Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-04T14:34:21Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3127119 bytes, checksum: 5c890bb880fcbd5cc7d5f5f36f11e4f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-04T14:34:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3127119 bytes, checksum: 5c890bb880fcbd5cc7d5f5f36f11e4f1 (MD5) Previous issue date: 2017-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Treatment with antimonials has several limitations, among them the progressive emergence of parasites resistant to these drugs. In this situation, recent evidence suggests that the parameters antimonial resistance and virulence may be correlated in Leishmania sp. have been published in the literature. In this context, this work aimed to investigate whether there is a correlation between virulence and resistance to trivalent antimonial (SbIII) from two clinical isolates of Leishmania (Viannia) braziliensis, named AF and JCTS. Promastigote forms of these parasites resistant to SbIII were selected, obtaining cultures with a resistance level corresponding to 14 and 13 times the wild-type IC50 (sensitive to SbIII) for the isolates AF and JCTS, respectively. When analyzing the stability of the phenotype of acquired resistance, it was verified that both clinical isolates presented an unstable profile, with progressive reversion of resistance after successive passages in drug absence. In morphological analysis, it was observed that two cultures resistant to SbIII presented higher amount of promastigote forms with metacyclic characteristics when compared to sensitive cultures. However, the growth in culture medium was similar for sensitive and resistant cultures of both clinical isolates. In stationary phase of growth, the percentage of serum that caused 50% of cellular lysis (EC50) of the AF culture sensitive to SbIII was 2.3%, whereas the corresponding drug resistant culture presented EC50 9.4%. Similarly, the sensitive and SbIII resistant JCTS cultures showed EC50 2.5% and 18.4%, respectively. Thus, cultures resistant to SbIII from both clinical isolates were more resistant to complement-mediated lysis than drug-sensitive cultures SbIII resistant cultures also showed greater in vitro virulence on murine macrophages when compared to the corresponding sensitive cultures. The infection rate determined for sensitive and resistant SbIII AF was 260 and 593. For sensitive and resistant SbIII JCTS was 115 and 207, respectively. In the model of infection in vivo in swiss mice, no significant virulence was evident in any culture of L. braziliensis. Thus, we conclude that there is a correlation between parameters of in vitro virulence and resistance to SbIII in L. braziliensis. / O tratamento com os antimoniais possui várias limitações, dentre elas o crescente surgimento de parasitos resistentes a estas drogas. Agravando esta situação, recentes evidências de que os parâmetros resistência a antimoniais e virulência possam estar correlacionados em Leishmania sp. têm sido publicadas na literatura. Dentro deste contexto, este trabalho objetivou investigar se existe correlação entre os parâmetros de virulência e resistência ao antimonial trivalente (SbIII) a partir de dois isolados clínicos de Leishmania (Viannia) braziliensis denominados AF e JCTS. Foram selecionadas formas promastigotas destes parasitos resistentes ao SbIII, obtendo-se culturas com um nível de resistência correspondente a 14 e 13 vezes a IC50 da cultura selvagem (sensível ao SbIII) para os isolados AF e JCTS, respectivamente. Ao analisar a estabilidade do fenótipo de resistência adquirido, verificou-se que ambos os isolados clínicos apresentaram um perfil instável, com progressiva reversão da resistência após sucessivos repiques na ausência da droga. Em análise morfológica, foi possível observar que as duas culturas resistentes ao SbIII apresentaram maior quantidade de formas promastigotas com características de metacíclicas quando comparado com as culturas sensíveis. Contudo, o perfil de crescimento em meio de cultivo foi semelhante para as culturas sensíveis e resistentes de ambos os isolados clínicos. Em fase estacionária de crescimento, a porcentagem de soro que causou 50% de lise celular (EC50) da cultura AF sensível ao SbIII foi de 2,3%, enquanto que a correspondente cultura resistente à droga apresentou EC50 de 9,4%. De modo semelhante, as culturas JCTS sensível e resistente ao SbIII apresentaram EC50 de 2,5% e 18,4%, respectivamente. Assim, as culturas resistentes ao SbIII, de ambos os isolados clínicos, foram mais resistentes à lise mediada pelo sistema complemento do que as culturas sensíveis à droga. As culturas resistentes ao SbIII também apresentaram maior virulência in vitro sobre macrófagos murinos quando comparadas às correspondentes culturas sensíveis. O índice de infecção determinado para AF sensível e resistente ao SbIII foi de 260 e 593. Para JCTS sensível e resistente ao SbIII foi de 115 e 207, respectivamente. No modelo de infecção in vivo em camundongos suíços não foi evidenciada virulência significativa em nenhuma das culturas de L. braziliensis. Dessa forma, conclui-se que há uma correlação entre parâmetros de virulência in vitro e resistência ao SbIII em L. braziliensis.

Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-08T12:54:48Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1516121 bytes, checksum: 772d5ba3351de06ed346dc46430f7188 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-08T12:54:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1516121 bytes, checksum: 772d5ba3351de06ed346dc46430f7188 (MD5) Previous issue date: 2016-03-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The first-line drugs in Brazil for leishimaniasis treatment is the pentavalent antimonial, considered a prodrug because it is converted in trivalent (SbIII) during the treatment which presents many limitations, including the rising of the resistant parasite. Seeking to understand of these resistance effects in Leishmania (L.) amazonensis, promastigotes forms were cultured in glowing concentrations of SbIII then 2 mutants were selected, SbIII 1 and SbIII2 that gain resistance, respectively, 15,8 and 22,5 times bigger than wild cultures'. The morphological analysis show significant diferences in mutant's form and size when compared with the wild ones, once it has a long and slender cell body and with a long flagellum, while the majority mutants, with a resistance level 6,42 (SbIII 1) and 5,62 (SbIII 2) times bigger, presented a rounded cell body, with long flagellum. Curiously, when the mutants obtain a resistance level 15,8 (SbIII 1) e 22,5 (SbIII 2) times bigger, the morphological diference diminishes. The resistance phenotype to the SbIII manifested itself also in the amastigote like derived of both mutants. The SbIII 2 mutant presented a more stable profile of resistance than SbIII 1 one's when cultured in the absence of the drug, which denote diferences in the resistance mechanism. There was not observed cross-resistance to Amphotericin B. The promastigote forms of both mutants showed theirselves significantly more resistant to lysis throught the complement system, compared to the wild one's, sugesting that the parameter to the resistance to the antimonials and virulance might be correlated in Leishmania (L.) amazonensis. / A droga de primeira escolha para o tratamento das leishmanioses no Brasil é um antimonial pentavalente, considerado uma pró-droga por ser convertido na forma trivalente (SbIII) durante o tratamento, o qual apresenta várias limitações, incluindo o crescente surgimento de parasitos resistentes. Buscando compreender os efeitos desta resistência em Leishmania (L.) amazonensis, formas promastigotas foram cultivadas em concentrações crescentes de SbIII e selecionados dois mutantes, SbIII 1 e SbIII 2, que adquiriram, respectivamente, um nível de resistência 15,8 e 22,5 vezes maior que o apresentado pelas culturas selvagens. A análise morfológica mostrou diferenças significantivas no tamanho e formato dos mutantes em relação ao tipo selvagem, visto que estas apresentaram corpo celular alongado, delgado e com flagelo longo, enquanto que a maioria dos mutantes, com um nível de resistência 6,42 (SbIII 1) e 5,62 (SbIII 2) vezes maior, apresentaram um corpo celular arredondado, com flagelo alongado. Curiosamente, quando os mutantes adquiriram um nível de resistência 15,8 (SbIII 1) e 22,5 (SbIII 2) vezes maior, esta diferença morfológica diminuiu. O fenótipo de resistência ao SbIII se manifestou também nas formas amastigotas axênicas derivadas dos dois mutantes. O mutante SbIII 2 apresentou um perfil de resistência mais estável que o SbIII 1 quando cultivado na ausência da droga, o que pode indicar diferenças nos mecanismos de resistência. Não foi observada resistência cruzada com o fármaco Anfotericina B. As formas promastigotas dos dois mutantes mostraram-se significativamente mais resistentes à lise pelo sistema complemento, comparado aos selvagens, sugerindo que os parâmetros resistência a antimoniais e virulência podem estar correlacionados em Leishmania (L.) amazonensis.