Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A Esporotricose é uma infecção subaguda ou crônica causada pelo fungo Sporothrix schenckii. A transmissão zoonótica pode ocorrer depois de arranhões ou mordidas de animais, principalmente gatos, roedores e tatus. Até o momento, nenhuma vacina esta em uso para esporotricose ou para qualquer infecção fúngica de importância médica, indicando a necessidade de ampliar a investigação neste campo e explorar novas alternativas. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da radiação gama em leveduras de S. schenckii, visando a sua atenuação, para aplicação posterior de leveduras radioatenuadas no desenvolvimento de uma vacina destinada a imunização de gatos e cães. As leveduras S. schenckii foram cultivadas em meio sólido BHI (Infuso Cérebro e Coração) suplementados com tiamina e na temperatura de 36oC. As culturas foram irradiadas com doses variando de 1,0 a 9,0 kGy. Após cada dose foram avaliados a capacidade reprodutiva, a viabilidade, e o metabolismo de síntese de proteínas. A avaliação da virulência foi realizada pela inoculação das leveduras irradiadas em camundongos Balb/c imunossuprimidos e posterior recuperação de unidades formadoras de colônias (UFCs). A integridade do DNA, a ocorrência de apoptose e de alterações ultraestruturais também foram analisada nas leveduras radioatenuadas. Os resultados mostraram uma redução de 6 ciclos log10 no número de UFCs recuperadas na dose de 6,0 kGy e a partir de 8,0 kGy não foram recuperadas UFCs. A análise de viabilidade indicou que as leveduras permaneceram viáveis até a dose de 9,0 kGy, a maior dose testada. As leveduras irradiadas mantiveram a capacidade de síntese de proteínas, porém esta foi reduzida significarivamente na dose de 9,0 kGy, quando avaliada 24 horas após a irradiação. Os ensaios de virulência utilizando leveduras irradiadas com as doses de 7,0 e 9,0 kGy mostraram que não houve recuperação de UFCs dos órgãos dos camundongos imunossuprimidos, indicando que as células estavam atenuadas. O ensaio de integridade do DNA mostrou que com 7,0 kGy o DNA das leveduras estava fragmentado. Nesta mesma dose foi verificada uma diferença discreta, mas significativa, na ocorrência de apoptose entre as células irradiadas e controles 24 horas após a irradiação. Através da microscopia eletrônica de transmissão foram verificadas alterações ultra-estruturais nas leveduras irradiadas com 7,0 kGy. Duas horas após a irradiação as principais alterações verificadas foram a vacuolização e a perda de homogeneidade do citoplasma. Após 24 horas, além destas alterações o citoplasma se mostrou retraído e freqüentemente se descolando da parede celular. Nossos resultados indicaram que para as leveduras do S. schenckii, foi possível encontrar uma dose absorvida em que o agente tem comprometida sua capacidade reprodutiva e perde a virulência, mantendo a sua viabilidade, uma condição desejável para o desenvolvimento de uma vacina radioatenuada. / Sporotrichosis is a subacute or chronic infection caused by the fungus Sporothrix schenckii. Zoonotic transmission can occur after scratches or bites of animals, mainly cats, rodents, and armadillos. Up to the moment, no approved vaccine was reported for S. schenckii or to any important pathogenic fungi infection in humans, indicating the need to expand the research in this field and to explore new alternatives. The aim of this study was to evaluate the effects of gamma radiation on the viability, metabolic activity and reproductive ability of S. schenckii yeast cells for further studies on the development of a vaccine for immunization of cats and dogs. The culture of S. schenckii, in solid medium, was irradiated at doses ranging from 1.0 to 9.0 kGy. After each dose the reproductive capacity, viability and protein synthesis were estimated. The results showed that a reduction of 6 log10 cycles in the number of colonies was achieved at 6.0 kGy and after 8.0 kGy no colonies could be recovered. The viability analysis indicated that yeast cells remained viable up to 9.0 kGy. The results of protein synthesis analysis showed that the yeast cells, irradiated up to 9.0 kGy, were able to synthesize proteins. But this ability was significantly reduced with 9.0 kGy, 24 h after irradiation. The virulence assays using yeast irradiated with doses of 7.0 and 9.0 kGy showed no CFUs recovery from tissues of immunosuppressed mice, indicating that the cells were attenuated. The DNA integrity test showed that the DNA of 7.0 kGy irradiated yeast cells was fragmented. At the same dose was verified a discrete but significant increase in the apoptose occurrence in relation to controls 24 hours after the irradiation. By transmission electron microscopy were observed ultrastructural changes in yeast irradiated with 7.0 kGy. Two hours after irradiation the major changes were the vacuolization and the loss of homogeneity of the cytoplasm. After 24 hours, apart from these changes, the cytoplasm was often retracted and sometimes taking off from the cell wall. Our results indicated that for the yeast cells of S. schenckii, it was possible to find an absorbed dose in which the fungus loses the virulence, while maintaining the viability, a desirable condition for the development of a radioattenuated yeast vaccine.

