Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica, que envolve o tecido cutâneo e subcutâneo, e que pode afetar seres humanos e animais. Esta micose sempre foi atribuída a um único patógeno, o Sporothrix schenckii, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, nos últimos anos, foi demonstrado que isolados identificados como S. schenckii apresentavam grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies. Esta doença é causada pela implantação traumática do patógeno fúngico, porém, os mecanismos de invasão e disseminação deste microorganismo, bem como as moléculas envolvidas nestes processos, ainda são pouco conhecidos. Com base nessas informações, este trabalho visa identificar moléculas de superfície deste patógeno envolvidas na interação deste fungo com proteínas matriciais, bem como analisar diferenças fenotípicas entre espécies do denominado complexo Sporothrix. Foram utilizados, neste estudo, cinco isolados de Sporothrix spp., sendo três isolados clínicos, um isolado ambiental e um isolado de gato. A virulência de cada isolado foi comparada à capacidade adesiva à proteína matricial fibronectina. Foi observado que os isolados com maior capacidade infectiva eram os que apresentavam maior capacidade adesiva à fibronectina. Verificamos então a expressão de adesinas para fibronectina na superfície de cada isolado, por Western blot, e observamos que os isolados mais virulentos e com maior capacidade adesiva expressavam mais adesinas para fibronectina. Bandas reativas com o anticorpo monoclonal contra adesina gp70 (mAb P6E7) foram reveladas nos extratos de parede celular dos isolados estudados. Análises por microscopia confocal revelaram a co-localização da gp70 com a adesina para fibronectina na superfície dos isolados. Análises filogenéticas demonstraram que os isolados estudados possuíam diferenças genotípicas capazes de agrupá-los em duas espécies, S. schenckii e S. brasiliensis. Esta análise revelou que o isolado avirulento era S. brasiliensis e não S. schenckii, como se pensava. Este dado novo nos levou a verificar se a virulência e as características fenotípicas estariam relacionadas ao genótipo. A avaliação da virulência mostrou que outro isolado de S. brasiliensis era tão virulento quanto os isolados de S. schenckii. Além disso, as características morfológicas, como tamanho, forma e perfil de crescimento, das fases miceliana e leveduriforme, e características microscópicas da parede das leveduras também foram avaliadas. Porém, não foi possível correlacionar, de forma clara, a morfologia celular com a especiação do gênero Sporothrix. A expressão da gp70 na superfície das duas espécies foi verificada e foi observado que o isolado virulento de S. brasiliensis quase não expressa a gp70 na sua superfície em contraste com o isolado avirulento de S. brasiliensis, que além de expressar esta glicoproteína em grande quantidade ainda a libera para o meio extracelular. Este estudo mostra que há uma correlação direta entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre características fenotípicas e genótipo. / Sporotrichosis is a chronic and infectious disease that involves the cutaneous and subcutaneous tissue, which can affect humans and animals. This mycosis has always been attributed to a single pathogen, the Sporothrix schenckii, a dimorphic fungus, that grows as yeast at 37 C and as mycelia at room temperature. However, in recent years, some isolates identified as S. schenckii showed considerable genetic variability, suggesting that this taxon consists of a complex of species. This disease is caused by the traumatic inoculation of the fungal pathogen, however, the molecules involved in the invasion and dissemination of this microorganism are still poorly understood. The aim of this study is to identify surface molecules involved in the interaction of this fungus with extracellular matrix proteins and to examine phenotypic differences between species in the Sporothrix complex. Five isolates were used throughout this study, three clinical isolates, an environmental and one cat isolate. The virulence of each isolate was compared to the adhesive capacity to fibronectin. We observed that the most virulent isolates exhibited the higher capacity to interact with fibronectin. The expression of adhesins for fibronectin on the surface of each isolate was verified by Western blot. This analysis showed that the most virulent isolates expressed more fibronectin adhesins than the avirulent ones. Positive bands for the monoclonal antibody raised against gp70 adhesin (mAb P6E7) were revealed in cell wall extracts of the isolates studied. Confocal microscopy confirmed the colocalization of fibronectin and mAb P6E7 on the yeast cell surface. Molecular analysis showed genotypic differences between