Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Neste estudo, 151 isolados brasileiros de Sporothrix schenckii foram caracterizados quanto as suas características fenotípicas e genotípicas. Quanto às características fenotípicas, a maioria dos isolados apresentou conídios ovais, sendo que os de origem animal são maiores que os de origem humana (animal: 2,96 ± 1,07 versus forma linfocutânea: 2,37 ± 0,43; forma fixa: 2,33 ± 0,53). Os isolados provenientes da região Norte do Brasil são os mais termotolerantes e os isolados do Nordeste são os mais termossensíveis. Os isolados de origem animal são mais tolerantes à temperatura quando comparados com isolados obtidos de pacientes. Os isolados brasileiros apresentaram grande variabilidade genética quando avaliados por RAPD. Por Southern Blot, utilizando a enzima APA I para o estudo do polimorfismo das regiões ITS, três genótipos foram obtidos. Não houve correlação entre o perfil obtido por RAPD ou Southern Blot com a origem clínica ou geográfica dos isolados. A secreção de proteínas/glicoproteínas é variável entre os isolados, sofrendo influência direta do meio de cultura. Os isolados brasileiros avaliados são produtores das enzimas DNAse e urease, 15,78% produzem gelatinase, 26,31% produzem proteinase e 21,05% produzem caseinase. Todos os isolados avaliados toleram pressão osmótica de 16,6% de glicerol, 89,47% toleram 20% e todos são inibidos a 23% e 28,5 % de glicerol. Todos os isolados avaliados toleram pressão salina de 6% e 8%; 42,10% toleram pressão de 9% e 10% de sal e todos são inibidos a 12% de sal. Todos os isolados avaliados crescem na faixa de pH de 2,2 a 12,5. A patogenia e virulência são variáveis entre os isolados, podendo estar relacionada ao genótipo do isolado. Diferentes proteínas são reconhecidas pelos soros dos camundongos infectados, sendo a molécula de 60 kDa, a mais reconhecida neste sistema. Em relação à esporotricose humana, as moléculas de 70 kDa e 38 kDa são comumente reconhecidas por soros de pacientes com esporotricose fixa e linfocutânea. O antígeno bruto do isolado Ss 118 e a fração SsCBF são eficientes para diagnóstico da esporotricose felina através da técnica de ELISA. A fração SsCBF é capaz de elicitar resposta imune do tipo HTT em camundongos experimentalmente infectados. Em geral, os resultados indicam que os isolados brasileiros são heterogêneos, apresentando características genéticas e fenotípicas individuais, independentes de sua origem. Somente a área conidial e a tolerância a temperatura foram características fenotípicas relacionadas à origem. / In this study, we analyzed 151 Brazilian S. schenckii isolates by phenotyping and genotyping aspects. About phenotyping aspects, most of isolates showed oval conidia and the mean conidial area of S. schenckii animal isolates was greater than clinical isolates (animal: 2.96 ± 1.07 versus lymphocutaneous form: 2.37 ± 0.43; fixed form: 2.33 ± 0.53). Isolates from the Northeast region exhibited the lowest thermotolerance and the Northern isolates exhibited the highest thermotolerance. Animal isolates are better thermotolerants than clinical isolates. The Brazilian isolates showed great genetic diversity when analyzed by RAPD. By Southern blot using the endonuclease APA I to study polymorphism of ITS regions, three genotypes were obtained. There was no association between RAPD and Southern profiles with clinical forms origin or geographic origin. The protein/glycoprotein secretion was variable among isolates and was directly influenced by the medium composition. All Brazilian isolates studied produced DNAse and urease exoenzymes, 15.78% produced gelatinase, 26.31% produced proteinase and 21.05% produced caseinase. All analyzed isolates grew at 16,6% of glycerol, 89,47% grew at 20% of glycerol and all of them were inhibited at 23% and 28,5 % of glycerol. All analyzed isolates grew at 6% and 8% of NaCl, 42.10% grew at 9% and 10% of NaCl and all of them were inhibited at 12% of NaCl. All of them were able to grow at pH 2.2 to 12.5. The pathogenicity and virulence were variable among isolates and it can be related to the genotype. Different proteins were recognized by sera of infected mice and the 60 kDa molecule was the most one recognized in murine system. In relation to human sporotrichosis, 70 kDa and 38 kDa molecules were common recognized by sera from patients with fixed and lymphocutaneous sporotrichosis. The crude exoantigen of Ss 118 isolate and the SsCBF fraction are able to be used in the diagnosis of feline sporotrichosis by ELISA. The SsCBF fraction is able to elicit DTH immune response in infected mice. In general, our results indicate that Brazilian isolates are heterogeneous, which present individual phenotyping and genotyping characteristics, independent of origin. Only the conidial area and thermotolerance were related to origin. