxicity and the development of resistance to antifungals available, the study aimed to evaluate the efficacy of the immunomodulator in vivo (1-3) glucan and in combination with Itraconazole in the treatment of experimental systemic sporotrichosis, beyond to evaluate the presence of S. Schenckii in the oral cavity of experimental animals and the production of oxide nitric. Were used 96 male Wistar rats, which were divided into 6 groups of 16 animals, and they were G1: 0.5 mg of glucan in advance (three doses) and after inoculation G2: 0.5 mg glucan after inoculation; G3: control group; G4: 0.5 mg of glucan associated with 10mg/kg of itraconazole; G5: 10mg/kg of itraconazole, and G6: two doses of 0.5 mg of glucan associated 10mg/kg of the itraconazole. The animals were inoculated with 0.1 ml of fungal inoculum by intraperitoneal and lateral tail vein, after one week started treatment groups when they showed clinical signs of disease. After clinical monitoring during the five weeks of treatment and isolation of the agent in the oral cavity of animals, they were euthanized and necropsied to collect blood, anatomopathological evaluation of organs, organ cultures of the agent, and quantification of colony forming units (CFU) of spleen. In the first evaluation was observed in G1, a prevention of the disease triggered by glucan, since the animals from this group showed no clinical signs, anatomopathologicals lesions and obtained the smaller number of CFU (p <0.5). However at the end of experimental period the G4 was significantly better among the treatment groups, therefore, ended the period with 70% of animals without any clinical alteration, macroscopic lesions in organs and organ cultures of the agent, beyond to demonstrate smaller number in CFUs and not occur any deaths resulting from illnes .The groups G2, G5 and G6 were significantly better than the control group since this group had a mortality rate of 31.25%, besides that 100% of the animals remained with clinical changes, lesions in organs such as liver, spleen and testis and demonstrated greater quantification of CFU (p <0,5). As the production of nitric oxide has been found much in the groups receiving the glucan rather than to the other groups. In view of these obtained results it is concluded that glucan induces the production of nitric oxide and the five treatments demonstrated efficacy to the reference sporotrichosis experimental systemically, however, the combination of antifungal (1-3) glucan provided an early regression of the lesions.

A esporotricose, micose subcutânea causada pelo fungo dimórfico Sporothrix schenckii, acomete o homem e várias espécies de animais, sendo os felinos domésticos a espécie mais comumente envolvida nos relatos zoonóticos da enfermidade. Considerando as dificuldades terapêuticas no tratamento da micose, incluindo toxicidade e o desenvolvimento de resistência aos antifúngicos disponíveis, o estudo objetivou avaliar a eficácia in vivo do imunomodulador (1-3) glucana e em associação ao Itraconazol no tratamento da esporotricose sistêmica experimental, além de avaliar a presença do S. schenckii na cavidade oral e a produção de óxido nítrico. Foram utilizados 96 ratos Wistar, machos, os quais foram divididos em seis grupos de 16 animais, sendo eles G1: 0,5mg de glucana previamente (três doses) e pós a inoculação; G2: 0,5 mg glucana pós inoculação; G3: grupo controle; G4: 0,5mg de glucana associada a 10mg/kg de itraconazol; G5: 10mg/kg de itraconazol; e grupo G6: duas doses de 0,5mg de glucana associado a 10mg/kg de itraconazol. Os animais foram inoculados com 0,1ml do inóculo fúngico pela via intraperitoneal e veia lateral da cauda, após uma semana iniciou-se o tratamento dos grupos, quando estes apresentavam sinais clínicos da enfermidade. Após acompanhamento clínico durante a cinco semanas de tratamento e isolamento do agente na cavidade oral dos animais, estes foram eutanasiados e necropsiados para a coleta de sangue, avaliação anatomopatológica dos órgãos, retroisolamento do agente, quantificação das unidades formadoras de colônias (UFC) do baço e quantificação de óxido nítrico. Na primeira avaliação