isolates used in this study, that can cluster than them into two species, S. schenckii and S. brasiliensis. This phylogenetic analysis revealed that the avirulent isolate was S. brasiliensis and not S. schenckii as previously thought. This new data led us to determine whether the virulence and phenotypic characteristics were related to genotype. The virulence analysis showed that another S. brasiliensis isolate was as virulent as the S. schenckii isolates. Moreover, morphological characteristics, such as, size, shape and growth profile of mycelial and yeast were also evaluated. However, no connection was observed between cell morphology with the speciation of the genus Sporothrix. The cell wall expression of gp70 was evaluated in the twou species. We observed that the virulent isolate of S. brasiliensis almost do not express gp70 in contrast with the avirulent isolate of the same specie. This study shows that there is a direct correlation between virulence and adhesins expression, however, no relationship between genotype and phenotypic characteristics was observed.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis that affects humans and animals, and it is caused by dimorphic melanized fungi belonging to the genus Sporothrix. Sporotrichosis is mainly acquired by traumatic implantation of the fungus into the dermis through scratches inflicted by domestic animals or by handling plants. This study approaches: a) the in vitro susceptibility of Sporothrix schenckii complex species to photodynamic inactivation using methylene blue as a photosensitizer and laser as the light source; b) the combination of amphotericin B plus posaconazole in a murine model of systemic infection by S. brasiliensis and S. schenckii sensu stricto, seeking to enhance the treatment of disseminated sporotrichosis; c) the interference of fungal melanin in the in vitro susceptibility of S. brasiliensis and S. schenckii sensu stricto to amphotericin B and itraconazole. In the photodynamic therapy study we have applied methylene blue as a photosensitizing agent and Light emitting diode (InGaAlP) against Sporothrix schenckii complex species in an in vitro assay. The viability of the conidia was determined through the counting of colony forming units. The activity of amphotericin B and posaconazole alone or in combination was evaluated by using a microdilution checkerboard method. For the in vivo study, OF-1 mice were intravenously (i.v.) infected with a lethal inoculum of 2 x 107 CFU/animal. Two strains of S. brasiliensis and two of S. schenckii were tested. Animals received amphotericin i.v. at suboptimal dose i.e., 0.3 mg/kg, in combination with oral posaconazole at 2.5 mg/kg, 5 mg/kg or 10 mg/kg BID. Results were compared with their respective monotherapies and efficacy was evaluated by prolongation of survival and reduction of tissue burden in spleen and liver. In the study of the interference of melanin in the susceptibility of S. brasiliensis and S. schenckii sensu stricto, yeast cells were cultivated in minimal medium with or without L-DOPA in order to induce the production of melanin. Microdilution and time-kill methods were used to determine the antifungal activity against yeast cells with different amounts of melanin. The laser light (InGaAlP) together with a methylene blue photosensitizer were able to significantly reduce the growth of all the tested Sporothrix strains. In vitro data demonstrated a synergistic effect of the combination and although posaconazole alone was effective against sporotrichosis, efficacy was increased when combined with amphotericin B. The maximum efficacy of the combinations was obtained with posaconazole 5 mg/kg. The killing assay showed that melanization protected isolates within the Sporothrix schenckii complex from amphotericin B, particularly in the lower concentrations tested. The conclusions of the present study are: a) the in vitro inhibition of Sporothrix spp. isolates by laser light deserves in vivo experimental and clinical studies since it may be a promising treatment for cutaneous and subcutaneous sporotrichosis; b) posaconazole in combination with suboptimal doses of amphotericin B could be an option in the treatment of disseminated sporotrichosis especially when itraconazole or amphotericin B at optimal doses are contraindicated; c) combination studies of amphotericin B with inhibitors of melanin are required in order to avoid this effect. / A esporotricose é uma micose subcutânea que afeta homens e animais, e é causada por fungos dimórficos melanizados pertencentes ao gênero Sporothrix. Pode ser principalmente adquirida por implantação traumática do fungo na derme através da arranhadura de animais domésticos ou manipulação de plantas contaminadas. O presente estudo investigou: a) a