Esporotricose é uma micose subcutânea, causada principalmente pelo fungo Sporothrix schenckii e a nova espécie Sporothrix brasiliensis. Foi relatado na literatura que os camundongos infectados com a cepa de S. schenckii M-64 produziu uma resposta imune mista, em que o soro dos camundongos infectados reagiram apenas com uma glicoproteína de 70 kDa (gp70), identificada como importante fator de virulência. Assim o presente trabalho visa avaliar a importância à virulência e eficácia do anticorpo monoclonal P6E7 em outras cepas do complexo Sporothrix. Camundongos foram infectados com as cepas de S. schenckii (1099-18 e 15383) e S. brasiliensis (5110 e 17943). Cada 7 dias, o baço e fígado foram retirados para a análise do UFC e citocinas. Foi realizado western blot com o soro dos camundongos infectados e com anticorpo monoclonal P6E7 utilizando o exoantígenos das diferentes cepas. Foi realizado protocolo de tratamento com o anticorpo P6E7 nos camundongos infectados, para a avaliação da carga fúngica no baço e no fígado. Análise de citocinas mostrou que as cepas de S. schenckii induziram uma resposta mista Th1/Th2, entretanto nos camundongos infectados com as cepas de S. brasiliensis, não foi observada produção significativa de citocinas. No western blot realizado com exoantígenos das cepas de Sporothrix sp. foi observado diferentes componentes antigênicos, quando o soro de camundongos infectados foi utilizado, porém a reação com anticorpo monoclonal contra a gp70 demonstrou que a gp70 estava presente apenas no exoantígeno da cepa mais virulenta 5110. Infecção realizada com todas as cepas demonstrou cronicidade pela análise UFC. O tratamento com o AcMo P6E7 foi eficaz no tratamento da esporotricose experimental, sendo capaz de diminuir a carga fúngica, principalmente no baço dos camundongos infectados. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis, caused mainly by fungi Sporothrix schenckii and the new specie Sporothrix brasiliensis. Was reported in previous studies that mice infected with low virulent S. schenckii M-64 strain, produced a mixed immune response, where the infected mice serum reacted only with a 70 kDa glycoprotein (gp70), identified as important virulence factor. Thus, the present study aims to evaluate the virulence importance and effectiveness of monoclonal antibody P6E7 in other Sporothrix complex strains. Mice were infected with Sporothrix yeast strain of S. schenckii (1099-18 and 15383) and S. brasiliensis (5110 and 17943). Each 7 days, the spleen and liver were taken for CFU and cytokines analysis. The western blot was performed with the serum obtained from infected mice and a monoclonal antibody P6E7 using exoantigens from different strains. Was performed treatment protocol with the monoclonal antibody P6E7 on infected mice, for spleen and liver fungal burden evaluation. Cytokine analysis showed that S. schenckii strains induce a mixed Th1/Th2 response, however in the S. brasiliensis strains wasn\'t observed significant cytokine production. In western blot accomplished with the strains exoantigens was observed different antigenic components when the infected mice serum was used, however with monoclonal antibody against gp70 demonstrated that gp70 was present only in most virulent strain 5110. Infection performed with all strains demonstrated chronicity for CFU analysis. Treatment with Mab P6E7 was effective in experimental sporotrichosis, with reducing capable of fungal load, mainly in the spleen of infected mice.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica de homem e animais, causada pela implantação traumática do patógeno e que normalmente envolve a derme e o tecido subcutâneo. Desde 1898, quando o agente etiológico esporotricose foi descoberto por Schenck, esta doença tem sido atribuída a um único patógeno, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 º C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, os isolados identificados como S. schenckii demonstraram uma grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies crípticas. Com base nesta informação o nosso grupo está interessado no estudo da taxonomia polifásica deste complexo de espécies e suas implicações sobre a eco-epidemiologia da doença no Brasil. Foram estudadas 161 cepas de Sporothrix spp. provenientes de amostras clínicas e ambientais de diversas regiões do Brasil e outros países. Os parâmetros fenotípicos analisados levaram em consideração o crescimento vegetativo em meio PDA sob diferentes temperaturas (30, 35, 37 e 40 º C), a coloração da colônia em meio CMA, o padrão de assimilação de fontes de carbono (glicose, ribitol, rafinose e sacarose) e as características micro morfológicas in vitro. Os dados fenotípicos foram confirmados por biologia molecular utilizando as informações de sequenciamento de DNA de um fragmento do lócus calmodulina. Nossos dados mostram que S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e S. schenckii tem uma ampla distribuição geográfica no Brasil. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira descrição na literatura da espécie S. mexicana fora do México, e provocando doença em hospedeiro humano. S. brasiliensis foi isolado com alta frequência de gatos nos estados do Rio Grande do Sul e Rio de Janeiro, sugerindo que este animal tem sido um importante vetor na epidemiologia desta espécie. Uma abordagem proteômica foi proposta neste trabalho para comparar o perfil protéico de isolados de Sporothrix spp. com o intuito de entendermos as diferenças em termos de expressão de proteína entre as espécies crípticas. Os perfis 2-D foram fortemente diferentes entre os isolados. Para elucidar o principal antígeno da esporotricose humana, o fungo foi cultivado em meio BHI caldo, 37 °C e as proteínas intracelulares foram fracionadas por eletroforese bidimensional. As proteínas foram transferidas para uma membrana e, em seguida, incubadas com soro de pacientes com as duas principais formas clínicas da doença (cutânea fixa e linfocutânea). Nossos resultados demonstram que anticorpos IgG presentes no soro de pacientes reagem com diferentes antígenos dos