foi observado no grupo G1, uma prevenção da enfermidade desencadeada pela glucana, uma vez que, os animais pertencentes a esse grupo não apresentaram sinais clínicos, lesões anatomopatológicas e obtiveram a menor quantificação de UFC (p<0,5). No entanto no final do período experimental o G4 foi significativamente melhor dentre os grupos de tratamento, pois, findou o período com 70% dos animais sem qualquer alteração clínica, lesões macroscópicas nos órgãos e retroisolamento do agente, além de demonstrar menor quantificação nas UFCs e não ocorrer nenhum óbito decorrente da enfermidade. Os grupos G2, G5 e G6 foram significativamente melhor que o grupo controle uma vez que este grupo apresentou uma mortalidade de 31,25%, além de que 100% dos animais permanceram com alterações clínicas, lesões em órgão como fígado, baço e testículo e demonstraram maior quantificação de UFC (p<0,5). Quanto á produção de óxido nítrico foi verificado maior quantidade nos grupos que receberam a glucana em detrimento aos demais grupos. Em vista dos resultados obtidos conclui-se que a glucana induz a produção de óxido nítrico e os cinco tratamentos demostraram resultados satisfatórios, no entanto, a associação do antifúngico e (1-3) glucana propiciou uma regressão mais precoce das lesões no tratamento da esportricose sistêmica experimental. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by the dimorphic fungus Sporothrix schenckii, which affects humans and a wide variety of animals, domestic cats involved in reports of zoonotic illness. Considering the difficulties in the therapeutic treatment of ringworm, including toxicity and the development of resistance to antifungals available, the study aimed to evaluate the efficacy of the immunomodulator in vivo (1-3) glucan and in combination with Itraconazole in the treatment of experimental systemic sporotrichosis, beyond to evaluate the presence of S. Schenckii in the oral cavity of experimental animals and the production of oxide nitric. Were used 96 male Wistar rats, which were divided into 6 groups of 16 animals, and they were G1: 0.5 mg of glucan in advance (three doses) and after inoculation G2: 0.5 mg glucan after inoculation; G3: control group; G4: 0.5 mg of glucan associated with 10mg/kg of itraconazole; G5: 10mg/kg of itraconazole, and G6: two doses of 0.5 mg of glucan associated 10mg/kg of the itraconazole. The animals were inoculated with 0.1 ml of fungal inoculum by intraperitoneal and lateral tail vein, after one week started treatment groups when they showed clinical signs of disease. After clinical monitoring during the five weeks of treatment and isolation of the agent in the oral cavity of animals, they were euthanized and necropsied to collect blood, anatomopathological evaluation of organs, organ cultures of the agent, and quantification of colony forming units (CFU) of spleen. In the first evaluation was observed in G1, a prevention of the disease triggered by glucan, since the animals from this group showed no clinical signs, anatomopathologicals lesions and obtained the smaller number of CFU (p <0.5). However at the end of experimental period the G4 was significantly better among the treatment groups, therefore, ended the period with 70% of animals without any clinical alteration, macroscopic lesions in organs and organ cultures of the agent, beyond to demonstrate smaller number in CFUs and not occur any deaths resulting from illnes .The groups G2, G5 and G6 were significantly better than the control group since this group had a mortality rate of 31.25%, besides that 100% of the animals remained with clinical changes, lesions in organs such as liver, spleen and testis and demonstrated greater quantification of CFU (p <0,5). As the production of nitric oxide has been found much in the groups receiving the glucan rather than to the other groups. In view of these obtained results it is concluded that glucan induces the production of nitric oxide and the five treatments demonstrated efficacy to the reference sporotrichosis experimental systemically, however, the combination of antifungal (1-3) glucan provided an early regression of the lesions.