suscetibilidade in vitro de espécies do Complexo Sporothrix schenckii à inativação fotodinâmica; b) a combinação de anfotericina B e posaconazol em modelo murino de infecção sistêmica por S. brasiliensis e S. schenckii stricto sensu, buscando melhorar o tratamento da esporotricosse disseminada; c) a interferência da melanina fúngica na suscetibilidade in vitro de S. brasiliensis e S. schenckii stricto sensu à anfotericina B e itraconazol. No estudo da terapia fotodinâmica foi aplicado azul de metileno como fotossensibilizador e emissão de luz diiodo (InGaAlP) frente espécies do complexo Sporothrix schenckii em ensaio in vitro. A viabilidade dos conídios foi determinada através de contagem de unidades formadoras de colônia (UFC). A atividade da anfotericina B e posaconazol sozinhos ou combinados foi avaliada segundo a técnica de microdiluição em caldo e técnica de checkerboard. No estudo in vivo, camundongos OF-1 foram infectados com um inóculo de 2 x 107 UFC/animal. Foram utilizadas duas cepas de S. brasiliensis e duas cepas de S. schenckii. Os animais receberam doses de 0.3 mg/kg de anfotericina B em combinação com 2.5 mg/kg e 5 mg/kg de posaconazol. Os resultados foram comparados com as respectivas monoterapias e a eficácia foi avaliada através do prolongamento da sobrevivência e redução da carga fúngica no fígado e baço. No estudo da interferência da melanina na suscetibilidade de S. brasiliensis e S. schenckii stricto sensu à anfotericina B e itraconazol, células leveduriformes foram cultivadas em meio mínimo com e sem L-DOPA. Métodos de microdiluição e tempo de morte foram utilizados para determinar a atividade dos antifúngicos frente às células com diferentes quantidades de melanina. A luz laser (InGaAlP) em conjunto com o azul de metileno foram capazes de reduzir significativamente o crescimento de todas as cepas de Sporothrix testadas. Os dados in vitro demonstraram um efeito sinérgico da combinação de posaconazol e anfotericina B, e, apesar de o posaconazol 5 mg/kg sozinho apresentar eficácia contra a esporotricose, teve sua eficiência aumentada quando combinado com anfotericina B 0,3 mg/kg. A técnica de tempo de morte mostrou que a melanização protegeu os isolados do complexo Sporothrix schenckii da anfotericina B, particularmente na concentração mais baixa testada. Desta forma, as conclusões do presente estudo são: a) a inibição fotodinâmica in vitro de isolados de Sporothrix merece estudos experimentais e clínicos, uma vez que pode ser um tratamento promissor para a esporotricose cutânea e subcutânea; b) o posaconazol em combinação com dose baixa de anfotericina B pode ser uma opção para o tratamento de esporotricose disseminada, especialmente quando itraconazol e anfotericina B são contraindicados; c) estudos de combinação de anfotericina B com inibidores de melanina são necessários a fim de evitar o efeito protetor da melanina contra as defesas do organismo e contra antifúngicos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sporotricosis is an acute or subacute mycotic infection caused by the Sporothrix complex species. The disease was already described in humans and in several animal species, mostly in cats, horses and dogs. Based on several outbreak reports in the literature, the species more predominant in cats of the Southeast and South regions of Brazil is S. brasiliensis. The transmission to humans include the occupational and the zoonotic forms. The presentation form more often seen in cats is multiple skin and mucosal lesions. The diagnostic methods include the isolation and identification of the agente in culture, the histopathology, the cytology, the intradermal sporotrichin test, the immunohistochemistry technique, and the polymerase chain reaction (PCR). The histopathological diagnosis is based on the morphological characteristics of the fungus and the respective inflammatory reaction. The main objectives of this retrospective study were to characterize the histomorphological and histochemical aspects of sporotrichosis in 10 cats, and also to evaluate epidemiological and clinical aspects, and gross findings obtained from the biopsy and necropsy protocols of the archives of the Laboratório de Patologia Veterinária of the Universidade Federal de Santa Maria. The disease affected mostly male mongrel cats, and was mostly observed in the cutaneous disseminated form. Gross lesions were characterized by cutaneous nodules (ulcerated or not) and by ulcerated masses or plaques. By histopathology, there were a relationship between the fungal load and two patterns of inflammatory response. The first pattern was characterized by high fungal load, and most yeasts were inside of numerous macrophages with abundant, many times vacuolated cytoplasm. The amount of neutrophils ranged from mild to moderate