isolados do complexo Sporothrix schenckii. O imunoblot mostrou que existem imunoglobulinas que reagem com um antígeno de 70 kDa em três isolados (S. brasiliensis, S. globosa e S. schenckii). Diferenças no perfil de antigenicidade foram observadas entre S. mexicana e as demais espécies aqui avaliadas. / Sporotrichosis is a chronic mycotic infectious disease of man and animals caused by the traumatic implantation of a pathogenic fungus that typically involves the skin and subcutaneous tissue. Since 1898, when the sporotrichosis etiological agent was discovered by Schenck, this disease has been attributed to a single pathogen, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, a thermo dimorphic fungus that grow as a yeast at 37 ºC and as a mycelium at room temperature. However, isolates identified as S. schenckii showed a great deal of genetic variability, suggesting that this taxon consist in a cryptic species complex. Based on this information our group is interested in the study of the polyphasic taxonomy of this species complex and its implication on its ecoepidemiology in Brazil. We studied 161 strains of Sporothrix spp. provided from environmental and clinical samples obtained from diverse regions of Brazil and other countries. The phenotypic parameters assayed include vegetative growth on PDA media at different temperatures (30, 35, 37 and 40 ºC), the colony colors on CMA media, the assimilation pattern of carbon sources (raffinose, ribitol and sucrose) and morphological microscopic features of in vitro cultivation. The phenotypic data were confirmed by molecular biology using the sequencing information of a fragment of calmodulin locus. Our data show that the S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana and S. schenckii have a widespread geographical distribution in Brazil. To our knowledgement this is the first description of the specie S. mexicana outside of Mexico and causing disease in human host. S. brasiliensis was isolated with high frequency from cats in Rio Grande do Sul and Rio de Janeiro states, suggesting that cats has been an important vector in epidemiology of this specie. A proteomic approach was proposed in this work to compare protein profile of Sporothrix spp. isolates and get a better understanding about the differences in terms of protein expression among the cryptic species. The 2-D profiles were strongly different among the isolates. To elucidate the major antigen of human sporotrichosis, the fungus was cultured in BHI broth, 37 °C, and intracellular proteins were resolved by 2-DE. Proteins were transferred to a nitrocellulose membrane and then incubated with serum from patients with the two major clinical form of disease (cutaneous fixed and linfocutaneous). Our results show that IgG present in serum from patients react with different antigens from Sporothrix schenckii complex. Immunoblotting showed that the sera of patients had antibodies reacting with a 70 kDa antigen in three isolates (S. brasiliensis, S. globosa and S. schenckii). Profile differences in antigenicity were observed between S. mexicana and the other species studied here. / FAPESP: 2008/55975-8 / TEDE

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica, que envolve o tecido cutâneo e subcutâneo, e que pode afetar seres humanos e animais. Esta micose sempre foi atribuída a um único patógeno, o Sporothrix schenckii, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, nos últimos anos, foi demonstrado que isolados identificados como S. schenckii apresentavam grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies. Esta doença é causada pela implantação traumática do patógeno fúngico, porém, os mecanismos de invasão e disseminação deste microorganismo, bem como as moléculas envolvidas nestes processos, ainda são pouco conhecidos. Com base nessas informações, este trabalho visa identificar moléculas de superfície deste patógeno envolvidas na interação deste fungo com proteínas matriciais, bem como analisar diferenças fenotípicas entre espécies do denominado complexo Sporothrix. Foram utilizados, neste estudo, cinco isolados de Sporothrix spp., sendo três isolados clínicos, um isolado ambiental e um isolado de gato. A virulência de cada isolado foi comparada à capacidade adesiva à proteína matricial fibronectina. Foi observado que os isolados com maior capacidade infectiva eram os que apresentavam maior capacidade adesiva à fibronectina. Verificamos então a expressão de adesinas para fibronectina na superfície de cada isolado, por Western blot, e observamos que os isolados mais virulentos e com maior capacidade adesiva expressavam mais adesinas para fibronectina. Bandas reativas com o anticorpo monoclonal contra adesina gp70 (mAb P6E7) foram reveladas nos extratos de parede celular dos isolados estudados. Análises por microscopia confocal revelaram a co-localização da gp70 com a adesina para fibronectina na superfície dos isolados. Análises filogenéticas demonstraram que os isolados estudados possuíam diferenças genotípicas capazes de agrupá-los em duas espécies, S. schenckii e S. brasiliensis. Esta análise revelou que o isolado avirulento era S. brasiliensis e não S. schenckii, como se pensava. Este dado novo nos levou a verificar se a virulência e as características fenotípicas estariam relacionadas ao genótipo. A avaliação da virulência mostrou que outro isolado de S. brasiliensis era tão virulento quanto os isolados de S. schenckii. Além disso, as características morfológicas, como tamanho, forma e perfil de crescimento, das fases miceliana e leveduriforme, e características microscópicas da parede das leveduras também foram avaliadas. Porém, não foi possível correlacionar, de forma clara, a morfologia celular com a especiação do gênero Sporothrix. A expressão da gp70 na superfície das duas espécies foi verificada e foi observado que o isolado virulento de S. brasiliensis quase não expressa a gp70 na sua superfície em contraste com o isolado avirulento de S. brasiliensis, que além de expressar esta glicoproteína em grande quantidade ainda a libera para o meio extracelular. Este estudo mostra