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_angelita_reis_gomes.pdf: 850060 bytes, checksum: 1f4da5ff7cd0955fa9cc9d07431a3c49 (MD5) Previous issue date: 2012-02-27 / This study aims to get to know potential risk factors for dogs and cats presenting positive pathogenic fungus culture diagnosis. A retrospective observational study on fungus infections diagnosed in dogs and cats in southern Brazil between 1980 and 2011 was performed. One thousand seven hundred and thirty-nine clinical sample records of dogs and cats a with suspicion of fungal infections from the Diagnostic and Research Center in Veterinary Mycology (MICVET) and the Regional Diagnosis Laboratory (RDL), both belonging to the Veterinary School of the Pelotas Federal University (FAVET UFPel) were analyzed. Fungal growth was detected in 52,85 % of the samples, of which 37,49 % were pathogenic-related. The winter season presented a 29,49 % pathogenic fungus diagnosis positivity; of these, 48,76 % of the samples were from female animals and 44,11 % of male, whereas 7,13 % were unidentified; also, 79,30 % of the positive samples were of dogs and 20,70 % of cats; the highest positivity rate (26,80 %) occurred in young animals up to two years old. The three most common fungus infections were malasseziosis at a 59,98 % incidence rate, dermatophytosis 18,56 % and sporotrichosis 14,26 %. The species Malassezia Pachydermatis was isolated from 100 % of malasseziosis cases, and 78,98 % malasseziosis cases were otitis-related, most of which in dogs (94,88 %). 24,49 % of dogs were up to two years old, and 54,7 % of canine cases occurred in females. Cocker Spaniel (10,24 %) and Poodle (8,89 %) were the most affected breeds. Dermatophytes were isolated in 18,56 % fungal infections, and Microsporum canis was the most commonly isolated species (57,78 % of dogs and 77,42 % of cats). Dogs presented a 74,38 % rate of cases and the one 24 month age group encompassed 56,67 % of records in dogs and 64,52 % in cats. The most affected breeds were Yorkshire Terrier (10%) and Persian (29,03 %). Sporothrix schenckii infection showed a 13,98 % rate in dogs and an 80,02 % rate in cats. Isolation occurred in 71,25 % cases in male cats; as to dogs, a significant gender-related difference was not found. The two to four year age group showed a 23,75 % occurrence rate. Crossbred animals corresponded to 82,50 % of the cases in cats and 53,85 % in dogs. These data demonstrated that most cats and dogs with fungal infections are young animals, with females showing a greater predisposition; however, no significant differences as to breed, animal fur or seasonality were found. The three most frequently isolated fungi in dogs and cats in southern Brazil were Malassezia pachydermatis, dermatophytes and Sporothrix schenckii. / O objetivo deste trabalho foi conhecer possíveis fatores de risco para cães e gatos com resultados positivos para cultura de fungos patogênicos. Foi realizado um estudo observacional de caráter retrospectivo das infecções causadas por fungos, diagnosticadas em cães e gatos na região Sul do Brasil, no período de 1980 a 2011. Foram analisados 1.739 registros de amostras clínicas de caninos e felinos com suspeitas fúngicas, provenientes dos bancos de dados do Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Micologia Veterinária (MICVET) e do Laboratório Regional de Diagnóstico (LRD), ambos da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (FAVET- UFPel). Houve crescimento fúngico em 52,85% das amostras, das quais 37,49% corresponderam ao crescimento de fungos patogênicos. O inverno 29,75% de frequência nos diagnósticos positivos para fungos patogênicos, 48,76% das amostras positivas eram de fêmeas, 44,11% machos e 7,13% não identificados, das amostras positivas 79,30 pertenciam a caninos 20,70% a felinos. A maior frequência, 26,80%, de casos positivos ocorreu em animais jovens, com até dois anos de idade. As três infecções fúngicas de maior ocorrência foram a malasseziose 59,98%, dermatofitose 18,56% e esporotricose 14,26%. Em 100% dos casos de malasseziose foi isolada a espécie Malassezia pachydermatis, em 78,98% dos casos a malasseziose era relacionada à otite, a maioria de 94,88% ocorreram em caninos. Nos caninos 20,49% tinham até dois anos de idade e 54,72% dos casos eram de fêmeas. As raças definidas Cocker Spaniel (10,24%) e Poodle (8,89%) foram as mais afetadas. O isolamento de dermatófitos ocorreu em 18,56% das infecções fúngicas, Microsporum canis foi a espécie mais isolada em caninos 57,78% e felinos 77,42%. Os caninos tiveram frequência de 74,38% dos casos e a faixa etária entre um e 24 meses teve 56,67% dos registros em caninos e 64,52% nos felinos, as raças Yorkshire Terrier 10%, e Persa 29,03% foram as mais afetadas. A infecção por Sporothrix schenckii teve frequência de 14,26%, sendo 13,98% em caninos e 86,02% em felinos. Em 71,25% o isolamento se deu em machos felinos, em caninos não houve diferença significativa relacionada ao sexo. A idade entre dois e quatro anos teve ocorrência de 23,75%. Os animais SRD corresponderam a 82,50% dos casos em felinos e 53,85% em caninos. Conclui-se que os dados gerais demonstram que a maioria de caninos e felinos com infecções fúngicas são animais jovens, com maior predisposição de fêmeas, não havendo diferença significativa para raça, comprimento do pelo e sazonalidade. Os três fungos com maior frequência de isolamentos em caninos e felinos na região sul do Rio Grande do Sul foram Malassezia pachydermatis, dermatófitos e Sporothrix schenckii.