A esporotricose, micose subcutânea causada pelo fungo dimórfico Sporothrix schenckii, acomete o homem e várias espécies de animais, sendo os felinos domésticos a espécie mais comumente envolvida nos relatos zoonóticos da enfermidade. Considerando as dificuldades terapêuticas no tratamento da micose, incluindo toxicidade e o desenvolvimento de resistência aos antifúngicos disponíveis, o estudo objetivou avaliar a eficácia in vivo do imunomodulador (1-3) glucana e em associação ao Itraconazol no tratamento da esporotricose sistêmica experimental, além de avaliar a presença do S. schenckii na cavidade oral e a produção de óxido nítrico. Foram utilizados 96 ratos Wistar, machos, os quais foram divididos em seis grupos de 16 animais, sendo eles G1: 0,5mg de glucana previamente (três doses) e pós a inoculação; G2: 0,5 mg glucana pós inoculação; G3: grupo controle; G4: 0,5mg de glucana associada a 10mg/kg de itraconazol; G5: 10mg/kg de itraconazol; e grupo G6: duas doses de 0,5mg de glucana associado a 10mg/kg de itraconazol. Os animais foram inoculados com 0,1ml do inóculo fúngico pela via intraperitoneal e veia lateral da cauda, após uma semana iniciou-se o tratamento dos grupos, quando estes apresentavam sinais clínicos da enfermidade. Após acompanhamento clínico durante a cinco semanas de tratamento e isolamento do agente na cavidade oral dos animais, estes foram eutanasiados e necropsiados para a coleta de sangue, avaliação anatomopatológica dos órgãos, retroisolamento do agente, quantificação das unidades formadoras de colônias (UFC) do baço e quantificação de óxido nítrico. Na primeira avaliação foi observado no grupo G1, uma prevenção da enfermidade desencadeada pela glucana, uma vez que, os animais pertencentes a esse grupo não apresentaram sinais clínicos, lesões anatomopatológicas e obtiveram a menor quantificação de UFC (p<0,5). No entanto no final do período experimental o G4 foi significativamente melhor dentre os grupos de tratamento, pois, findou o período com 70% dos animais sem qualquer alteração clínica, lesões macroscópicas nos órgãos e retroisolamento do agente, além de demonstrar menor quantificação nas UFCs e não ocorrer nenhum óbito decorrente da enfermidade. Os grupos G2, G5 e G6 foram significativamente melhor que o grupo controle uma vez que este grupo apresentou uma mortalidade de 31,25%, além de que 100% dos animais permanceram com alterações clínicas, lesões em órgão como fígado, baço e testículo e demonstraram maior quantificação de UFC (p<0,5). Quanto á produção de óxido nítrico foi verificado maior quantidade nos grupos que receberam a glucana em detrimento aos demais grupos. Em vista dos resultados obtidos conclui-se que a glucana induz a produção de óxido nítrico e os cinco tratamentos demostraram resultados satisfatórios, no entanto, a associação do antifúngico e (1-3) glucana propiciou uma regressão mais precoce das lesões no tratamento da esportricose sistêmica experimental. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by the dimorphic fungus Sporothrix schenckii, which affects humans and a wide variety of animals, domestic cats involved in reports of zoonotic illness. Considering the difficulties in the therapeutic treatment of ringworm, including toxicity and the development of resistance to antifungals available, the study aimed to evaluate the efficacy of the immunomodulator in vivo (1-3) glucan and in combination with Itraconazole in the treatment of experimental systemic sporotrichosis, beyond to evaluate the presence of S. Schenckii in the oral cavity of experimental animals and the production of oxide nitric. Were used 96 male Wistar rats, which were divided into 6 groups of 16 animals, and they were G1: 0.5 mg of glucan in advance (three doses) and after inoculation G2: 0.5 mg glucan after inoculation; G3: control group; G4: 0.5 mg of glucan associated with 10mg/kg of itraconazole; G5: 10mg/kg of itraconazole, and G6: two doses of 0.5 mg of glucan associated 10mg/kg of the itraconazole. The animals were inoculated with 0.1 ml of fungal inoculum by intraperitoneal and lateral tail vein, after one week started treatment groups when they showed clinical signs of disease. After clinical monitoring during the five weeks of treatment and isolation of the agent in the oral cavity of animals, they were euthanized and necropsied to collect blood, anatomopathological evaluation of organs, organ cultures of the agent, and quantification of colony forming units (CFU) of spleen. In the first evaluation was observed in G1, a prevention of the disease triggered by glucan, since the animals from this group showed no clinical signs, anatomopathologicals lesions and obtained the smaller number of CFU (p <0.5). However at the end of experimental period the G4 was significantly better among the treatment groups, therefore, ended