que há uma correlação direta entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre características fenotípicas e genótipo. / Sporotrichosis is a chronic and infectious disease that involves the cutaneous and subcutaneous tissue, which can affect humans and animals. This mycosis has always been attributed to a single pathogen, the Sporothrix schenckii, a dimorphic fungus, that grows as yeast at 37 C and as mycelia at room temperature. However, in recent years, some isolates identified as S. schenckii showed considerable genetic variability, suggesting that this taxon consists of a complex of species. This disease is caused by the traumatic inoculation of the fungal pathogen, however, the molecules involved in the invasion and dissemination of this microorganism are still poorly understood. The aim of this study is to identify surface molecules involved in the interaction of this fungus with extracellular matrix proteins and to examine phenotypic differences between species in the Sporothrix complex. Five isolates were used throughout this study, three clinical isolates, an environmental and one cat isolate. The virulence of each isolate was compared to the adhesive capacity to fibronectin. We observed that the most virulent isolates exhibited the higher capacity to interact with fibronectin. The expression of adhesins for fibronectin on the surface of each isolate was verified by Western blot. This analysis showed that the most virulent isolates expressed more fibronectin adhesins than the avirulent ones. Positive bands for the monoclonal antibody raised against gp70 adhesin (mAb P6E7) were revealed in cell wall extracts of the isolates studied. Confocal microscopy confirmed the colocalization of fibronectin and mAb P6E7 on the yeast cell surface. Molecular analysis showed genotypic differences between isolates used in this study, that can cluster than them into two species, S. schenckii and S. brasiliensis. This phylogenetic analysis revealed that the avirulent isolate was S. brasiliensis and not S. schenckii as previously thought. This new data led us to determine whether the virulence and phenotypic characteristics were related to genotype. The virulence analysis showed that another S. brasiliensis isolate was as virulent as the S. schenckii isolates. Moreover, morphological characteristics, such as, size, shape and growth profile of mycelial and yeast were also evaluated. However, no connection was observed between cell morphology with the speciation of the genus Sporothrix. The cell wall expression of gp70 was evaluated in the twou species. We observed that the virulent isolate of S. brasiliensis almost do not express gp70 in contrast with the avirulent isolate of the same specie. This study shows that there is a direct correlation between virulence and adhesins expression, however, no relationship between genotype and phenotypic characteristics was observed.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis that affects humans and animals, and it is caused by dimorphic melanized fungi belonging to the genus Sporothrix. Sporotrichosis is mainly acquired by traumatic implantation of the fungus into the dermis through scratches inflicted by domestic animals or by handling plants. This study approaches: a) the in vitro susceptibility of Sporothrix schenckii complex species to photodynamic inactivation using methylene blue as a photosensitizer and laser as the light source; b) the combination of amphotericin B plus posaconazole in a murine model of systemic infection by S. brasiliensis and S. schenckii sensu stricto, seeking to enhance the treatment of disseminated sporotrichosis; c) the interference of fungal melanin in the in vitro susceptibility of S. brasiliensis and S. schenckii sensu stricto to amphotericin B and itraconazole. In the photodynamic therapy study we have applied methylene blue as a photosensitizing agent and Light emitting diode (InGaAlP) against Sporothrix schenckii complex species in an in vitro assay. The viability of the conidia was determined through the counting of colony forming units. The activity of amphotericin B and posaconazole alone or in combination was evaluated by using a microdilution checkerboard method. For the in vivo study, OF-1 mice were intravenously (i.v.) infected with a lethal inoculum of 2 x 107 CFU/animal. Two strains of S. brasiliensis and two of S. schenckii were tested. Animals received amphotericin i.v. at suboptimal dose i.e., 0.3 mg/kg, in combination with oral posaconazole at 2.5 mg/kg, 5 mg/kg or 10 mg/kg BID. Results were compared with their respective monotherapies and efficacy was evaluated by prolongation of survival and reduction of tissue burden in spleen and liver. In the study of the interference of melanin in the susceptibility of S. brasiliensis and S. schenckii sensu stricto, yeast cells were cultivated in minimal medium with or without L-DOPA in order to induce the production of melanin. Microdilution and time-kill methods were used to determine the antifungal activity against yeast cells with different amounts of melanin. The laser light (InGaAlP) together with a methylene blue photosensitizer were able to significantly reduce the growth of all the tested Sporothrix strains. In vitro data demonstrated a synergistic effect of the combination and although posaconazole alone was effective against sporotrichosis, efficacy was increased when combined with amphotericin B. The maximum efficacy of the combinations was obtained with posaconazole 5 mg/kg. The killing assay showed that melanization protected isolates within the Sporothrix schenckii complex from amphotericin B, particularly in the lower concentrations tested. The conclusions of the present study are: a) the in vitro inhibition of Sporothrix spp. isolates by laser light deserves in vivo experimental and clinical studies since it may be a promising treatment for cutaneous and subcutaneous sporotrichosis; b) posaconazole in combination with suboptimal doses of amphotericin B could be an option in the treatment of disseminated sporotrichosis especially when itraconazole or