Los virus de RNA de cadena positiva conforman el grupo más numeroso y diverso de los patógenos virales de las plantas. Se replican mediante un mecanismo en el que la RNA polimerasa RNA dependiente viral, junto con otras proteínas virales y del huésped, sintetizan un intermediario de polaridad complementaria (o negativa), que a la vez sirve de molde para la síntesis del RNA genómico de polaridad positiva. Este mecanismo puede seguir un modelo geométrico o de stamping machine (Sardanyés et al. 2009). Por otro lado, las rutas de silenciamiento de RNA en plantas desempeñan un papel muy importante en la regulación de los procesos de desarrollo, mantenimiento de la estructura cromosómica y mecanismos de defensa contra virus patógenos (Matzke y Matzke, 2004). Los microRNA (miRNAs) son una clase de pequeños RNAs (sRNAs) endógenos que se producen en el núcleo a partir de transcritos precursores (pre-miRNA) en forma de horquilla, por la acción, en plantas, de Dicer 1 (DCL1). Los miRNAs maduros (21 nt) son cargados por RISC y dirigen la degradación de mRNAs endógenos que contienen una secuencia diana complementaria, regulando así su concentración. Para oponerse al silenciamiento de RNA antiviral, en la mayoría de virus de plantas y algunos virus animales han evolucionado proteínas supresoras del silenciamiento que interfieren en pasos clave de la ruta de los pequeños RNAs interferentes (siRNA): directamente secuestrando los siRNAs, inhibiendo su producción o previniendo su diseminación por el huésped a corta o larga distancia (Li y Ding, 2006). Recientemente se ha desarrollado una nueva estrategia para producir plantas resistentes a virus basada en las rutas de silenciamiento de RNA. Consiste en expresar en plantas transgénicas miRNAs artificiales (amiRNAs) dirigidos contra secuencias específicas de los virus sobre los que se desea resistencia (Niu et al., 2006). Plantas de Arabidopsis thaliana transgénicas que expresan amiRNAs en los que se ha sustituido en el pre-amiRNA la secuencia de 21 nt del miR159 maduro, por diferentes secuencias complementarias a distintas regiones del genoma de un potyvirus (Riechmann et al., 1992. Urcuqui-Inchima et al., 2001) como el virus del mosaico del nabo (TuMV) han resultado ser resistentes a este virus en ensayos de laboratorio (Niu et al., 2006). El estudio de los aspectos moleculares de la resistencia mediada por microRNAs artificiales durante la complejidad de la infección viral puede permitir la mejora en el diseño de esta estrategia de resistencia desde el punto de vista de robustez, especificidad, durabilidad y seguridad medioambiental. Sobre todo porque los virus de RNA presentan una elevada tasa de mutación (Duffy et al., 2008) y linajes evolutivos independientes de TuMV son capaces de romper la resistencia mediada por un amiRNA, debido a la aparición de alelos mutantes que evaden el reconocimiento del miRNA artificial (Lafforgue et al., 2011). / Martínez García, F. (2014). Análisis de la dinámica de replicación de un virus de RNA de plantas y del uso de microRNAs artificiales como estrategia antiviral [Tesis doctoral]. Editorial Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/35447 / Premios Extraordinarios de tesis doctorales

Les virus d'origine alimentaire, comme le virus de l'hépatite A (VHA) et le norovirus (NoV), sont des causes importantes d'infections virales. Chaque année, celles-ci déduisent de grandes sommes monétaires aux systèmes de santé canadiens ainsi qu'aux producteurs alimentaires, sans compter les pertes alimentaires et économiques dues aux rappels d'aliments contaminés. Les stratégies de contrôle conventionnelles ne sont pas suffisamment efficaces et présentent, dans certains cas, des risques pour les travailleurs et/ou pour les consommateurs. Il est donc essentiel d'offrir de nouvelles méthodes d'inactivation naturelles et plus sécuritaires. Les produits issus de bleuet et de canneberge ont le potentiel de devenir ces nouvelles méthodes, notamment par leur concentration forte en polyphénols. De plus, ils sont naturels et sécuritaires pour les travailleurs et les consommateurs. Sans oublier qu'ils sont abondants au Québec, et, de ce fait, à moindres coûts. Le potentiel antiviral de ces produits de bleuet et de canneberge a été étudié et analysé dans ce mémoire envers des virus nus d'origine alimentaire (VHA et NVM-1) en plus de tester un modèle de virus enveloppé, soit le virus de l'herpès simplex de type 1 (HSV-1). NVM-1 et VHS-1 ont été complètement inactivés à l'aide de jus de canneberge et/ou de bleuet (concentrés à 50 %) en 5 minutes de pré-incubation cellulaire ou virale respectivement. VHA a subi une réduction de 3,70 ± 0,54 log ufp/mL à la suite d'une pré-incubation virale de 90 minutes. / Foodborne viruses like the hepatitis A virus (HAV) and the norovirus (NoV) are known as important cause of viral infections. Each year, they cost massive amount to the Canadian health-care systems and to the producers without counting the important food loss due to recalls. The conventional methods are not sufficient and can represent in some case a threat to the worker or to the consumer, which is why it is essential to uncover new inactivation methods that are safer and natural, like berries. The blueberry and cranberry products have the potential to become these new methods considering their interesting composition. Furthermore, they are natural, do not show signs of threat to the worker nor to the consumer and above all they are abundant in Québec and at low cost. The antiviral potential of these products from blueberries and cranberries have been tested and studied in this memoir against the HAV and the MNV-1, naked foodborne viruses as well as against the herpes simplex virus type 1 (HSV-1), an enveloped model. The infectivity of MNV-1 was neutralized completely in the presence of this host cells at 37 °C in as little as 5 min of contact with cranberry or blueberry juices (50 % concentration). HSV-1 was also completely neutralized in viral pre-incubation with the same juice concentration and incubation. HAV infectious titer fell 3.70 ± 0.54 log pfu/mL after 90 minutes of contact with cranberry juice. These results suggest that cranberry and blueberry processing could be useful for reducing the transmission of foodborne viruses.