the period with 70% of animals without any clinical alteration, macroscopic lesions in organs and organ cultures of the agent, beyond to demonstrate smaller number in CFUs and not occur any deaths resulting from illnes .The groups G2, G5 and G6 were significantly better than the control group since this group had a mortality rate of 31.25%, besides that 100% of the animals remained with clinical changes, lesions in organs such as liver, spleen and testis and demonstrated greater quantification of CFU (p <0,5). As the production of nitric oxide has been found much in the groups receiving the glucan rather than to the other groups. In view of these obtained results it is concluded that glucan induces the production of nitric oxide and the five treatments demonstrated efficacy to the reference sporotrichosis experimental systemically, however, the combination of antifungal (1-3) glucan provided an early regression of the lesions.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-02-23T13:12:51Z No. of bitstreams: 1 Rafael Otaviano do Rego.pdf: 5990645 bytes, checksum: 1f444589a74016f428debc0d941c2609 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-23T13:12:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rafael Otaviano do Rego.pdf: 5990645 bytes, checksum: 1f444589a74016f428debc0d941c2609 (MD5) Previous issue date: 2017-02-14 / The peri-partum period is a critical time for small ruminants because nutritional requirements are very high and feed intake is often limited. Nutritional diseases, such as pregnancy toxemia, can develop. Farmers try to limit these problems. β-glucan and saponin-based plant extracts have been shown to have favourable effects on animal production: immune-modulation for the former and reduced methane production and modification of rumen fermentation patterns for the latter. However, little is known about their effects on metabolism. Therefore, the general objective was to better understand the effects of 1) β-glucan injections and 2) dietary saponin, on metabolism and rumen fermentation in small ruminants during the transition period. The influence of β1,3-glucan (i.m. injections, 1ml/animal/week for 60 days) on the metabolic profile of 14 Santa Inês ewes in the last weeks of gestation was studied. Two groups of ewes were formed in late gestation: a glucan group (G, n=7) and a control group (C, n=7). Nutritional requirements during the experiment were covered. Blood samples were collected throughout the study. Blood samples were analysed for metabolites, ions and enzymes. All ewes were clinically healthy. Glucose, L-lactate, non-esterified fatty acids and β-hydroxybutyrate peaked at parturition (p<0.05). Aspartate aminotransferase (AST) was higher in C vs. G (p<0.05) and there was a similar trend for fructosamine and albumin (p<0.10). Urea tended to be higher in G vs. C (p<0.10). In conclusion, the changes with time were consistent with a change in physiological status (gestation/lactation). β1,3-glucan appeared to protect muscle and liver because AST levels were lower than in controls and it did not negatively affect metabolism. The influence of a dietary saponin-based additive (25g saponin/animal/day) on the metabolic and rumen fermentation profile of Saanen and Alpine dairy goats during two different metabolic situations: metabolic neutrality (mid-lactation) and metabolic imbalance (pregnancy/lactation) was studied in two experiments. Experiment 1, used mid-lactating goats (Saponin group (S), n=10; Control group (C), n=10). The 6 week experiment was divided into: 1 week of C diet, 4 weeks either S or C and 1 week C. Experiment 2, used peri-parturient goats (Saponin group (S), n=12; Control group (C), n=12). The 7 week experiment was divided into: 1 week C diet, 4 weeks either S or C (stopping at parturition) and 2 weeks C. Nutritional requirements during the experiments were covered. Blood samples and rumen fluid were collected throughout both experiments. Blood samples were analysed for metabolites, ions and enzymes. All the goats were clinically healthy. There was no effect of saponin in experiment 1 on animal husbandry measures, plasma metabolites and ruminal fermentation (p>0.05). The ruminal acetate to propionate ratio tended to be affected by treatment (S < C; p=0.057). There was no effect of saponin in experiment 2 on blood metabolites (p>0.05), except for plasma urea (S > C; p=0.054). Total protozoa numbers tended to be affected by treatment (S > C; p<0.10). Most of the animal husbandry, plasma and ruminal variables showed a time effect around parturition (p<0.05). In conclusion, dietary saponin during mid-lactation or the peri-partum period had little effect on metabolism and ruminal fermentation. The trends observed in blood urea, total protozoa count and acetate/propionate ratio could be potentially