Orientador: Iracilda Zeppone Carlos / Resumo: A esporotricose é uma micose de distribuição universal causada por fungos termodimórficos do complexo de espécies Sporothrix schenckii (S. schenckii). No Brasil, a esporotricose é considerada endêmica, sendo normalmente adquirida pela inoculação acidental do seu agente causal através da pele ou através da transmissão zoonótica por gatos infectados. As formas clínicas podem variar entre cutânea, linfocutânea e sistêmica, esta última sendo mais comumente observada em pacientes imunodeprimidos. A ineficácia do tratamento antifúngico contra esta micose, especialmente em pacientes imunocomprometidos, tem levado à busca de terapias mais eficazes e seguras. Com base em vários estudos que mostram a eficiente utilização de células dendríticas como ferramenta para o desenvolvimento de vacinas contra diferentes fungos, o objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade protetora de células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs) ativadas com as proteínas da superfície celular de S. schenckii (PSCs) em camundongos infectados com S. schenckii strictu sensu. As BMDCs foram estimuladas com PSCs e analisadas quanto à expressão superficial de moléculas co-estimulatórias, bem como à secreção de citocinas pró-inflamatórias. Posteriormente, camundongos sádios foram vacinados com uma ou duas doses de BMDCs para avaliar a sua imunogenicidade e, por último, foi avaliado o efeito das BMDCs em camundongos infectados por S. schenckii. Nossos resultados mostram que as PSCs foram capazes de ativar... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Sporotrichosis is a universally distributed mycosis caused by thermodimorphic fungi of the Sporothrix schenckii (S. schenckii) species complex. In Brazil, sporotrichosis is considered endemic and is usually acquired by accidental inoculation of its causative agent through the skin or through zoonotic transmission by infected cats. Clinical forms may vary between cutaneous, lymphocutaneous and systemic, the latter being more commonly observed in immunosuppressed patients. The ineffectiveness of antifungal treatment against this mycosis, especially in immunocompromised patients, has led to the search for more effective and safe therapies. Based on several studies showing the efficient use of dendritic cells as a tool for the development of different fungal vaccines, the aim of this work was to evaluate the protective capacity of bone marrow derived dendritic cells (BMDCs) activated with cell surface proteins of S. schenckii (ScCWP) in mice infected with S. schenckii strictu sensu. The BMDCs were stimulated with PSCs and analyzed for surface expression of costimulatory molecules and the secretion of proinflammatory cytokines. Subsequently, healthy mice were vaccinated with one or two doses of BMDCs to assess their immunogenicity, and finally the effect of BMDCs on S. schenckii infected mice was evaluated. Our results show that the ScCWPs were able to activate BMDCs. Immunization of healthy mice with ScCWPs-stimulated BMDCs induced a Th17 profile immune response, with increased T... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Sporothrix shenckii, um fungo dimórfico, termo-dependente, é encontrado na natureza associado com matéria orgânica em decomposição, como, espinhos, folhas secas, madeira e também na água. Este fungo é o agente causador da esporotricose, que ocorre com maior freqüência em pessoas que trabalham com o solo e vegetais contaminados com os esporos do fungo, sendo considerada uma doença ocupacional. A contaminação acontece com a inoculação traumática do material contaminado e em alguns casos por inalação dos esporos. Quando infecta o organismo humano, bem como outros mamíferos ou quando cultivado a 37°C, passa para a forma de levedura. É comum em áreas de clima tropical e subtropical, com alta umidade. Apresenta distribuição mundial, sendo que, atualmente no Brasil, são relatados casos em São Paulo, Rio de Janeiro e no Rio Grande do Sul. No Rio de Janeiro, a esporotricose tem sido relatada como doença endêmica, onde o agente etiológico é transmitido de gatos para homens. A esporotricose apresenta caráter crônico, polimórfico e com formação granulamatosa. As formas clínicas e a patogênese dependem do sítio de inoculação do fungo e da resposta imunológica do hospedeiro. O mecanismo de defesa e suscetibilidade do organismo, bem como a disseminação da infecção por este fungo ainda não são totalmente conhecidos. O estado de saúde do paciente contribui diretamente para o estabelecimento da doença, sendo que, alcoolismo, diabete, imunidade comprometida e uso extensivo de drogas imunosupressoras são fatores que podem predispor à infecções severas. Neste trabalho estudamos in vitro a interação do S. schenckii com macrófagos murinos. Por meio de técnicas de fagocitose, ELISA, dosagem de óxido nítrico, viabilidade de leveduras, citometria de fluxo e RT-PCR foram realizados ensaios da atividade de macrófagos. Desta forma foram gerados alguns dados para o melhor entendimento da resposta de defesa nesta doença. Nos estudos realizados, concluímos que os anticorpos gerados nos camundongos pela infecção por S. schenckii foram capazes de induzir a fagocitose do fungo. Também, após a fagocitose das leveduras pelos macrófagos, incubados com laminarina ou manana, houve inibição significativa da produção de TNF-α, indicando que os receptores dectina-l e manose, respectivamente, estão relacionados à produção desta citocina. O soro, contendo os anticorpos do animal infectado, também induziu forte produção desta citocina, mostrando que a entrada do fungo via receptor Fc pode também induzir a produção dessa citocina. Verificamos ainda que a fagocitose de leveduras, pelos macrófagos, na presença de soro de camundongo infectado, induziu alta produção de IL-10. Quando analisamos a expressão de genes presentes nos macrófagos, observamos forte expressão de TLR-2 e MyD-88, na presença das leveduras. Já a expressão de iNOS pelos macrófagos, observamos que foi maior na presença do fungo somente