À l'échelle mondiale, le norovirus humain (HuNoV) et le virus de l'hépatite A (VHA) sont associés aux maladies d'origine alimentaire, ce qui constitue une préoccupation majeure pour le secteur de la santé et de l'alimentation. Afin de garantir la salubrité des aliments et des produits transformés en industrie agroalimentaire, plusieurs méthodes d'inactivation virale physiques et chimiques sont employées. Cependant, elles ne sont pas nécessairement applicables sur toutes les matrices alimentaires et certaines peuvent même générer des substances nocives. De ce fait, la présente étude porte sur la détermination du potentiel virucide des substances naturelles. Dans cette étude, le potentiel antiviral de deux huiles essentielles et de quatre extraits naturels a été évalué sur deux virus non enveloppés, soit le norovirus murin 1 (MNV-1), le VHA et un virus enveloppé, le virus de l'herpès simplex 1 (VHS-1). Des concentrations de chaque substance allant de 50 à 200 000 ppm ont été appliquées pendant 90 min de contact. L'extrait de pépins de raisin a été le plus efficace quant à la réduction de l'infectivité du VHA et du MNV-1 soit de 1,94 ± 0,17 log₁₀, 2,85 ± 0,44 log₁₀ respectivement. Pour le VHS-1, une inactivation totale a été observée à 1000 ppm. En revanche, les extraits de canneberge et de thé vert n'ont pas réussi à réduire l'infectivité des trois types de virus de plus de 1 log₁₀. Ces résultats enrichissent les connaissances actuelles sur les propriétés virucides des substances naturelles en démontrant leur potentiel antiviral contre ces trois types de virus. Cette étude ouvre de nouvelles perspectives quant à l'utilisation des composés naturelles, offrant ainsi des applications prometteuses dans divers secteurs / Enteric viruses such as hepatitis A (HAV) and human norovirus (HuNoV) are the main cause of foodborne diseases worldwide. They are recognized as a major concern for public health and food sector. To minimise the risk of infection, many physical and chemical viral inactivation methods have been used. However, these approaches are not applicable to all food matrices and may generate harmful substances. Therefore, the aim of this project is to study the antiviral potential of natural compounds. For this purpose, the antiviral potential of two essential oils and four natural extracts was evaluated with two non-enveloped viruses: murine norovirus 1 (MNV-1), HAV and one enveloped virus, herpes simplex virus 1 (HSV-1) at concentrations ranging from 50 to 200,000 ppm for 90 min contact in viral pre-incubation. Grape seed extract was the most effective in reducing HAV and MNV-1 infectivity by 1.94±0.17 log10, 2.85±0.44 log₁₀ respectively. For HSV-1, a total inactivation was observed at 1000 ppm. Cranberry extract and green tea extract failed to reduce the infectivity of all three virus types by more than 1 log₁₀. This study has contributed to a better understanding of the antiviral potential of natural substances against the three types of viruses tested. Eventually, this project ultimately aims to reveal new perspectives on the use of natural compounds, thus offering promising applications in various sectors.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina el efecto antiviral de los extractos del tegumento de Pattalus mollis sobre Rotavirus Humano Tipo A (RVH). Se realiza una evaluación citotóxica de los tres tipos de extractos del tegumento, siendo el de pepsina (PPe) el único que presenta toxicidad nula a partir de dosis de 2500 μg/mL. Para determinar el efecto de acción antiviral ejercido por el PPe durante diferentes tiempos de infección de RVH, se aplica el PPe mediante pre tratamiento y post tratamiento antes de la inoculación, mostrando el primero una buena actividad con un porcentaje de inhibición mayor a 99,9%, una CE50 de 96,39 μg/mL y un índice de selectividad (IS) de 280,55; a diferencia del segundo que muestra una nula actividad antiviral. Por otro se evalúa el efecto de acción antiviral ejercido por el PPe en las etapa de fusión viral de RVH mediante la aplicación en conjunto del RVH con el PPe y como control antiviral se usa Ribavirina, mostrando el PPe una buena actividad antiviral mediante la aplicación conjunta, presentando un porcentaje de inhibición mayor de 99,9 %, una CE50 de 64,29 μg/mL y un IS de 420,63 a diferencia de la Ribavirina, la cual presenta un IS de 212,98. El estudio provee un mejor entendimiento sobre actividad antiviral de extractos de tegumento de Pattalus mollis sobre virus sin envoltura y específicamente nos permite concluir que el PPe de Pattalus mollis representa una alternativa prometedora como terapia antiviral contra RVH. / Tesis