in this pattern. The second pattern was characterized by numerous epiteliod cells and many neutrophils. The fungal load was low and most yeasts were observed in the extracellular space. The yeasts were round, oval or cigar-shaped. Several histochemical techniques, such as Grocott s silver stain, periodic Schiff acid, and Alcian blue were utilized and they made it easier to visualize, to characterize the morphology, and to quantify the organisms. The Giemsa stain allowed visualizing the agent, but it not allowed to sharply highlight them from other intralesional components. Organisms were negative for melanin granules through the Fontana-Masson stain in all cases. The histomorphological and histochemical study allowed demonstrating determinant fungal characteristics to the establishment of the diagnosis by means of this diagnostic tool. / Esporotricose é uma infecção fúngica subaguda ou crônica, causada por espécies do complexo Sporothrix. A doença já foi descrita em humanos e em diversas espécies animais, mas ocorre com maior frequência em gatos, cavalos e cães. Baseado em vários relatos de surtos na literatura, a espécie mais predominante em gatos das regiões Sul e Sudeste do Brasil é S. brasiliensis. As formas de transmissão para humanos incluem a ocupacional e a zoonótica. A forma de apresentação mais frequente em gatos é de múltiplas lesões de pele e mucosas. Os métodos de diagnóstico compreendem o isolamento e identificação do agente em cultura, a histopatologia, a citologia, o teste intradérmico da esporotriquina, a técnica de imuno-histoquímica (IHQ) e a reação em cadeia de polimerase (PCR). O diagnóstico histopatológico é realizado observando-se as características morfológicas do fungo e a respectiva reação inflamatória. Os principais objetivos deste estudo retrospectivo foram caracterizar os aspectos histomorfológicos e histoquímicos da esporotricose em 10 gatos, além de avaliar os aspectos epidemiológicos, clínicos e os achados macroscópicos obtidos dos protocolos de biópsias e necropsias dos arquivos do Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Santa Maria. A doença afetou predominantemente gatos machos, sem raça definida e na forma cutânea disseminada. As lesões macroscópicas caracterizaram-se como nódulos cutâneos (ulcerados ou não) e como massas e placas ulceradas. Na histopatologia observou-se uma relação entre a quantidade de leveduras observada e dois padrões de resposta inflamatória. O primeiro padrão caracterizou-se por numerosas leveduras encontradas, na sua maioria, no interior de numerosos macrófagos com citoplasma abundante e muitas vezes vacuolizado. A quantidade de neutrófilos variava de leve a moderada e havia infiltrado geralmente leve de linfócitos e plasmócitos. O segundo padrão caracterizava-se por leve quantidade de leveduras observadas geralmente livres no espaço extracelular, numerosas células epitelioides e infiltrado predominantemente acentuado de neutrófilos. As leveduras eram redondas, ovais ou alongadas (em forma de charuto). Foram utilizadas várias técnicas histoquímicas como a impregnação pela prata de Grocott, ácido periódico de Schiff e azul Alciano que facilitaram a visualização, caracterização da morfologia e quantificação dos organismos. A coloração de Giemsa permitiu a visualização do agente, porém não permitiu destacá-los dos debris celulares. Os organismos foram negativos para grânulos de melanina pela coloração de Fontana-Masson em todos os casos. O estudo histomorfológico e histoquímico permitiu demonstrar características fúngicas determinantes para o estabelecimento do diagnóstico de esporotricose através dessa ferramenta diagnóstica.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica, que envolve o tecido cutâneo e subcutâneo, e que pode afetar seres humanos e animais. Esta micose sempre foi atribuída a um único patógeno, o Sporothrix schenckii, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, nos últimos anos, foi demonstrado que isolados identificados como S. schenckii apresentavam grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies. Esta doença é causada pela implantação traumática do patógeno fúngico, porém, os mecanismos de invasão e disseminação deste microorganismo, bem como as moléculas envolvidas nestes processos, ainda são pouco conhecidos. Com base nessas informações, este trabalho visa identificar moléculas de superfície deste patógeno envolvidas na interação deste fungo com proteínas matriciais, bem como analisar diferenças fenotípicas entre espécies do denominado complexo Sporothrix. Foram utilizados, neste estudo, cinco isolados de Sporothrix spp., sendo três isolados clínicos, um isolado ambiental e um isolado de gato. A virulência de cada isolado foi comparada à capacidade adesiva à proteína matricial fibronectina. Foi