quando as leveduras foram incubadas com o soro, após o período de 72 horas. Em seguida, ao dosar a produção de Óxido Nítrico (NO), verificamos no período de 3 dias de incubação, que houve redução significativa na concentração de NO produzida pelos macrófagos, quando estes foram incubados com o fungo. Porém, quando as leveduras foram opsonizadas pelo soro, houve aumento da produção de NO após 72 horas de incubação. Outra verificação importante foi que os macrófagos foram capazes de destruir as leveduras fagocitadas na presença de soro. / Sporothrix schenckii is a dimorfic fungus, term-dependent, find in nature associated with organic material at decomposition, like thorns, wheat leaves, wood and water. This is the fungi agent that causes sporothricosis, which happens with more frequency with people that work with land and green, contaminated with mold of fungus. That is why it is considered a occupational disease. The contamination happens with traumatic inoculation of material and some cases with inhalation of mold. When a human is infected, as well as other mammals or when cultivate at 37°C, it tums into the yeast form. Is common at tropical and moisture weather areas. Is found all around the world, and nowadays at Brazil, with cases related São Paulo, Rio de Janeiro and Rio Grande do Sul. At Rio de Janeiro, sporothricosis are related like endemic disease, where the etiologic agent is transmitted by cats to men. Sporothricosis is a chronic, polimorfic disease, and with form granulamatosa. The clinical type and the pathogenesis depend on the way of inoculation and the response of immunological system of the host. The defense and suscebility of the organism, as dissemination of infection with this fungi is not yet totally known. The patient\'s health state contributes directly to the disease, as much as alcoholism, diabetes and immunity deficiency and the extensive use of immunosuppressive drugs are factors that can bring to harder infection. Here, we studied in vitro the interaction of S. schenckii with murine macrophages. Using phagocytosis assay, ELISA, dosage of oxide nitric, CFU assay, flow citometry and RT-PCR were analysed activity of macrophages. We produced some results in order to better understand the response of defense with this disease. In the present study, we conclude that antibodies generated in mice by infection with S. schenckii were capable to promote phagocytosis of fungus. Also, when macrophages and yeast were incubated with laminarin or mannan, we had significant decrease in production of TNF-α, showing that receptors dectin-l and manose, respectively, are related with production this cytokine. The antibodies of mice infected with S. schenckii, also produced hard level this cytokine showing that entrance of fungus by receptor Fc can produce TNF- α. Besides, we verify that phagocitosys of yeast, with sera of infected mice, induct hard production of IL-10. When we analysed the expression of genes of macrophages, we observed hard expression of TLR-2 and MyD-88, when yeast were present. However, the expression of iNOS by macrophages, was more hard with yeast only when sera was present, before 72 hours. Similarly, when yeast were opsonized by sera, we had increase of production of NO after 72 hours of incubation. After, macrophage were capable to destruct yeast phagocyted when sera was present.

A esporotricose é uma micose subcutânea causada por espécies do complexo Sporothrix schenckii que acomete seres humanos e animais, principalmente os gatos. Desde 1998 o Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas/Fiocruz no Rio de Janeiro vem acompanhando uma epidemia dessa doença envolvendo seres humanos, cães e gatos, onde as principais formas de transmissão são arranhadura, mordedura e/ou contato com o exsudato das lesões cutâneas de gatos doentes. O diagnóstico definitivo da esporotricose felina é obtido a partir do isolamento do Sporothrix sp. em meios de cultura, entretanto, o resultado desse exame pode demorar até quatro semanas, o que em algumas situações pode retardar o início do tratamento antifúngico. Os exames citopatológico, histológico e imuno-histoquímico são opções viáveis e mais rápidas para o diagnóstico dessa micose em gatos, principalmente em situações quando não é possível realizar o isolamento fúngico. O diagnóstico precoce da esporotricose felina é importante na implementação rápida do tratamento antifúngico, melhorando o prognóstico na maioria dos casos. O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar as diferentes técnicas utilizadas no diagnóstico da esporotricose felina antes e durante o tratamento antifúngico. Na primeira etapa do estudo foram comparados os exames citopatológico (coloração pelo método panótico rápido), histológico (impregnação pela prata de Grocott) e imuno-histoquímico de 184 gatos no diagnóstico da esporotricose sem tratamento antifúngico prévio utilizando o cultivo fúngico como teste padrão de referência. Estruturas leveduriformes foram observadas em 160 (87,0%) casos no exame citopatológico, 168 (91,3%) na histopatologia e 163 (88,3%) na imunohistoquímica. A associação das três técnicas elevou a sensibilidade do diagnóstico para 98,3%, o que enfatiza a necessidade de sua implementação como ferramentas de rotina, sobretudo quando a cultura fúngica não está disponível. Na etapa seguinte, a carga parasitária e o isolamento de Sporothrix sp. das lesões cutâneas de 74 gatos foram avaliados mensalmente antes e durante o tratamento com itraconazol por um período de 12 semanas. A mediana da carga fúngica observada antes do início do tratamento antifúngico foi maior (pMW = 0,013) nos gatos nos quais foi observada a persistência da lesão (Med=98,6) em relação aqueles em que houve cicatrização (Med=15,0). A redução da carga fúngica ocorreu em todas as lesões estudadas, assim como a redução da positividade da cultura fúngica e do exame citopatológico. Estes resultados sugerem uma redução no potencial zoonótico dos gatos, enfatizando a importância do tratamento precoce como medida de controle. Adicionalmente, o