La thèse a été réalisée en cotutelle entre le Centre de biophysique moléculaire, CNRS UPR 4301, conventionné avec l'Université d'Orléans et l'Université TUM de Munich.<br />La gelée royale est produite dans les glandes des abeilles nourricières Apis mellifera par digestion partielle de pollen et de nectar. La gelée royale joue un rôle clé dans la reproduction, la croissance, l'immunité et l'organisation sociale des abeilles. Elle constitue également une source potentielle de nombreuses molécules à vocation pharmaceutique.<br />Le candidat a analysé des gelées royales d'origines botaniques et géographiques bien définies. Des fractions de peptides et de protéines ont été isolées à l'aide de multiples techniques physico-chimiques. Ces fractions se sont avérées présenter des propriétés antimicrobiennes. Le candidat a également examiné les possibilités d'application pharmaceutique des fractions de gelée royale qu'il a isolées.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / Cette étude visait à caractériser la croissance, la capacité photosynthétique, la concentration en azote et protéines totales solubles, la production de protéines recombinantes (HA) ainsi que la quantité de lumière interceptée à différents stades de développement de plants de Nicotiana benthamiana afin d’optimiser la production de vaccins. L’évolution des réponses physiologiques étudiées fut similaire chez toutes les feuilles primaires, suggérant que le processus de sénescence s’initie et progresse de façon semblable indépendamment de leur ordre d’initiation. Toutefois, la superposition des patrons temporels de sénescence et de croissance foliaire a mené à un rendement HA maximal se situant invariablement dans la partie médiane du plant lorsqu’exprimé sur une base foliaire. À l’échelle du plant entier, nos résultats suggèrent qu’il est possible d’augmenter la production de vaccins en récoltant les plants à un stade de développement plus tardif, ou en augmentant la densité de culture et en récoltant ces plants plus tôt. / Nicotiana benthamiana is a wild relative of tobacco increasingly used as a plant protein expression platform to produce recombinant vaccine antigens against the influenza virus. Investigation on the physiological determinants of this production is essential to optimize and regulate vaccines production following a new flu outbreak. We examined the photosynthetic photon flux density, growth, light-saturated photosynthesis, total soluble protein, nitrogen content and recombinant protein production at different phenological stages. The similar evolution of the studied physiological responses suggested that the senescence process is initiated and progresses in a similar way in all primary leaves, regardless of the order of initiation. In contrast, the superposition of the time pattern of senescence with that of leaf growth shows that maximal HA yield expressed on a leaf basis is invariably located in the middle part of the plant. At the whole plant scale, our results suggest that it is possible to increase the production of antigens by harvesting plants at a later developmental stage, or by increasing plant density and harvesting these plants earlier.

[EN] 1 - Background The Hepatitis C Virus, represents an important epidemiological problem that chronically infects the 2% of the world's population. In Spain, Chronic Hepatitis C is the leading cause of liver cirrhosis, hepatocellular carcinoma, and liver transplantation, so it is estimated that there are 688,000 adults with Anti-HCV antibodies and 472,000 adults RNA-HCV positive. The new Direct-acting Antiviral Agents of second generation, combined between them get success rates in more than 90%, and avoid the development of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Also, the duration of treatment is shorter and they have lower rate of side effects, but are facing big challenges like their high price that makes its access very limited, and the possible viral resistance. 2. Objective We hypothesized that the price of these drugs is higher than the costs avoided by its use. So this thesis focuses on the study of hospital costs of chronic hepatitis C in Valencian Community to determine the price of these drugs. 3. Methods Using data from 2013 (which is the latest available), we conducted a cross-sectional study, in which the population of the study are all patients in the Valencian Community diagnosed with chronic hepatitis C divided into three groups. We have obtained the information of hospital costs, from the Information and Statistics Area on Health Care Activity of the General Department Health Information and Innovation, the Ministry of Health, Social Services and Equality of Madrid, which have the statistical exploitation of Minimum Basic Data Set at hospital discharge. 4. Results During 2013, there have been 1,108 episodes of hospital admissions due to complications of chronic hepatitis C, corresponding to 879 patients, with a readmission rate of 26 %, and 3,378 episodes associated with comorbidity by this disease. The hospital costs during 2013 by complications of chronic hepatitis C was EUR 7,930,630.90, of which EUR 6,801,206.09 corresponding to cirrhosis and EUR 1,129,424.81 to hepatocellular carcinoma. The cost for comorbidity was EUR 1,458,866.09. The aggregate cost of complications and comorbidities in 2013 was EUR 9,364,356.33, which capitalized to 2015 is EUR 9,707,887.74. The survival of patients since the decompensated cirrhosis starts until they die, we have calculated with a Markov model, and is 4 years, during which patients require hospitalization. With these data the current price of a full treatment with direct-acting antiviral second generation, to treat 6,932 patients, that is the population of Valencian Community according the Strategic Plan for addressing hepatitis C, should be EUR 5,601.78, which is reduced to EUR 5,209.65 for an estimated Direct-acting Antiviral Agents efficacy of 93%. 5. Discussion To complete the costs avoided by these drugs, to this cost avoided in public hospitals that we have obtained from rigorous and objective data, we add estimates of costs avoided in private hospitals, cost avoided by previous treatments and outpatient costs of annual reviews. 