observado que os isolados com maior capacidade infectiva eram os que apresentavam maior capacidade adesiva à fibronectina. Verificamos então a expressão de adesinas para fibronectina na superfície de cada isolado, por Western blot, e observamos que os isolados mais virulentos e com maior capacidade adesiva expressavam mais adesinas para fibronectina. Bandas reativas com o anticorpo monoclonal contra adesina gp70 (mAb P6E7) foram reveladas nos extratos de parede celular dos isolados estudados. Análises por microscopia confocal revelaram a co-localização da gp70 com a adesina para fibronectina na superfície dos isolados. Análises filogenéticas demonstraram que os isolados estudados possuíam diferenças genotípicas capazes de agrupá-los em duas espécies, S. schenckii e S. brasiliensis. Esta análise revelou que o isolado avirulento era S. brasiliensis e não S. schenckii, como se pensava. Este dado novo nos levou a verificar se a virulência e as características fenotípicas estariam relacionadas ao genótipo. A avaliação da virulência mostrou que outro isolado de S. brasiliensis era tão virulento quanto os isolados de S. schenckii. Além disso, as características morfológicas, como tamanho, forma e perfil de crescimento, das fases miceliana e leveduriforme, e características microscópicas da parede das leveduras também foram avaliadas. Porém, não foi possível correlacionar, de forma clara, a morfologia celular com a especiação do gênero Sporothrix. A expressão da gp70 na superfície das duas espécies foi verificada e foi observado que o isolado virulento de S. brasiliensis quase não expressa a gp70 na sua superfície em contraste com o isolado avirulento de S. brasiliensis, que além de expressar esta glicoproteína em grande quantidade ainda a libera para o meio extracelular. Este estudo mostra que há uma correlação direta entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre características fenotípicas e genótipo. / Sporotrichosis is a chronic and infectious disease that involves the cutaneous and subcutaneous tissue, which can affect humans and animals. This mycosis has always been attributed to a single pathogen, the Sporothrix schenckii, a dimorphic fungus, that grows as yeast at 37 C and as mycelia at room temperature. However, in recent years, some isolates identified as S. schenckii showed considerable genetic variability, suggesting that this taxon consists of a complex of species. This disease is caused by the traumatic inoculation of the fungal pathogen, however, the molecules involved in the invasion and dissemination of this microorganism are still poorly understood. The aim of this study is to identify surface molecules involved in the interaction of this fungus with extracellular matrix proteins and to examine phenotypic differences between species in the Sporothrix complex. Five isolates were used throughout this study, three clinical isolates, an environmental and one cat isolate. The virulence of each isolate was compared to the adhesive capacity to fibronectin. We observed that the most virulent isolates exhibited the higher capacity to interact with fibronectin. The expression of adhesins for fibronectin on the surface of each isolate was verified by Western blot. This analysis showed that the most virulent isolates expressed more fibronectin adhesins than the avirulent ones. Positive bands for the monoclonal antibody raised against gp70 adhesin (mAb P6E7) were revealed in cell wall extracts of the isolates studied. Confocal microscopy confirmed the colocalization of fibronectin and mAb P6E7 on the yeast cell surface. Molecular analysis showed genotypic differences between isolates used in this study, that can cluster than them into two species, S. schenckii and S. brasiliensis. This phylogenetic analysis revealed that the avirulent isolate was S. brasiliensis and not S. schenckii as previously thought. This new data led us to determine whether the virulence and phenotypic characteristics were related to genotype. The virulence analysis showed that another S. brasiliensis isolate was as virulent as the S. schenckii isolates. Moreover, morphological characteristics, such as, size, shape and growth profile of mycelial and yeast were also evaluated. However, no connection was observed between cell morphology with the speciation of the genus Sporothrix. The cell wall expression of gp70 was evaluated in the twou species. We observed that the virulent isolate of S. brasiliensis almost do not express gp70 in contrast with the avirulent isolate of the same specie. This study shows that there is a direct correlation between virulence and adhesins expression, however, no relationship between genotype and phenotypic characteristics was observed.

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