beneficial. Lastly, the potential for saponin to influence ruminal fermentation may depend on the level, the period of administration and the type of diet. β-glucan and saponin did not have a negative effect on metabolism and it would be interesting to conduct further work in animals suffering from pregnancy toxemia. Studies could also be conducted on the possible immune actions of β-glucan and saponin. / O período do periparto é um momento crítico para os pequenos ruminantes devido às necessidades nutricionais serem muito elevadas e também devido à ingestão de alimentos que muitas vezes é limitada. As doenças nutricionais, como por exemplo, a toxemia da prenhez, pode desenvolver-se, no qual os criadores tentam evitar esses problemas de diversas maneiras. O medicamento β-glucana e o extrato de planta a base de saponina demonstraram ter efeitos favoráveis na produção animal: imuno-modulação para o primeiro e uma redução da produção de metano e modificação dos padrões de fermentação ruminal para esta última. No entanto, pouco se sabe sobre os seus efeitos sobre o metabolismo. Portanto, o objetivo geral foi entender melhor os efeitos de 1) injeções da β-glucana e 2) aditivo saponina, no metabolismo e fermentação ruminal em pequenos ruminantes durante o período de transição. Estudou-se a influência do β1,3-glucana (injeções i.m. 1 ml/animal/semana por 60 dias) no perfil metabólico de 14 ovelhas Santa Inês nas últimas semanas de gestação. Dois grupos de ovelhas foram formados no final da gestação: um grupo glucana (G, n=7) e um grupo controle (C, n=7). Requisitos nutricionais durante o experimento foram cobertos segundo o período metabólico estudado e amostras de sangue foram coletadas ao longo do estudo. As amostras de sangue foram analisadas quanto a metabolitos, ions e enzimas. Todas as ovelhas estavam clinicamente saudáveis. A glicose, o L-lactato, os ácidos graxos não esterificados e o β-hidroxibutirato atingiram o pico no parto (p<0,05). A aspartato aminotransferase (AST) foi maior em C vs. G (p<0,05) e houve tendência semelhante para a fructosamina e a albumina (p<0,10). A ureia apresentou uma tendência a ser maior em G vs. C (p<0,10). Em conclusão, as mudanças com o tempo foram consistentes com uma mudança no estado fisiológico (gestação/lactação). A β1,3-glucana pareceu proteger o músculo e o fígado porque os níveis de AST eram mais baixos no grupo controle e não afetou negativamente o metabolismo. A influência de um aditivo à base de saponina na dieta (25g de saponina/animal/dia) sobre o perfil metabólico e de fermentação ruminal de cabras leiteiras Saanen e Alpina durante duas situações metabólicas diferentes: equilibrio metabólico (meio da lactação) e desequilíbrio metabólico (gestação/lactação) foram estudados em dois experimentos. No experimento 1, utilizaram-se cabras de no meio de lactação (grupo saponina (S), n=10; grupo de controle (C), n=10). O experimento de seis semanas foi dividido em: uma semana de dieta C, quatro semanas S ou C e uma semana C. Experimento 2, utilizou cabras peri-parturientes (grupo Saponina (S), n=12; grupo Controle (C), n=12). O experimento de 7 semanas foi dividido em: uma semana de dieta C, quatro semanas de S ou C (até o momento do parto) e duas semanas de C. Os requisitos nutricionais durante os experimentos foram cobertos. Amostras de sangue e fluido ruminal foram coletados ao longo de ambos os experimentos. As amostras de sangue foram analisadas quanto aos metabolitos, íons e enzimas. Todas as cabras estavam clinicamente saudáveis. Não houve efeito da saponina no experimento 1 em medidas de produção animal, metabolitos plasmáticos e fermentação ruminal (p>0,05). Em relação acetato-propionato ruminal houve uma tendência a ser afetada pelo tratamento (S<C; p=0,057). Não houve efeito da saponina no experimento 2 nos metabólitos do sangue (p>0,05), com exceção da uréia plasmática (S>C; p=0,054). O número total de protozoários tendeu a ser afetado pelo tratamento (S>C, p<0,10). A maior parte das variáveis de produção animal, plasma e ruminal apresentou efeito de tempo no momento do parto (p<0,05). Em conclusão, a saponina na dieta durante o período médio de lactação ou no período periparto teve pouco efeito sobre o metabolismo e fermentação ruminal. As tendências observadas na ureia no sangue, na contagem total de protozoários e na relação acetato / propionato poderiam ser potencialmente benéficas. Por fim, o potencial para a saponina influenciar a fermentação ruminal pode depender do nível, do período de administração e do tipo de dieta. A β-glucana e saponina não têm um efeito negativo sobre o metabolismo e seria interessante realizar um trabalho posterior em animais que sofrem da toxemia da prenhez. Estudos também poderiam ser realizados sobre as possíveis ações imunológicas da β-glucana e da saponina.