6. Conclusions Our results indicate that the cost of a course of treatment with Direct-acting Antiviral Agents of second generation, for a susceptible population to be treated between 6,932 (F2-F4) and 10,393 patients (F0-F4), should be placed between EUR 13,870.16, and EUR 9,251.22 respectively. Our study suggests that it is possible to determine the price of these drugs with a quantification of the direct and indirect costs avoided, although is needed additional evaluation related with outpatient costs and indirect costs caused by this disease. Key Words: Chronic hepatitis C, health economics, hospital costs, Direct-acting Antiviral Agents of second generation, value based pricing. / [ES] 1. Introducción El virus de la hepatitis C, representa un importante problema epidemiológico ya que infecta crónicamente al 2% de la población mundial. En España, la Hepatitis Crónica C es la principal causa de cirrosis hepática, de carcinoma hepatocelular, y de trasplante hepático, de forma que se calcula que existen 688.000 adultos con anticuerpos Anti-VHC y 472.000 adultos con viremia RNA-VHC. Los antivirales acción directa de segunda generación, combinados entre si consiguen tasas de éxito terapéutico en más del 90% de los casos, y evitan la amenaza vital que supone esta enfermedad por el desarrollo de cirrosis y de carcinoma hepatocelular. Además de su mayor tasa de eficacia, superan al tratamiento anterior por su menor duración y sus menores efectos secundarios, pero se enfrentan a grandes retos, como su precio elevado, y la posible resistencia viral futura. 2. Hipótesis y objetivos Planteamos la hipótesis de que el elevado precio de estos fármacos es superior a los costes que evitan, por lo que nuestra investigación se centra en el estudio del coste hospitalario de la Hepatitis crónica C en la Comunidad Valenciana, para determinar su precio. 3. Metodología Con datos del año 2013 (que es el último disponible), realizamos un estudio transversal, en el que la población del estudio la constituyen todos los pacientes de la Comunidad Valenciana diagnosticados de hepatitis crónica C, que dividimos en tres grupos. La información de costes hospitalarios, la hemos obtenido del Área de Información y Estadísticas de Actividad Sanitaria de la Subdirección General de Información Sanitaria e Innovación, del Ministerio Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad de Madrid, que disponen de la explotación estadística del Conjunto Mínimo Básico de Datos. 4. Resultados Durante el año 2013, se han producido 1.108 episodios de ingresos hospitalarios debidos a complicaciones evolutivas de la hepatitis crònica C, que corresponden a 879 pacientes, con una tasa de reingresos del 26%, y 3.378 episodios asociados a comorbilidad por esta enfermedad. El coste hospitalario durante el 2013 por complicaciones evolutivas de la hepatitis crónica C fue de 7.930.630,90 EUR, de los que 6.801.206,09 EUR corresponden a cirrosis y 1.129.424,81 EUR a carcinoma hepatocelular. El coste por comorbilidad fue de 1.458.866.09 EUR. La suma del coste de complicaciones y comorbilidad en el 2013 fue de 9.364.356,33 EUR, que capitalizado a 2015 es de 9.707.887,74 EUR. La supervivencia de los pacientes desde que se inicia la descompensación de su cirrosis hasta que fallecen, la hemos calculado con un modelo de Markov, y es de 4 años, durante los cuales los pacientes requieren ingresos hospitalarios. Con estos datos el precio actual de un tratamiento completo con antivirales de acción directa de segunda generación, para tratar a 6.932 pacientes, que es la población de la Comunidad Valenciana según los criterios actuales contenidos en el Plan Estratégico para el abordaje de la Hepatitis C, debería ser de 5.601,78 EUR, que se reduce a 5.209,65 EUR para una eficacia estimada de los antivirales del 93%. 5. Discusión Para completar los costes evitados por estos fármacos, al coste evitado en hospitales públicos que hemos obtenido de forma rigurosa y objetiva, añadimos estimaciones de costes evitados en hospitales privados, de costes evitados por tratamientos previos y de costes ambulatorios de revisiones anuales. 6. Conclusiones Añadiendo las estimaciones descritas, nuestros resultados indican que el coste de un tratamiento completo con antivirales de acción directa de segunda generación, para una población susceptible de ser tratada entre 6.932 (F2-F4) y 10.393 pacientes (F0-F4), debería situarse entre los 13.870,16 EUR, y los 9.251,22 EUR respectivamente. Nuestro estudio sugiere que es posible determinar el precio de estos fármacos con una cuantificación de los costes directos e indirectos evitados. / [CA] 1. Introducció El virus dela hepatitis C, representa un important problema epidemiològic ja que infecta crònicament al 2% de la població mundial. A Espanya, l'Hepatitis Crònica C és la principal causa de cirrosi hepàtica, de carcinoma hepatocel·lular, i de trasplantament hepàtic, de manera que es calcula que hi ha 688.000 adults amb anticossos anti-VHC i 472.000 adults amb virèmia RNA-VHC. Els antivirals de acció directa de segona generació, combinats entre si aconsegueixen taxes d'èxit terapèutic en més del 90% dels casos, i eviten l'amenaça vital que suposa aquesta malaltia pel desenvolupament de CH i CHC. A més de la seva major taxa d'eficàcia, superen al tractament anterior per la seva menor durada i menor taxa d'efectes secundaris, però s'enfronten a grans reptes com són el seu preu elevat que fa que el seu accés a nivell mundial sigui molt limitat, i la possible resistència viral futura. 