isolamento do fungo e a presença de estruturas leveduriformes nas lesões de gatos com esporotricose podem ser fatores preditores da falência terapêutica, indicando a necessidade da implementação de alternativas terapêuticas. / Sporotrichosis is subcutaneous mycose caused by species of fungus from the Sporothrix schenckii complex and affects humans and animals, especially cats. Since 1998, the Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas/Fiocruz in Rio de Janeiro has been describing in Rio de Janeiro an epidemic of sporotrichosis, involving humans, cats and dogs, with most of cases related to transmission through scratches, bites or contact with lesions from infected cats. The definitive diagnosis is based on the isolation of the fungus in culture; however, the results may take up to four weeks and postpone treatment outset. The cytopathology, histopathology and immunohistochemistry should be considered as rapid and accessible alternatives for the diagnosis in cats, especially when the fungal culture is not available. The early diagnosis of feline sporotrichosis is desirable for the prompt beginning of the antifungal treatment, improving the prognosis in most of the cases. The aim of this study was to evaluate and compare different techniques for the diagnosis of feline sporotrichosis before and during the treatment with itraconazol. In the first part of the study, cytopathological (Quick Panoptic), histopathological (Grocott silver stain) and immunohistochemical examinations were compared regarding the diagnosis of sporotrichosis in 184 cats without previous treatment, by using fungal culture as a reference standard. The yeast-like cells were observed in 160 (87.0%) cases by cytopathological examination, in 168 (91.3%) by histopathology and in 163 (88.3%) by immunohistochemistry. The combination of the three methods led to the diagnosis of 98.3% of cases, pointing to the need of their implementation as regular tools, notably when fungal culture is not available. In the second part of the study, the fungal burden and the isolation of Sporothrix sp. in cutaneous lesions of 74 cats were monthly evaluated before and during the treatment with itraconazole for twelve weeks. The median of the fungal load detected before the outse of the antifungal treatment was higher (pMW=0.013) in cats in which there was a persistence of the cutaneous lesion (Med=98.6) in comparison to those in which healing of the lesion was observed (Med=15.0). The decrease of the fungal burden occurred in all the lesions in this study as well as the reduction of the positivity of the fungal culture and the cytopathological examination. These results suggest a reduction in the zoonotic potential of cats and emphasize the importance of the early treatment as a control measure. In addition, the isolation of the fungus and the presence of yeast-like cells in lesions of cats with sporotrichosis during the treatment can be a predictor of treatment failure and should alert for the need of alternative therapeutic regimens.

Sporothrix shenckii, um fungo dimórfico, termo-dependente, é encontrado na natureza associado com matéria orgânica em decomposição, como, espinhos, folhas secas, madeira e também na água. Este fungo é o agente causador da esporotricose, que ocorre com maior freqüência em pessoas que trabalham com o solo e vegetais contaminados com os esporos do fungo, sendo considerada uma doença ocupacional. A contaminação acontece com a inoculação traumática do material contaminado e em alguns casos por inalação dos esporos. Quando infecta o organismo humano, bem como outros mamíferos ou quando cultivado a 37°C, passa para a forma de levedura. É comum em áreas de clima tropical e subtropical, com alta umidade. Apresenta distribuição mundial, sendo que, atualmente no Brasil, são relatados casos em São Paulo, Rio de Janeiro e no Rio Grande do Sul. No Rio de Janeiro, a esporotricose tem sido relatada como doença endêmica, onde o agente etiológico é transmitido de gatos para homens. A esporotricose apresenta caráter crônico, polimórfico e com formação granulamatosa. As formas clínicas e a patogênese dependem do sítio de inoculação do fungo e da resposta imunológica do hospedeiro. O mecanismo de defesa e suscetibilidade do organismo, bem como a disseminação da infecção por este fungo ainda não são totalmente conhecidos. O estado de saúde do paciente contribui diretamente para o estabelecimento da doença, sendo que, alcoolismo, diabete, imunidade comprometida e uso extensivo de drogas imunosupressoras são fatores que podem predispor à infecções severas. Neste trabalho estudamos in vitro a interação do S. schenckii com macrófagos murinos. Por meio de técnicas de fagocitose, ELISA, dosagem de óxido nítrico, viabilidade de leveduras, citometria de fluxo e RT-PCR foram realizados ensaios da atividade de macrófagos. Desta forma foram gerados alguns dados para o melhor entendimento da resposta de defesa nesta doença. Nos estudos realizados, concluímos que os anticorpos gerados nos camundongos pela infecção por S. schenckii foram capazes de induzir a fagocitose do fungo. Também, após a fagocitose das leveduras pelos macrófagos, incubados com laminarina ou manana, houve inibição significativa da produção de TNF-α, indicando que os receptores dectina-l e manose, respectivamente, estão relacionados à produção desta citocina. O soro, contendo os anticorpos do animal infectado, também induziu forte produção desta citocina, mostrando que a entrada do fungo via receptor Fc pode também induzir a produção dessa citocina. Verificamos ainda que a fagocitose de leveduras, pelos macrófagos, na presença de soro de camundongo infectado, induziu alta produção de IL-10. Quando analisamos a expressão de genes presentes nos macrófagos, observamos forte expressão de TLR-2 e MyD-88, na presença das leveduras. Já a expressão de iNOS pelos macrófagos, observamos que foi maior na presença do fungo somente quando as leveduras foram incubadas com o soro, após o período de 72 horas. Em seguida, ao dosar a produção de Óxido Nítrico (NO), verificamos