amphotericin B at optimal doses are contraindicated; c) combination studies of amphotericin B with inhibitors of melanin are required in order to avoid this effect. / A esporotricose é uma micose subcutânea que afeta homens e animais, e é causada por fungos dimórficos melanizados pertencentes ao gênero Sporothrix. Pode ser principalmente adquirida por implantação traumática do fungo na derme através da arranhadura de animais domésticos ou manipulação de plantas contaminadas. O presente estudo investigou: a) a suscetibilidade in vitro de espécies do Complexo Sporothrix schenckii à inativação fotodinâmica; b) a combinação de anfotericina B e posaconazol em modelo murino de infecção sistêmica por S. brasiliensis e S. schenckii stricto sensu, buscando melhorar o tratamento da esporotricosse disseminada; c) a interferência da melanina fúngica na suscetibilidade in vitro de S. brasiliensis e S. schenckii stricto sensu à anfotericina B e itraconazol. No estudo da terapia fotodinâmica foi aplicado azul de metileno como fotossensibilizador e emissão de luz diiodo (InGaAlP) frente espécies do complexo Sporothrix schenckii em ensaio in vitro. A viabilidade dos conídios foi determinada através de contagem de unidades formadoras de colônia (UFC). A atividade da anfotericina B e posaconazol sozinhos ou combinados foi avaliada segundo a técnica de microdiluição em caldo e técnica de checkerboard. No estudo in vivo, camundongos OF-1 foram infectados com um inóculo de 2 x 107 UFC/animal. Foram utilizadas duas cepas de S. brasiliensis e duas cepas de S. schenckii. Os animais receberam doses de 0.3 mg/kg de anfotericina B em combinação com 2.5 mg/kg e 5 mg/kg de posaconazol. Os resultados foram comparados com as respectivas monoterapias e a eficácia foi avaliada através do prolongamento da sobrevivência e redução da carga fúngica no fígado e baço. No estudo da interferência da melanina na suscetibilidade de S. brasiliensis e S. schenckii stricto sensu à anfotericina B e itraconazol, células leveduriformes foram cultivadas em meio mínimo com e sem L-DOPA. Métodos de microdiluição e tempo de morte foram utilizados para determinar a atividade dos antifúngicos frente às células com diferentes quantidades de melanina. A luz laser (InGaAlP) em conjunto com o azul de metileno foram capazes de reduzir significativamente o crescimento de todas as cepas de Sporothrix testadas. Os dados in vitro demonstraram um efeito sinérgico da combinação de posaconazol e anfotericina B, e, apesar de o posaconazol 5 mg/kg sozinho apresentar eficácia contra a esporotricose, teve sua eficiência aumentada quando combinado com anfotericina B 0,3 mg/kg. A técnica de tempo de morte mostrou que a melanização protegeu os isolados do complexo Sporothrix schenckii da anfotericina B, particularmente na concentração mais baixa testada. Desta forma, as conclusões do presente estudo são: a) a inibição fotodinâmica in vitro de isolados de Sporothrix merece estudos experimentais e clínicos, uma vez que pode ser um tratamento promissor para a esporotricose cutânea e subcutânea; b) o posaconazol em combinação com dose baixa de anfotericina B pode ser uma opção para o tratamento de esporotricose disseminada, especialmente quando itraconazol e anfotericina B são contraindicados; c) estudos de combinação de anfotericina B com inibidores de melanina são necessários a fim de evitar o efeito protetor da melanina contra as defesas do organismo e contra antifúngicos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sporotricosis is an acute or subacute mycotic infection caused by the Sporothrix complex species. The disease was already described in humans and in several animal species, mostly in cats, horses and dogs. Based on several outbreak reports in the literature, the species more predominant in cats of the Southeast and South regions of Brazil is S. brasiliensis. The transmission to humans include the occupational and the zoonotic forms. The presentation form more often seen in cats is multiple skin and mucosal lesions. The diagnostic methods include the isolation and identification of the agente in culture, the histopathology, the cytology, the intradermal sporotrichin test, the immunohistochemistry technique, and the polymerase chain reaction (PCR). The histopathological diagnosis is based on the morphological characteristics of the fungus and the respective inflammatory reaction. The main objectives of this retrospective study were to characterize the histomorphological and histochemical aspects of sporotrichosis in 10 cats, and also to evaluate epidemiological and clinical aspects, and gross findings obtained from the biopsy and necropsy protocols of the archives of the Laboratório de Patologia Veterinária of the Universidade Federal de Santa Maria. The disease affected mostly male mongrel cats, and was mostly observed in the cutaneous disseminated form. Gross lesions were characterized by cutaneous nodules (ulcerated or not) and by ulcerated masses or plaques. By histopathology, there were a relationship between the fungal load and two patterns of inflammatory response. The first pattern was characterized by high fungal load, and most yeasts were inside of numerous macrophages with abundant, many times vacuolated cytoplasm. The amount of neutrophils ranged from mild to moderate in this pattern. The second pattern was characterized by numerous epiteliod cells and many neutrophils. The fungal load was low and most yeasts were observed in the extracellular space. The yeasts were round, oval or cigar-shaped. Several histochemical techniques, such as Grocott s silver stain, periodic Schiff acid, and Alcian blue were utilized and they made it easier to visualize, to characterize the morphology, and to quantify the organisms. The Giemsa stain allowed visualizing the agent, but it not allowed to sharply highlight them from other intralesional components. Organisms were negative for melanin granules through the Fontana-Masson stain in all cases. The histomorphological and histochemical study allowed demonstrating determinant fungal characteristics to the establishment of