2. Hipòtesi i objectius Plantegem la hipòtesi que l'elevat preu d'aquests fàrmacs és superior als costos que eviten, de manera que la nostra investigació se centra en l'estudi del cost hospitalari de l'Hepatitis crònica C a la Comunitat Valenciana, per a determinar el seu preu. 3. Metodologia Amb dades de l'any 2013 (que és l'últim disponible), vam realitzar un estudi transversal, en què la població de l'estudi la constitueixen tots els pacients de la Comunitat Valenciana diagnosticats d'hepatitis crònica C que dividim en tres grups. La informació de costos hospitalaris, l'hem obtingut de l'Àrea d'Informació i Estadístiques d'Activitat Sanitària de la Subdirecció General d'Informació Sanitària i Innovació, del Ministeri Sanitat, Serveis Socials i Igualtat de Madrid, que disposen de l'explotació estadística del Conjunt Mínim Bàsic de Dades. 4. Resultats Durant l'any 2013, s'han produït 1.108 episodis d'ingressos hospitalaris deguts a complicacions evolutives de l'hepatitis crònica C, que corresponen a 879 pacients, amb una taxa de reingressos del 26%, i 3.378 episodis associats a comorbiditat per aquesta malaltia. El cost hospitalari durant el 2013 per complicacions evolutives de l'hepatitis crònica C va ser de 7.930.630,90 EUR, dels quals 6.801.206,09 EUR corresponen a cirrosi i 1.129.424,81 EUR a carcinoma hepatocel·lular. El cost per comorbiditat va ser de 1.458.866.09 EUR. La suma del cost de complicacions i comorbiditat en el any 2013 va ser de 9.364.356,33 EUR, que capitalitzat a 2015 és de 9.707.887,74 EUR. La supervivència dels pacients des que s'inicia la descompensació de la seva cirrosi fins que moren, l'hem calculat amb un model de Markov, i és de 4 anys, durant els quals els pacients requereixen ingressos hospitalaris. Amb aquestes dades el preu actual d'un tractament complet amb antivirals acció directa de segona generació, per tractar a 6.932 pacients, que és la població de la Comunitat Valenciana segons els criteris actuals continguts en el Pla Estratègic per a l'abordatge de l'Hepatitis C, hauria ser de 5.601,78 EUR, que es redueix a 5.209,65 EUR per a una eficàcia estimada dels antivirals del 93%. 5. Discussió Per completar els costos evitats per aquests fàrmacs, al cost evitat en hospitals públics que hem obtingut de forma rigorosa i objectiva, afegim estimacions de costos evitats en hospitals privats, de costos evitats per tractaments previs i de costos ambulatoris de revisions anuals 6. Conclusions Els nostres resultats indiquen que el cost d'un tractament complet amb antivirals d'acció directa de segona generació, per a una població susceptible de ser tractada entre 6.932 (F2-F4) i 10.393 pacients (F0-F4), hauria de situar-se entre els 13.870,16 EUR, i els 9.251,22 EUR respectivament. El nostre estudi suggereix que és possible determinar el preu d'aquests fàrmacs amb una quantificació dels costos directes i indirectes evitats, si bé són necessaris nous treballs que estudiïn en profunditat els costos ambulatoris i costos indirectes per aquesta mal / López Rodado, A. (2016). Análisis del coste hospitalario de la Hepatitis Crónica C en la Comunidad Valenciana, para determinar el precio de los antivirales de segunda generación [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62180

L'hépatite C (VHC) est l'une des causes principales de maladies du foie dans le monde, qui représentent un risque élevé d'évoluer vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Actuellement, le traitement standard de l’infection par le VHC est l'interféron pégylé-(peg-IFN) et la ribavirine. Bien que le taux de la réponse virale soutenue (RVS) au traitement se soit améliorée au cours de ces années, cette thérapie n'est pas efficace chez tous les patients. En outre, plusieurs effets secondaires toxiques, de complications et le coût élevé limitent la compliance du patient et l'efficacité du traitement. Il n'existe pas de modèle simple d'infection par le VHC et il est nécessaire de développer des modèles in vitro et in vivo utiles pour étudier la physiopathologie de l'infection par le VHC, y compris les événements précoces de l'infection aiguë (l'entrée du virus, des mécanismes immunologiques et génétiques prédictifs) ainsi que l'évaluation de la puissance des médicaments antiviraux contre le VHC. Nous rapportons ici, nos efforts visant à développer des modèles appropriés de l'infection par le VHC. Dans un premier temps, nous avons établi un modèle de petit animal pour étudier l'infection par le VHC. Tupaia est un petit animal, apparenté aux primates et peu couteux. Dans notre travail, nous avons étudié la susceptibilité du tupaia à l'infection par VHC. Douze tupaias adultes ont été inoculés avec le VHC provenant de sérum de patient et d'ARN du VHC (génotype 1a). Trois jeunes tupaias ont été artificiellement nourris pendant un mois et ensuite inoculés par le VHC provenant de sérum du patient. L'ARN du VHC, les anticorps anti-VHC et l’évolution des quasi-espèces du VHC ont été déterminées chez l'animal avant et après l'inoculation. L'infection transitoire et intermittente s'est produite chez deux des 3 jeunes tupaias et l’infection chronique par le VHC