no período de 3 dias de incubação, que houve redução significativa na concentração de NO produzida pelos macrófagos, quando estes foram incubados com o fungo. Porém, quando as leveduras foram opsonizadas pelo soro, houve aumento da produção de NO após 72 horas de incubação. Outra verificação importante foi que os macrófagos foram capazes de destruir as leveduras fagocitadas na presença de soro. / Sporothrix schenckii is a dimorfic fungus, term-dependent, find in nature associated with organic material at decomposition, like thorns, wheat leaves, wood and water. This is the fungi agent that causes sporothricosis, which happens with more frequency with people that work with land and green, contaminated with mold of fungus. That is why it is considered a occupational disease. The contamination happens with traumatic inoculation of material and some cases with inhalation of mold. When a human is infected, as well as other mammals or when cultivate at 37°C, it tums into the yeast form. Is common at tropical and moisture weather areas. Is found all around the world, and nowadays at Brazil, with cases related São Paulo, Rio de Janeiro and Rio Grande do Sul. At Rio de Janeiro, sporothricosis are related like endemic disease, where the etiologic agent is transmitted by cats to men. Sporothricosis is a chronic, polimorfic disease, and with form granulamatosa. The clinical type and the pathogenesis depend on the way of inoculation and the response of immunological system of the host. The defense and suscebility of the organism, as dissemination of infection with this fungi is not yet totally known. The patient\'s health state contributes directly to the disease, as much as alcoholism, diabetes and immunity deficiency and the extensive use of immunosuppressive drugs are factors that can bring to harder infection. Here, we studied in vitro the interaction of S. schenckii with murine macrophages. Using phagocytosis assay, ELISA, dosage of oxide nitric, CFU assay, flow citometry and RT-PCR were analysed activity of macrophages. We produced some results in order to better understand the response of defense with this disease. In the present study, we conclude that antibodies generated in mice by infection with S. schenckii were capable to promote phagocytosis of fungus. Also, when macrophages and yeast were incubated with laminarin or mannan, we had significant decrease in production of TNF-α, showing that receptors dectin-l and manose, respectively, are related with production this cytokine. The antibodies of mice infected with S. schenckii, also produced hard level this cytokine showing that entrance of fungus by receptor Fc can produce TNF- α. Besides, we verify that phagocitosys of yeast, with sera of infected mice, induct hard production of IL-10. When we analysed the expression of genes of macrophages, we observed hard expression of TLR-2 and MyD-88, when yeast were present. However, the expression of iNOS by macrophages, was more hard with yeast only when sera was present, before 72 hours. Similarly, when yeast were opsonized by sera, we had increase of production of NO after 72 hours of incubation. After, macrophage were capable to destruct yeast phagocyted when sera was present.

A esporotricose é uma micose subcutânea causada por espécies do complexo Sporothrix schenckii que acomete seres humanos e animais, principalmente os gatos. Desde 1998 o Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas/Fiocruz no Rio de Janeiro vem acompanhando uma epidemia dessa doença envolvendo seres humanos, cães e gatos, onde as principais formas de transmissão são arranhadura, mordedura e/ou contato com o exsudato das lesões cutâneas de gatos doentes. O diagnóstico definitivo da esporotricose felina é obtido a partir do isolamento do Sporothrix sp. em meios de cultura, entretanto, o resultado desse exame pode demorar até quatro semanas, o que em algumas situações pode retardar o início do tratamento antifúngico. Os exames citopatológico, histológico e imuno-histoquímico são opções viáveis e mais rápidas para o diagnóstico dessa micose em gatos, principalmente em situações quando não é possível realizar o isolamento fúngico. O diagnóstico precoce da esporotricose felina é importante na implementação rápida do tratamento antifúngico, melhorando o prognóstico na maioria dos casos. O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar as diferentes técnicas utilizadas no diagnóstico da esporotricose felina antes e durante o tratamento antifúngico. Na primeira etapa do estudo foram comparados os exames citopatológico (coloração pelo método panótico rápido), histológico (impregnação pela prata de Grocott) e imuno-histoquímico de 184 gatos no diagnóstico da esporotricose sem tratamento antifúngico prévio utilizando o cultivo fúngico como teste padrão de referência. Estruturas leveduriformes foram observadas em 160 (87,0%) casos no exame citopatológico, 168 (91,3%) na histopatologia e 163 (88,3%) na imunohistoquímica. A associação das três técnicas elevou a sensibilidade do diagnóstico para 98,3%, o que enfatiza a necessidade de sua implementação como ferramentas de rotina, sobretudo quando a cultura fúngica não está disponível. Na etapa seguinte, a carga parasitária e o isolamento de Sporothrix sp. das lesões cutâneas de 74 gatos foram avaliados mensalmente antes e durante o tratamento com itraconazol por um período de 12 semanas. A mediana da carga fúngica observada antes do início do tratamento antifúngico foi maior (pMW = 0,013) nos gatos nos quais foi observada a persistência da lesão (Med=98,6) em relação aqueles em que houve cicatrização (Med=15,0). A redução da carga fúngica ocorreu em todas as lesões estudadas, assim como a redução da positividade da cultura fúngica e do exame citopatológico. Estes resultados sugerem uma redução no potencial zoonótico dos gatos, enfatizando a importância do tratamento precoce como medida de controle. Adicionalmente, o isolamento do fungo e a presença de estruturas leveduriformes nas lesões de gatos com esporotricose podem ser fatores preditores da falência