the diagnosis by means of this diagnostic tool. / Esporotricose é uma infecção fúngica subaguda ou crônica, causada por espécies do complexo Sporothrix. A doença já foi descrita em humanos e em diversas espécies animais, mas ocorre com maior frequência em gatos, cavalos e cães. Baseado em vários relatos de surtos na literatura, a espécie mais predominante em gatos das regiões Sul e Sudeste do Brasil é S. brasiliensis. As formas de transmissão para humanos incluem a ocupacional e a zoonótica. A forma de apresentação mais frequente em gatos é de múltiplas lesões de pele e mucosas. Os métodos de diagnóstico compreendem o isolamento e identificação do agente em cultura, a histopatologia, a citologia, o teste intradérmico da esporotriquina, a técnica de imuno-histoquímica (IHQ) e a reação em cadeia de polimerase (PCR). O diagnóstico histopatológico é realizado observando-se as características morfológicas do fungo e a respectiva reação inflamatória. Os principais objetivos deste estudo retrospectivo foram caracterizar os aspectos histomorfológicos e histoquímicos da esporotricose em 10 gatos, além de avaliar os aspectos epidemiológicos, clínicos e os achados macroscópicos obtidos dos protocolos de biópsias e necropsias dos arquivos do Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Santa Maria. A doença afetou predominantemente gatos machos, sem raça definida e na forma cutânea disseminada. As lesões macroscópicas caracterizaram-se como nódulos cutâneos (ulcerados ou não) e como massas e placas ulceradas. Na histopatologia observou-se uma relação entre a quantidade de leveduras observada e dois padrões de resposta inflamatória. O primeiro padrão caracterizou-se por numerosas leveduras encontradas, na sua maioria, no interior de numerosos macrófagos com citoplasma abundante e muitas vezes vacuolizado. A quantidade de neutrófilos variava de leve a moderada e havia infiltrado geralmente leve de linfócitos e plasmócitos. O segundo padrão caracterizava-se por leve quantidade de leveduras observadas geralmente livres no espaço extracelular, numerosas células epitelioides e infiltrado predominantemente acentuado de neutrófilos. As leveduras eram redondas, ovais ou alongadas (em forma de charuto). Foram utilizadas várias técnicas histoquímicas como a impregnação pela prata de Grocott, ácido periódico de Schiff e azul Alciano que facilitaram a visualização, caracterização da morfologia e quantificação dos organismos. A coloração de Giemsa permitiu a visualização do agente, porém não permitiu destacá-los dos debris celulares. Os organismos foram negativos para grânulos de melanina pela coloração de Fontana-Masson em todos os casos. O estudo histomorfológico e histoquímico permitiu demonstrar características fúngicas determinantes para o estabelecimento do diagnóstico de esporotricose através dessa ferramenta diagnóstica.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica, que envolve o tecido cutâneo e subcutâneo, e que pode afetar seres humanos e animais. Esta micose sempre foi atribuída a um único patógeno, o Sporothrix schenckii, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, nos últimos anos, foi demonstrado que isolados identificados como S. schenckii apresentavam grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies. Esta doença é causada pela implantação traumática do patógeno fúngico, porém, os mecanismos de invasão e disseminação deste microorganismo, bem como as moléculas envolvidas nestes processos, ainda são pouco conhecidos. Com base nessas informações, este trabalho visa identificar moléculas de superfície deste patógeno envolvidas na interação deste fungo com proteínas matriciais, bem como analisar diferenças fenotípicas entre espécies do denominado complexo Sporothrix. Foram utilizados, neste estudo, cinco isolados de Sporothrix spp., sendo três isolados clínicos, um isolado ambiental e um isolado de gato. A virulência de cada isolado foi comparada à capacidade adesiva à proteína matricial fibronectina. Foi observado que os isolados com maior capacidade infectiva eram os que apresentavam maior capacidade adesiva à fibronectina. Verificamos então a expressão de adesinas para fibronectina na superfície de cada isolado, por Western blot, e observamos que os isolados mais virulentos e com maior capacidade adesiva expressavam mais adesinas para fibronectina. Bandas reativas com o anticorpo monoclonal contra adesina gp70 (mAb P6E7) foram reveladas nos extratos de parede celular dos isolados estudados. Análises por microscopia confocal revelaram a co-localização da gp70 com a adesina para fibronectina na superfície dos isolados. Análises filogenéticas demonstraram que os isolados estudados possuíam diferenças genotípicas capazes de agrupá-los em duas espécies, S. schenckii e S. brasiliensis. Esta análise revelou que o isolado avirulento era S. brasiliensis e não S. schenckii, como se pensava. Este dado novo nos levou a verificar se a virulência e as características fenotípicas estariam relacionadas ao genótipo. A avaliação da virulência mostrou que outro isolado de S. brasiliensis era tão virulento quanto os isolados de S. schenckii. Além disso, as características morfológicas, como tamanho, forma e perfil de crescimento, das fases miceliana e leveduriforme, e características microscópicas da parede das leveduras também foram avaliadas. Porém, não foi possível correlacionar, de forma clara, a morfologia celular com a especiação do gênero Sporothrix. A expressão da gp70 na superfície das duas espécies foi verificada e foi observado que o isolado virulento de S. brasiliensis quase não expressa a gp70 na sua superfície em contraste com o isolado avirulento de S. brasiliensis, que além de expressar esta glicoproteína em grande quantidade ainda a libera para o meio extracelular. Este estudo mostra que há uma correlação direta entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre características fenotípicas e genótipo. / Sporotrichosis is a chronic and infectious disease that involves the cutaneous and subcutaneous tissue, which can affect humans and animals. This mycosis has always been