s’est produite chez quatre tupaias sur 12 tupaias adultes. Le tupaia devrait représenter un modèle utile pour l'étude de l’infection chronique par le VHC. Dans une deuxième étape, un système de culture in vitro d'hépatocytes primaires de Tupaia a été établi, dans lequel l'infection par le VHC ne pouvait être bloquée ni par le CD81 soluble ni par des anticorps dirigés contre le CD81. Pour comprendre ces résultats, nous avons cloné, séquencé la grande boucle extracellulaire (LEL) du CD81 chez le Tupaia et analysé l'interaction de la protéine d’enveloppe E2 du VHC avec la LEL du CD81 chez le Tupaia par un test « enzyme-linked immunosorbent assay » (EIA). Nous avons constaté que chez le Tupaia, la séquence d'acides aminés du LEL de CD81 qui se lie au VHC présentait en 6 résidus d'acides aminés différents par rapport à la séquence humaine et la capacité de LEL de CD81 à se lier à la proteine d’enveloppe E2 du VHC a également diminuée. La structure différente de CD81 chez l’homme et chez le tupaia pourrait expliquer l'altération de l'interaction entre CD81 et la proteine E2 du VHC. Ce résultat démontre un rôle important de LEL du CD81 pour l'entrée du VHC. Dans une troisième étape, nous avons développé un modèle ex vivo de culture de tranches de foie humain et leur infection par le VHC. Le développement de lignées cellulaires provenant d’hepatocarcinome, permissives à la réplication du VHC, a fourni d'importants nouveaux outils virologiques pour étudier les mécanismes de l'infection par le VHC, mais ce modèle expérimental reste relativement éloigné des conditions physiologiques et pathologiques. Nous rapportons ici le développement d'un nouveau modèle ex vivo utilisant la culture de tranches de foie humain adulte, démontrant, pour la première fois, la capacité d’isolats primaires ainsi que JFH -1, H77/C3, Con1/C3 (HCVcc), de répliquer et de produire de novo des particules virales infectieuses ayant un titre viral élevé… / Hepatitis C virus (HCV) is one of the major causes of liver disease all over the world which has a high risk to progress to cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Currently, the licensed standard treatment of HCV infection is Pegylated-interferon (peg-IFN) and ribavirin. Although the sustained viral response (SVR) rate of treatment has improved during these years, this therapy is not effective in all patients. In addition, several toxic side effects, complication and high cost limit the patient compliance and the efficacy of the treatment. There is no easy model of HCV infection and it is necessary to develop useful in vitro and in vivo models to study the pathobiology of HCV infection, including early events of acute infection (viral entry, immunological mechanisms, and genetic predictors) as well as the evaluation of the potency of the HCV antiviral drugs. We report here in our efforts in developing suitable models of HCV infection. In a first step, we preliminary established a small animal model to study HCV infection. Tupaia is a small, closed related to primate and cost-effective animal. In our work, we investigated the susceptibly of tupaia to HCV infection. Twelve adult tupaias were inoculated with native HCV from patient serum and full-length HCV RNA (Genotype 1a). Three young tupaias were artificially breeded for a month and then inoculated by native HCV from patient serum. HCV RNA, anti-HCV and HCV quasi species evolution were determined in the animal before and after inoculation. Transient and intermittent infection occurred in two among 3 young tupaias and HCV chronic infection occurred in four among 12 adult tupaias. Tupaia should represent a useful model for study HCV chronic infection. In a second step, an in vitro culture system of primary tupaia hepatocytes has been established in which HCV infection could be blocked neither by the soluble CD81 nor by antibodies against CD81. To understand these results, we cloned, sequenced the large extracellular loop (LEL) of tupaia CD81 and analyzed the interaction of HCV E2 with the tupaia CD81 LEL by enzyme-linked immunosorbent assay (EIA). We found that in the tupaia the amino acids sequence of HCV CD81 LEL presented in 6 different amino acid residues compared with human CD81 LEL sequence and the CD81 LEL ability to bind to HCV E2 was also decreased. The different structure of CD81 between human and tupaia could explain the alteration of the interaction between HCV E2 and CD81. This result demonstrated an important role of CD81 LEL for HCV entry. In a third step, we developed an ex vivo model of human liver slices culture and their infection with HCV. The development of human cultured HCV-replication-permissive hepatocarcinoma cell lines has provided important new virological tools to study the mechanisms of HCV infection; however this experimental model remains distantly related to physiological and pathological conditions. Here, we report the development of a new ex vivo model using human adult liver slices culture, demonstrating, for the first time, the ability of primary isolates to undergo de novo viral replication with the production of high titer infectious virus, as well as JFH-1, H77/C3, Con1/C3 (HCVcc). This experimental model was validated by demonstrating the HCV neutralization or HCV inhibition, in a dose-dependent manner, either by CD81 or E2 specific antibodies or convalescent serum from a recovered HCV patient, or by anti-viral drugs. This new ex vivo model represents a powerful tool for studying the viral life cycle, dynamics of virus spread in the liver and also for evaluating the efficacy of the new antiviral drugs. In the last step, we evaluated the efficacy of the new antiviral drugs with our ex vivo model of human adult liver slices. HCV NS3/4A protease is essential for viral replication and has been one of the most important target for developing specific antiviral drug