terapêutica, indicando a necessidade da implementação de alternativas terapêuticas. / Sporotrichosis is subcutaneous mycose caused by species of fungus from the Sporothrix schenckii complex and affects humans and animals, especially cats. Since 1998, the Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas/Fiocruz in Rio de Janeiro has been describing in Rio de Janeiro an epidemic of sporotrichosis, involving humans, cats and dogs, with most of cases related to transmission through scratches, bites or contact with lesions from infected cats. The definitive diagnosis is based on the isolation of the fungus in culture; however, the results may take up to four weeks and postpone treatment outset. The cytopathology, histopathology and immunohistochemistry should be considered as rapid and accessible alternatives for the diagnosis in cats, especially when the fungal culture is not available. The early diagnosis of feline sporotrichosis is desirable for the prompt beginning of the antifungal treatment, improving the prognosis in most of the cases. The aim of this study was to evaluate and compare different techniques for the diagnosis of feline sporotrichosis before and during the treatment with itraconazol. In the first part of the study, cytopathological (Quick Panoptic), histopathological (Grocott silver stain) and immunohistochemical examinations were compared regarding the diagnosis of sporotrichosis in 184 cats without previous treatment, by using fungal culture as a reference standard. The yeast-like cells were observed in 160 (87.0%) cases by cytopathological examination, in 168 (91.3%) by histopathology and in 163 (88.3%) by immunohistochemistry. The combination of the three methods led to the diagnosis of 98.3% of cases, pointing to the need of their implementation as regular tools, notably when fungal culture is not available. In the second part of the study, the fungal burden and the isolation of Sporothrix sp. in cutaneous lesions of 74 cats were monthly evaluated before and during the treatment with itraconazole for twelve weeks. The median of the fungal load detected before the outse of the antifungal treatment was higher (pMW=0.013) in cats in which there was a persistence of the cutaneous lesion (Med=98.6) in comparison to those in which healing of the lesion was observed (Med=15.0). The decrease of the fungal burden occurred in all the lesions in this study as well as the reduction of the positivity of the fungal culture and the cytopathological examination. These results suggest a reduction in the zoonotic potential of cats and emphasize the importance of the early treatment as a control measure. In addition, the isolation of the fungus and the presence of yeast-like cells in lesions of cats with sporotrichosis during the treatment can be a predictor of treatment failure and should alert for the need of alternative therapeutic regimens.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-23Bitstream added on 2014-06-13T20:55:08Z : No. of bitstreams: 1 ferreira_ls_me_arafcf.pdf: 537259 bytes, checksum: 4756eac4f37ae0739a8b59e969ac32a1 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A esporotricose é uma micose de distribuição universal cujo agente é o fungo termodimórfico Sporothrix schenckii. A forma mais comum da doença é a linfocutânea, que compromete pele, tecido subcutâneo e gânglios linfáticos regionais. Os principais constituintes da parede celular de S. schenckii são compostos peptídeo-polissacarídicos contendo ramnose, manose e galactose. Estes compostos se arranjam na parede celular de modo a formar duas subcamadas distintas na forma leveduriforme do fungo, uma das quais, a mais interna e fixa delas, é denominada como peptídeo-polissacarídeo da parede celular (PPC) e foi utilizada como antígeno neste estudo, juntamente com a levedura termo-inativada (SSTI). Os antígenos liberados pelo fungo participam diretamente do processo de escape do sistema imune e também servem como alvos para a eliminação do mesmo por anticorpos ou ligação a receptores presentes em células da imunidade inata, como os macrófagos. Nossos resultados mostraram que o PPC induz citocinas de padrão inflamatório de forma mais pronunciada que o SSTI, que por sua vez induziu maior liberação de IL-10. Sugerimos também que no modelo experimental utilizado a IL-10 não atua provocando supressão da resposta proliferativa dos esplenócitos, e que a IL-4 atua apenas na fase de resolução da infecção, não sendo induzida como forma de escape imunológico pelo fungo. Também mostramos que os antígenos testados são capazes de induzir a liberação de IL-17 em culturas de esplenócitos, num perfil semelhante àquela das citocinas Th1 / Sporotrichosis is a micotic infection of universal distribution, which is caused by dimorphic fungus Sporothrix schenckii. It usually happens as a lymphocutaneous disease, compromising skin, subcutaneous tissues and regional lymphatic nodules. Major constituents of S. schenckii cell wall are peptido-polysaccharide complexes containing rhamnose, mannose and galactose. These complexes are organized in two distinct layers in the fungus yeast cell wall, of which the inner one is called cell wall peptido-polysaccharide (PPC), being used as antigen in this study, along with the heat-killed yeast (SSTI). Antigens released by the fungus directly participate in evasion of the immune system, also serving as targets for fungus elimination by binding of antibodies or innate immune cells like macrophages. Our results showed that PPC induces inflammatory cytokines in a more pronounced way when compared to SSTI, which induced higher levels of IL-10. We also suggest that, in the animal model used, IL-10 doesn’t act as a suppressor of splenocyte proliferative response, and that IL-4 play a role at the resolution phase of the infection, being not induced as a means of immunologic escape by the fungus. Also, we showed that the assayed antigens are capable of inducing IL-17 secretion in splenocyte cultures, in a fashion close to that of Th1 cytokines