attributed to a single pathogen, the Sporothrix schenckii, a dimorphic fungus, that grows as yeast at 37 C and as mycelia at room temperature. However, in recent years, some isolates identified as S. schenckii showed considerable genetic variability, suggesting that this taxon consists of a complex of species. This disease is caused by the traumatic inoculation of the fungal pathogen, however, the molecules involved in the invasion and dissemination of this microorganism are still poorly understood. The aim of this study is to identify surface molecules involved in the interaction of this fungus with extracellular matrix proteins and to examine phenotypic differences between species in the Sporothrix complex. Five isolates were used throughout this study, three clinical isolates, an environmental and one cat isolate. The virulence of each isolate was compared to the adhesive capacity to fibronectin. We observed that the most virulent isolates exhibited the higher capacity to interact with fibronectin. The expression of adhesins for fibronectin on the surface of each isolate was verified by Western blot. This analysis showed that the most virulent isolates expressed more fibronectin adhesins than the avirulent ones. Positive bands for the monoclonal antibody raised against gp70 adhesin (mAb P6E7) were revealed in cell wall extracts of the isolates studied. Confocal microscopy confirmed the colocalization of fibronectin and mAb P6E7 on the yeast cell surface. Molecular analysis showed genotypic differences between isolates used in this study, that can cluster than them into two species, S. schenckii and S. brasiliensis. This phylogenetic analysis revealed that the avirulent isolate was S. brasiliensis and not S. schenckii as previously thought. This new data led us to determine whether the virulence and phenotypic characteristics were related to genotype. The virulence analysis showed that another S. brasiliensis isolate was as virulent as the S. schenckii isolates. Moreover, morphological characteristics, such as, size, shape and growth profile of mycelial and yeast were also evaluated. However, no connection was observed between cell morphology with the speciation of the genus Sporothrix. The cell wall expression of gp70 was evaluated in the twou species. We observed that the virulent isolate of S. brasiliensis almost do not express gp70 in contrast with the avirulent isolate of the same specie. This study shows that there is a direct correlation between virulence and adhesins expression, however, no relationship between genotype and phenotypic characteristics was observed.

Esporotricose é uma micose subcutânea, causada principalmente pelo fungo Sporothrix schenckii e a nova espécie Sporothrix brasiliensis. Foi relatado na literatura que os camundongos infectados com a cepa de S. schenckii M-64 produziu uma resposta imune mista, em que o soro dos camundongos infectados reagiram apenas com uma glicoproteína de 70 kDa (gp70), identificada como importante fator de virulência. Assim o presente trabalho visa avaliar a importância à virulência e eficácia do anticorpo monoclonal P6E7 em outras cepas do complexo Sporothrix. Camundongos foram infectados com as cepas de S. schenckii (1099-18 e 15383) e S. brasiliensis (5110 e 17943). Cada 7 dias, o baço e fígado foram retirados para a análise do UFC e citocinas. Foi realizado western blot com o soro dos camundongos infectados e com anticorpo monoclonal P6E7 utilizando o exoantígenos das diferentes cepas. Foi realizado protocolo de tratamento com o anticorpo P6E7 nos camundongos infectados, para a avaliação da carga fúngica no baço e no fígado. Análise de citocinas mostrou que as cepas de S. schenckii induziram uma resposta mista Th1/Th2, entretanto nos camundongos infectados com as cepas de S. brasiliensis, não foi observada produção significativa de citocinas. No western blot realizado com exoantígenos das cepas de Sporothrix sp. foi observado diferentes componentes antigênicos, quando o soro de camundongos infectados foi utilizado, porém a reação com anticorpo monoclonal contra a gp70 demonstrou que a gp70 estava presente apenas no exoantígeno da cepa mais virulenta 5110. Infecção realizada com todas as cepas demonstrou cronicidade pela análise UFC. O tratamento com o AcMo P6E7 foi eficaz no tratamento da esporotricose experimental, sendo capaz de diminuir a carga fúngica, principalmente no baço dos camundongos infectados. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis, caused mainly by fungi Sporothrix schenckii and the new specie Sporothrix brasiliensis. Was reported in previous studies that mice infected with low virulent S. schenckii M-64 strain, produced a mixed immune response, where the infected mice serum reacted only with a 70 kDa glycoprotein (gp70), identified as important virulence factor. Thus, the present study aims to evaluate the virulence importance and effectiveness of monoclonal antibody P6E7 in other Sporothrix complex strains. Mice were infected with Sporothrix yeast strain of S. schenckii (1099-18 and 15383) and S. brasiliensis (5110 and 17943). Each 7 days, the spleen and liver were taken for CFU and cytokines analysis. The western blot was performed with the serum obtained from infected mice and a monoclonal antibody P6E7 using exoantigens from different strains. Was performed treatment protocol with the monoclonal antibody P6E7 on infected mice, for spleen and liver fungal burden evaluation. Cytokine analysis showed that S. schenckii strains induce a mixed Th1/Th2 response, however in the S. brasiliensis strains wasn\'t observed significant cytokine production. In western blot accomplished with the strains exoantigens was observed different antigenic components when the infected mice serum was used, however with monoclonal antibody against gp70 demonstrated that gp70 was present only in most virulent strain 5110. Infection performed with all strains demonstrated chronicity for CFU analysis. Treatment with Mab P6E7 was effective in experimental sporotrichosis, with reducing capable of fungal load, mainly in the spleen of infected mice.