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2016-12-14T16:06:41Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Grazzielle Guimarães de Matos - 2016.pdf: 6175984 bytes, checksum: 49ee98e2341033b338755369c46b165a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-12-15T17:30:05Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Grazzielle Guimarães de Matos - 2016.pdf: 6175984 bytes, checksum: 49ee98e2341033b338755369c46b165a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-15T17:30:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Grazzielle Guimarães de Matos - 2016.pdf: 6175984 bytes, checksum: 49ee98e2341033b338755369c46b165a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-03-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In Brazil, L. (V.) braziliensis is specie responsible for many cases of American Tegumentary Leishmaniasis (ETL). To effective vaccine development, formulations contained immunogenic antigens associated with adjuvants that induce a T helpe 1 (Th1) immune response are been investigated, among of antigen have the “Thiol Specific Antioxidant” (rTSA), “Stress Inducible protein 1” (rSTI) and “Leishmania elongation initiation fator” (rLeIF) of L. major, which have been immunogenic and promising. The genes that corresponding to these antigens in L. (V.) braziliensis were sequenced and recombinants proteins were obtained and used in this study. Works that used BCG and β-glucan showed that these could provide protection against not related pathogens. The present study had as aim to evaluate the immunogenicity and the effectiveness of the vaccine using the rTSA, rSTI and rLeIF proteins (Triple), associated or not with β-glucan, with or without BCG stimulus. BALB/c mice were divided in 2 groups, one of the groups was stimulated with BCG and the other not. Posteriorly, the animals were divided in subgroups and vaccinated with triple, associated or not with β-glucan. Mice’s serum were collected to search of cytokines and antibodies by immunoenzymatic technique. Lymph node and spleen’s cells were cultivated and cytokines searched in supernatants. BCG stimulation induced a greater IFN-γ production. The vaccinated mice with triple produced IgG total, IgG1 and IgG2a specifics to L. (V.) braziliensis. BCG stimulation induced a high IgG total and IgG2a production in animals that received the triple without β-glucan. To evaluate the protection provided by vaccine, the immunized animals were infected with L. (V.) braziliensis and paw them measured along of 8 weeks. The subgroup don’t stimulated with BCG and vaccinated with triple, associated with β-glucan, has developed bigger lesions that the others subgroups. The subgroups that received only BCG stimulation or BCG stimulation and vaccine with triple plus β-glucan presented bigger lesions that animal don’t stimulated or vaccinated. After infection by L. (V.) braziliensis, (i) the animals stimulated with BCG and vaccinated with triple presents more IgG specific to L. (V.) braziliensis; (ii) the immunizations with triple maintained IFN-γ levels elevated; (iii) all animals presented lower IL-17 levels in serum; (iv) the subgroups produced similar IFN-γ levels, but with a high IL-17 production in subgroup vaccinated with triple plus β-glucan, don’t BCG stimulated, in spleen; (v) the animals that received only BCG produced more IFN-γ and IL-17 in lymph node. In conclusion: the immunizations with triple were immunogenic; the immunization scheme containing triple plus β- glucan, without BCG stimulation, provided partial protection against L. (V.) braziliensis infection; BCG stimulations induced biggest lesions in subgroup that received only saline or triple plus β-glucan; the vaccination scheme containing triple maintained high IFN-γ production after L. (V.) braziliensis infection; in infection site, the BCG stimulation induced a Th1/Th17 heterologous response. / No Brasil, L. (V.) braziliensis é a espécie responsável pela maioria dos casos de Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). Para o desenvolvimento de uma vacina eficaz, formulações contendo antígenos imunogênicos, associados com adjuvantes, indutores de uma resposta imune do perfil T auxiliar 1 (Th1), estão sendo investigados, entre eles têm-se o “Thiol Specific Antioxidant” (rTSA), a “Stress Inducible protein 1” (rSTI) e o “Leishmania elongation initiation