A esporotricose é uma micose subcutânea causada por espécies do complexo Sporothrix schenckii que acomete seres humanos e animais, principalmente os gatos. Desde 1998 o Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas/Fiocruz no Rio de Janeiro vem acompanhando uma epidemia dessa doença envolvendo seres humanos, cães e gatos, onde as principais formas de transmissão são arranhadura, mordedura e/ou contato com o exsudato das lesões cutâneas de gatos doentes. O diagnóstico definitivo da esporotricose felina é obtido a partir do isolamento do Sporothrix sp. em meios de cultura, entretanto, o resultado desse exame pode demorar até quatro semanas, o que em algumas situações pode retardar o início do tratamento antifúngico. Os exames citopatológico, histológico e imuno-histoquímico são opções viáveis e mais rápidas para o diagnóstico dessa micose em gatos, principalmente em situações quando não é possível realizar o isolamento fúngico. O diagnóstico precoce da esporotricose felina é importante na implementação rápida do tratamento antifúngico, melhorando o prognóstico na maioria dos casos. O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar as diferentes técnicas utilizadas no diagnóstico da esporotricose felina antes e durante o tratamento antifúngico. Na primeira etapa do estudo foram comparados os exames citopatológico (coloração pelo método panótico rápido), histológico (impregnação pela prata de Grocott) e imuno-histoquímico de 184 gatos no diagnóstico da esporotricose sem tratamento antifúngico prévio utilizando o cultivo fúngico como teste padrão de referência. Estruturas leveduriformes foram observadas em 160 (87,0%) casos no exame citopatológico, 168 (91,3%) na histopatologia e 163 (88,3%) na imunohistoquímica. A associação das três técnicas elevou a sensibilidade do diagnóstico para 98,3%, o que enfatiza a necessidade de sua implementação como ferramentas de rotina, sobretudo quando a cultura fúngica não está disponível. Na etapa seguinte, a carga parasitária e o isolamento de Sporothrix sp. das lesões cutâneas de 74 gatos foram avaliados mensalmente antes e durante o tratamento com itraconazol por um período de 12 semanas. A mediana da carga fúngica observada antes do início do tratamento antifúngico foi maior (pMW = 0,013) nos gatos nos quais foi observada a persistência da lesão (Med=98,6) em relação aqueles em que houve cicatrização (Med=15,0). A redução da carga fúngica ocorreu em todas as lesões estudadas, assim como a redução da positividade da cultura fúngica e do exame citopatológico. Estes resultados sugerem uma redução no potencial zoonótico dos gatos, enfatizando a importância do tratamento precoce como medida de controle. Adicionalmente, o isolamento do fungo e a presença de estruturas leveduriformes nas lesões de gatos com esporotricose podem ser fatores preditores da falência terapêutica, indicando a necessidade da implementação de alternativas terapêuticas. / Sporotrichosis is subcutaneous mycose caused by species of fungus from the Sporothrix schenckii complex and affects humans and animals, especially cats. Since 1998, the Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas/Fiocruz in Rio de Janeiro has been describing in Rio de Janeiro an epidemic of sporotrichosis, involving humans, cats and dogs, with most of cases related to transmission through scratches, bites or contact with lesions from infected cats. The definitive diagnosis is based on the isolation of the fungus in culture; however, the results may take up to four weeks and postpone treatment outset. The cytopathology, histopathology and immunohistochemistry should be considered as rapid and accessible alternatives for the diagnosis in cats, especially when the fungal culture is not available. The early diagnosis of feline sporotrichosis is desirable for the prompt beginning of the antifungal treatment, improving the prognosis in most of the cases. The aim of this study was to evaluate and compare different techniques for the diagnosis of feline sporotrichosis before and during the treatment with itraconazol. In the first part of the study, cytopathological (Quick Panoptic), histopathological (Grocott silver stain) and immunohistochemical examinations were compared regarding the diagnosis of sporotrichosis in 184 cats without previous treatment, by using fungal culture as a reference standard. The yeast-like cells were observed in 160 (87.0%) cases by cytopathological examination, in 168 (91.3%) by histopathology and in 163 (88.3%) by immunohistochemistry. The combination of the three methods led to the diagnosis of 98.3% of cases, pointing to the need of their implementation as regular tools, notably when fungal culture is not available. In the second part of the study, the fungal burden and the isolation of Sporothrix sp. in cutaneous lesions of 74 cats were monthly evaluated before and during the treatment with itraconazole for twelve weeks. The median of the fungal load detected before the outse of the antifungal treatment was higher (pMW=0.013) in cats in which there was a persistence of the cutaneous lesion (Med=98.6) in comparison to those in which healing of the lesion was observed (Med=15.0). The decrease of the fungal burden occurred in all the lesions in this study as well as the reduction of the positivity of the fungal culture and the cytopathological examination. These results suggest a reduction in the zoonotic potential of cats and emphasize the importance of the early treatment as a control measure. In addition, the isolation of the fungus and the presence of yeast-like cells in lesions of cats with sporotrichosis during the treatment can be a predictor of treatment failure and should alert for the need of alternative therapeutic regimens.

Sporothrix schenckii, the causative agent of sporotrichosis, is a relatively rare infection. Local infection usually occurs through direct inoculation of the organism through the skin; disseminated disease is rarely seen. This article describes a case of disseminated sporotrichosis in a middle-aged man without the commonly seen risk factors for dissemination.