A esporotricose caracteriza-se como uma micose subcutânea causada por fungos dimórficos do gênero Sporothrix, capazes de acometer o homem e uma grande variedade de animais, dentre eles os felinos. A princípio, Sporothrix schenckii era a única espécie conhecida como responsável pela esporotricose. Após estudos genotípicos e fenotípicos de isolados ambientais, clínicos humanos e animais, verificou-se alta variabilidade entre os isolados e estabeleceu-se a existência de um Complexo Sporothrix. Dentro deste, a maior causadora de surtos epidêmicos, justificada por uma maior virulência e capacidade de evasão da resposta imune, é a espécie Sporothrix brasiliensis. Nesse sentido, dada a ausência de estudos direcionados a está espécie, objetivou-se avaliar a importância de receptores Toll like-2 (TLR-2) e Toll like-4 (TLR-4) na infecção por S. brasiliensis. Além disso, utilizando técnicas de proteômica, procurou-se elucidar proteínas diferencialmente expressas em S. brasiliensis quando comparado à espécie S. schenckii. Para avaliação da resposta imune utilizaram-se modelos in vitro e in vivo de infecção, e para a investigação das proteínas diferencialmente expressas, utilizou-se a técnica de proteômica Bottom-up. A investigação da resposta imune in vitro mostrou a dependência dos receptores TLR-2 e TLR-4 no desencadeamento da resposta imune. Os ensaios in vivo mostraram a importância desses receptores no controle da infecção e dependência dos mesmos na produção de citocinas, principalmente nos primeiros 14 dias de infecção. Na ausência do receptor TLR-2, houve a polarização de resposta Th17 na tentativa de controle da infecção. Quando avaliadas as diferenças entre as espécies S. brasiliensis e S. schenckii, em termos de proteínas expressas, verificou-se que S. brasiliensis expressa diferencialmente 60 proteínas. Dentre essas, 9 são relatadas na literatura, como importantes na virulência e escape imunológico dos principais fungos de importância médica. Os resultados encontrados no presente trabalho permitem concluir que reconhecimento de S. brasiliensis é dependente dos receptores TLR-2 e TLR-4. Estudos que investiguem a utilização de outras vias de sinalização como mecanismos compensatórios, bem como, o sinergismo desses receptores no contexto da infecção por S. brasiliensis são fundamentais na compreensão da fisiopatologia dessa doença. No que tange a caracterização proteica, estudos com mutantes para cada uma das proteínas descritas nesse trabalho devem ser avaliados. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by dimorphic fungi of the genus Sporothrix that affects humans and animals, predominantelly felines. Inicially, Sporothrix schenckii was the only specie associated to sporotrichosis. However, after genotypic and phenotypic studies of human and animal clinical isolates, a high variability among the isolates was found and was concluded the existence of a complex: the Sporothrix Complex. Inside the Sporothrix complex, the major cause of epidemic outbreaks, justified by a greater virulence and ability to evade the immune system, is Sporothrix brasiliensis. Concerning this, the absence of studies directed to this specific specie, the aim was to evaluate the importance of Toll like receptor-2 (TLR-2) and Toll like receptor-4 (TLR-4) during S. brasiliensis infection. In addition, was look using proteomics techniques, the proteins differentially expressed in S. brasiliensis when compared to S. schenckii. To evaluate the immune response, in vitro and in vivo tecniques were used, and for the investigation of differentially expressed proteins, the Bottom-up proteomics technique was used. The investigation of the in vitro immune response showed the dependence of TLR-2 and TLR-4 receptors on phagocytosis and the production of inflammatory mediators, such as cytokines and NO. In vivo assays showed the importance of these receptors to control the infection and their dependence on cytokine production during the first 14 days of infection. In the absence of the TLR-2 receptor, the Th17 response was polarized in an attempt to control the infection. Evaluating the differences between S. brasiliensis and S. schenckii, in terms of expressed proteins, it was verified that S. brasiliensis differentially expressed 60 proteins. Among these, 9 are reported in the literature, as important in the virulence and immune evasion among the most important medical fungi. The results found in the present study allow to conclude that S. brasiliensis recognition is dependent on TLR-2 and TLR-4 receptors. Studies investigating the use of other signaling pathways as compensatory mechanisms, as well as the synergism of these receptors in the context of S. brasiliensis infection, are fundamental to understand the pathophysiology of this disease. Regarding the protein characterization, studies with mutants for each of the proteins described in this work should be evaluated.

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