fator” (rLeIF) de L. major, que se mostraram imunogênicos e promissores. Os genes destas proteínas, de L. (V.) braziliensis, foram sequenciados e as proteínas recombinantes obtidas e utilizadas neste estudo. Trabalhos utilizando BCG e β-glucana mostraram a capacidade destes em fornecer proteção inespecífica. O presente estudo teve como objetivo avaliar a imunogenicidade e a eficácia da vacina com as proteínas rTSA, rSTI e Leif (Tríplice) de L. (V.) braziliensis associadas com o adjuvante β-glucana, com ou sem estímulo prévio com BCG. Camundongos BALB/c foram divididos em 2 grupos, um deles inoculado com BCG e o outro não. Posteriormente, os animais foram divididos em subgrupos e vacinados com tríplice, associadas ou não com β-glucana. Foram coletados os soros dos animais para dosagem de citocinas e anticorpos pela técnica imunoenzimática. Células do baço e linfonodo drenante foram cultivadas para dosagem de citocinas no sobrenadante. O estimulo com BCG induziu uma maior produção de IFN-γ. Os camundongos vacinados com a tríplice produziram anticorpos IgG total, IgG1 e IgG2a específicos para L. (V.) braziliensis. O estimulo com BCG induziu uma maior produção de anticorpos IgG total e IgG2a, nos animais vacinados com a tríplice sem β-glucana. Para avaliar a proteção fornecida pela vacina, os animais imunizados foram infectados com L. (V.) braziliensis e as patas mensuradas durante 8 semanas. O subgrupo, não estimulado com BCG e vacinado com a tríplice, associada com β-glucana, desenvolveu lesões menores que os demais subgrupos (p<0,05). Os subgrupos que receberam apenas BCG ou foram vacinados com a tríplice mais β-glucana apresentaram lesões maiores que os animais não estimulados e imunizados (p<0,05). Após a infecção por L. (V.) braziliensis, (i) os animais estimulados e vacinados com a tríplice apresentaram níveis elevados de IgG específicos para L. (V.) braziliensis; (ii) as imunizações com a tríplice mantiveram os níveis de IFN-γ aumentados (p<0,05); (iii) todos os animais apresentaram menores concentrações de IL-17, no soro; (iv) houve detecção similar de IFN-γ entre os subgrupos, mas com uma maior produção de IL-17 no subgrupo vacinado com a tríplice mais β-glucana, não estimulados com BCG, no baço (p<0,05); (v) os animais que receberam apenas BCG produziram mais IFN-γ e IL-17, no linfonodo drenante. Conclui-se que: as imunizações com tríplice foram imunogênicas; o esquema de imunização com a tríplice mais β-glucana, sem estimulo com BCG, forneceu proteção parcial contra a infecção por L. (V.) braziliensis; o estimulo com BCG induziu lesões maiores nos subgrupos que receberam salina ou a tríplice mais β- glucana; o esquema de vacinação com a tríplice manteve a produção de IFN-γ elevada após a infecção por L. (V.) braziliensis; no sitio de infecção, o estimulo com a BCG levou a uma resposta heteróloga Th1/Th17.

Submitted by ANGELICA AUGUSTA GRIGOLI DOMINATO null (angelica@unoeste.br) on 2017-02-16T18:51:51Z No. of bitstreams: 1 Angélica A. Grigoli Dominato.pdf: 4485568 bytes, checksum: 4abc8fe39b8c64a5ed8be37f2be077de (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-02-20T20:26:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dominato_aag_dr_sjrp.pdf: 4485568 bytes, checksum: 4abc8fe39b8c64a5ed8be37f2be077de (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-20T20:26:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dominato_aag_dr_sjrp.pdf: 4485568 bytes, checksum: 4abc8fe39b8c64a5ed8be37f2be077de (MD5) Previous issue date: 2017-01-20 / A atividade metabólica fúngica, especialmente nos endofíticos, favorece a secreção de moléculas como antibióticos, pigmentos, enzimas e polissacarídeos, que podem ser aplicadas nas indústrias alimentícia, cosmética, farmacêutica, entre outras. A diversidade química dos exopolissacarídeos (EPS) bem como a possibilidade de sua utilização como substrato para diferentes modificações químicas (carboxilação, sulfatação e metilação) aumentam seu espectro de aplicação. Realizar o cultivo submerso dos fungos endofíticos Neofusicoccum parvum, Fusarium sp e Colletotrichum gloeosporioides para a produção de EPS foi o primeiro objetivo deste trabalho. Uma vez obtidos, os EPS foram purificados e quimicamente caracterizados. Sulfatação e ensaio da atividade anticoagulante foram realizados. Os parâmetros concentração de inóculo e tempo de cultivo foram estabelecidos para maior produção dos EPS, por fermentação submersa. Etapas de purificação, por centrifugação, foram efetuadas após análises por cromatografia de exclusão estérica a alta pressão, com detecção por índice de refração (HPSEC/RID). Os EPS purificados [precipitado do C. gloeosporioides (C. gloeosporioidesprec) e os três sobrenadantes] mostraram-se praticamente isentos de proteínas. A hidrólise ácida e subsequente análise dos hidrolisados por cromatografia de troca aniônica a alta pressão com detecção por amperometria pulsada (HPAEC/PAD) indicaram que apenas o C. gloeosporioidesprec era uma glucana. A análise por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC/MS) mostrou um único derivado, 1,3,5 tri-O-acetil, 2,4,6-tri-O-metil glucitol com fragmentos de massa (m/z 118, 161, 203, 234.1) condizente com uma glucana do tipo (1→3). Os espectros de FT-IR apresentaram sinais na região de impressão digital, 926 cm-1 e 820 cm-1, típicos de polissacarídeos em configuração . Esses resultados foram confirmados por ressonância magnética nuclear bidimensional (HSQC), com um único acoplamento C1/H1, em 99,3/5,18 ppm e um sinal deslocado para campo baixo, 82,8/3,74 ppm, característico de C-3 substituído, indicando que o EPS é uma α-(1→3)-glucana. A sulfatação desta molécula resultou em α-(1→3)-D-glucanasulf com DS de 0,75 que foi utilizada nos ensaios de atividade anticoagulante. O aumento do tempo para a coagulação, nos testes do APTT (Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada) e TT (Tempo de Trombina), foi concentração-dependente, indicando que [α-(1→3)-D-glucanasulf] pode atuar como um inibidor da via intrínseca da coagulação sanguínea e da conversão do fibrinogênio em fibrina, caracterizando-a como um potencial anticoagulante. / Fungal metabolic activity, especially in the endophytic, favors secretion of molecules such as antibiotics, pigments, enzymes and polysaccharides, which can be applicable by food, cosmetic and pharmaceutical industries, and others. The chemical diversity of the exopolysaccharides (EPS), as well as the possibility of their use as substrate for different chemical modifications (carboxylation, sulfation and methylation) increases their application spectrum. Submerged cultivation of the endophytic fungi Neofusicoccum parvum, Fusarium sp and Colletotrichum gloeosporioides for the production of EPS was the first aim of this study. Once the EPS were obtained, they were purified and chemically characterized. Chemical modification by sulfation and anticoagulant activity assays were performed. Cultivation to obtain EPS were performed in submerged fermentation. The inoculum concentration and incubation time parameters were set in order to obtain a higher amount of EPS. Purification by centrifugation was performed after analysis by high pressure steric exclusion chromatography with refractive index detection (HPSEC / RID). Purified EPS [precipitate of C. gloeosporioides (C. gloeosporioidesprec) and the three supernatants] proved to be virtually free of protein polysaccharides. Acid hydrolysis and subsequent analysis of the hydrolysates with high performance anionic exchange chromatography with amperometric detection (HPAEC/PAD) indicated that only the C. gloeosporioidesprec was a glucan. Analysis from gas chromatography and mass spectrometry showed a single derivative, 1,3,5-tri-Oacetyl, 2,4,6-tri-O-methyl glucitol with mass fragments (m/z 118, 161, 203, 234.1) consistent with a (1→3)-glucan. FT-IR spectra showed absorption bands typical from carbohydrate and signals in the digital region at 926 cm-1 and 820 cm-1, typical of polysaccharides in the α- configuration. These results were confirmed by two-dimensional nuclear magnetic resonance (HSQC), with a single C1/H1, in 99.2/4.98 ppm, typical of one α bonding, and low-field 82.6/3.55 ppm signal displacement, characteristic of substituted C-3, indicating that EPS is an α-(1→3)-glucan. Sulfation of this molecule resulted in α- (1→3)-glucansulf with DS of 0.75 which was used in the anticoagulant activity assays. The increase in coagulation reaction time in the APTT (Activated Partial Thromboplastin Time) and TT (Thrombin Time) tests was concentration-dependent, indicating that [α-(1→3)-D-glucansulf] might act as an inhibitor of the intrinsic via of blood clotting and conversion of fibrinogen into fibrin, characterizing it as a potential anticoagulant.