Tesis por compendio / [ES] Los oligosacáridos de la leche humana (OLHs) y la parte glicana de los glicoconjugados son hidrolizados por las glicosil hidrolasas (GHs), las cuales son expresadas por la microbiota intestinal de niños lactantes promoviendo el establecimiento de una microbiota intestinal con beneficios para su salud. El objetivo de esta Tesis Doctoral consistió en la caracterización funcional de GHs de la microbiota intestinal de niños lactantes capaces de metabolizar OLHs y glicoconjugados, y el estudio de su relevancia biológica y su potencial biotecnológico. Se aislaron cepas bacterianas a partir de heces de niños lactantes.Solo las cepas del género Bifidobacterium metabolizaron alguno de los OLHs testados. Bifidobacterium infantis Y538 consumió eficientemente todos los OLHs testados, mientras que las dos cepas de Bifidobacterium dentium Y510 y Y521 solo metabolizaron lacto-N-tetraosa (LNT) y lacto-N-neotetraosa (LNnT). Se caracterizaron dos ß-galactosidasas de B. dentium Y510; Bdg42A mostró la mayor actividad en LNT, hidrolizándolo en galactosa y lacto-N-triosa (LNTII), mientras que Bdg2A mostró actividad contra lactosa, 6'-galactopiranósil-N-acetilglucosamina, N-acetillactosamina y LNnT. También se aislaron cepas bacterianas con actividad glicosidasa extracelular de las heces de lactantes. B. infantis E17 y E18, y Enterococcus faecalis E8 y E41 exhibieron actividad de endo-ß-N-acetilglucosaminidasa, liberando N-glicanos de glicoproteínas. La endo-ß-N-acetilglucosaminidasa EndoE de E. faecalis E8 deglicosiló eficientemente la proteína S1 del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2). Tanto la EndoE silvestre como un mutante catalíticamente inactive mostraron actividad lectina frente a la proteína S1 y actividad neutralizante frente a la infección de un virus pseudotipado que presenta la proteína S de SARS-CoV-2 expresada. También se identificaron GHs putativas a través del análisis metagenómico de las heces de niños lactantes, pertenecientes a los géneros Bifidobacterium, Bacteroides, Ruminococcus, Actinomyces, Klebsiella, Phocaeicola y Streptococcus. Se seleccionaron diez ¿-L-fucosidasas GH29 (Fuc18, Fuc19A, Fuc30, Fuc35A, Fuc35B, Fuc39, Fuc193, Fuc1584, Fuc2358 y Fuc5372). Las ¿-L-fucosidasas Fuc18, Fuc19A, Fuc35B, Fuc39 y Fuc1584 mostraron actividad hidrolítica frente a enlaces de fucosa ¿-1,3/4 y Fuc35A, Fuc193 y Fuc2358 mostraron actividad enlaces de fucosa ¿-1,2/3/4/6. Fuc30 mostró actividad sobre la enlaces de fucosa ¿-1,6 mientras que Fuc5372 mostró preferencia por los enlaces ¿-1,2. Fuc2358 mostró actividad frente a glicoconjugados con lacto-N-fucopentaosa II, lacto-N-fucopentaosa III y contra la mucina. Fuc18, Fuc19A y Fuc39 eliminaron fucosa de neoglicoproteínas y de la glicoproteína ¿-1 ácida. Las ¿-L-fucosidasas aisladas fueron evaluadas por su capacidad para sintetizar fucosil-oligosacáridos (FUS) a través de reacciones de transfucosilación. Fuc2358 produjo rendimientos del 35% de 2'-fucosillactosa (2'FL) y también 3'-fucosillactosa (3'FL) y 1-fucosillactosa (1FL). Fuc5372 sintetizó 2'FL, 3'FL y 1FL, con una proporción más alta de 3'FL. Se llevó a cabo mutagénesis dirigida para aumentar los rendimientos de transfucosilación. Los mutantes Fuc2358-H132F, Fuc2358-F184H, Fuc2358-R301Q, Fuc2358-K286R y Fuc5372-R230K mostraron una mayor relación entre la 2'FL producida y el pNP-Fuc hidrolizado que sus respectivas enzimas silvestres. Además, se observó que los residuos F184 de Fuc2358 y W151 de Fuc5378 afectan a la regioselectividad de la transfucosilación, la fenilalanina aumentando la selectividad por los enlaces ¿-1,2 y el triptófano aumentando la selectividad por los enlaces ¿-1,3. Los resultados presentados muestran la diversidad de GHs presentes en la microbiota intestinal de niños lactantes y expanden el conocimiento sobre su especificidad, contribuyendo al conocimiento del posible papel de las GHs en la colonización bacteriana del tracto gastrointestinal y, además, muestra su potencial biotecnológico / [CA] Els oligosacàrids de la llet humana (OLHs) i la part glicana de glicoconjugats són hidrolitzats per les glicosil hidrolases (GHs), les quals són expressades per la microbiota intestinal de xiquets lactants, promovent l'establiment d'una microbiota intestinal amb beneficis per a la seua salut. L'objectiu d'aquesta Tesi Doctoral va ser la caracterització funcional de GHs de la microbiota intestinal de xiquets lactants capaços de metabolitzar OLHs i glicoconjugats i l'estudi de la seua rellevància biològica i el seu potencial biotecnològic. Es van aïllar soques bacterianes a partir de les femtes de xiquets lactants. Només els soques del gènere Bifidobacterium van metabolitzar algun dels OLHs testats. Bifidobacterium infantis Y538 va consumir eficientment tots els OLHs testats. Les dos soques de Bifidobacterium dentium Y510 i Y521 sol van metabolitzar lacto-N-tetraosa (LNT) i lacto-N-neotetraosa (LNnT).Es van caracteritzar dos ß-galactosidasas de B. dentium Y510; Bdg42A va exhibir la major activitat enfront de LNT, hidrolitzant-la en galactosa i lacto-N-triosa (LNTII), mentre que Bdg2A va mostrar activitat enfront de lactosa, 6'-galactopiranósil-N-acetilglucosamina, N-acetillactosamina i LNnT. També es van aïllar soques bacterianes amb activitat glicosidasa extracelul·lar. B. infantis E17 i E18, i Enterococcus faecalis E8 i E41 van exhibir activitat endo-ß-N-acetilglucosaminidasa, alliberant N-glicans de glicoproteïnes. La endo-ß-N-acetilglucosaminidasa EndoE de E. faecalis E8 va deglicosilar eficientment la proteïna S1 del coronavirus 2 del síndrome respiratori agut greu (SARS-CoV-2).Tant la EndoE salvatge com un mutant catalíticament inactiu van mostrar activitat lectina enfront de la proteïna S1 i activitat neutralitzador enfront de la infecció d'un virus pseudotipat que presenta la proteïna S de SARS-CoV-2 expressada. També es van identificar GHs putatives a través de l'anàlisi metagenómic de la femta de xiquets lactants, pertanyents als gèneres Bifidobacterium, Bacteroides, Ruminococcus, Actinomyces, Klebsiella, Phocaeicola i Streptococcus. Es van seleccionar deu ¿-L-fucosidasas GH29 (Fuc18, Fuc19A, Fuc30, Fuc35A, Fuc35B, Fuc39, Fuc193, Fuc1584, Fuc2358 i Fuc5372). Les ¿-L-fucosidasas Fuc18, Fuc19A, Fuc35B, Fuc39 i Fuc1584 van mostrar activitat hidrolítica enfront d'enllaços de fucosa ¿-1,3/4 i Fuc35A, Fuc193 i Fuc2358 van mostrar activitat enllaços de fucosa ¿-1,2/3/4/6. Fuc30 va mostrar activitat enfront d'enllaços de fucosa ¿-1,6 mentre que Fuc5372 va mostrar preferència pels enllaços ¿-1,2. Fuc2358 va mostrar activitat enfront de glicoconjugats amb lacto-N-fucopentaosa II, lacto-N-fucopentaosa III i contra la glicoproteïna de la mucina. Fuc18, Fuc19A i Fuc39 van eliminar fucosa de neoglicoproteïnes i de la glicoproteïna ¿-1 àcida. Les ¿-L-fucosidasas aïllades van ser avaluades per la seua capacitat per a sintetitzar fucosil-oligosacàrids (FUS) mediant reaccions de transfucosilació. Fuc2358 va produir rendiments del 35% de 2'-fucosillactosa (2'FL) i també 3'-fucosillactosa (3'FL) i 1-fucosillactosa (1FL). Fuc5372 va sintetitzar 2'FL, 3'FL i 1FL, amb una proporció més alta de 3'FL. Es va dur a terme mutagénesis dirigida per a augmentar els rendiments de transfucosilación. Els mutants Fuc2358-H132F, Fuc2358-F184H, Fuc2358-R301Q, Fuc2358-K286R i Fuc5372-R230K van mostrar una major relació entre la 2'FL produïda i el pNP-Fuc hidrolitzat que els seus respectius enzims salvatges.A més, els residus F184 de Fuc2358 i W151 de Fuc5378 afecten la regioselectivitat de la transfucosilación; la fenilalanina augmenta la selectivitat pels enllaços ¿-1,2 i el triptòfan augmenta la selectivitat pels enllaços ¿-1,3. Els resultats presentats mostren la diversitat de GHs presents en la microbiota intestinal de xiquets lactants i expandixen el coneixement sobre la seua especificitat, contribuint al coneixement del possible paper de les GHs en la colonització bacteriana del tracte gastrointestinal i, a més, mostra el seu potencial biotecnològic. / [EN] Human milk oligosaccharides (HMOs) and the glycan portion of glycoconjugates are hydrolyzed by glycoside hydrolases (GHs) that are expressed by the neonatal intestinal microbiota, promoting the establishment of an intestinal microbiota with health benefits for infants. The objective of this Doctoral Thesis consisted of the functional characterization of GHs from the intestinal microbiota of breastfed infants capable of metabolizing HMOs and glycoconjugates and the study of their biological relevance and their biotechnological potential. Bacterial strains were isolated from breastfed infant faeces, showing that only Bifidobacterium genus strains metabolized any of the HMOs tested. Bifidobacterium infantis Y538 efficiently consumed all tested HMOs, while the two strains isolated from Bifidobacterium dentium Y510 and Y521 only metabolized lacto-N-tetraose (LNT) and lacto-N-neotetraose (LNnT). Two ß-galactosidases from B. dentium Y510 were characterized; Bdg42A exhibited the highest activity on LNT, hydrolyzing it into galactose and lacto-N-triose (LNTII), while Bdg2A displayed activity against lactose, 6'-galactopyranosyl-N-acetylglucosamine, N-acetyllactosamine and LNnT. Bacterial strains with extracellular glycosidase activity were also isolated from breastfed infant faeces. B. infantis E17 and E18, and Enterococcus faecalis E8 and E41 exhibited endo-ß-N-acetylglucosaminidase activity, releasing N-glycans from glycoproteins. The endo-ß-N-acetylglucosaminidase EndoE from E. faecalis E8 efficiently deglycosylated the spike S1 protein of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Both the EndoE wild-type and a catalytically inactive mutant exhibited lectin activity towards the S1 protein and neutralizing activity against SARS-CoV-2 S pseudotyped virus infection. Putative GHs were also identified through metagenomic analysis of breastfed infant faeces, belonging to Bifidobacterium, Bacteroides, Ruminococcus, Actinomyces, Klebsiella, Phocaeicola, and Streptococcus genera. Ten ¿-L-fucosidases GH29 (Fuc18, Fuc19A, Fuc30, Fuc35A, Fuc35B, Fuc39, Fuc193, Fuc1584, Fuc2358, and Fuc5372) were selected. The ¿-L-fucosidases Fuc18, Fuc19A, Fuc35B, Fuc39, and Fuc1584 showed hydrolytic activity on ¿-1,3/4-linked fucose and Fuc35A, Fuc193 and Fuc2358 showed activity on ¿-1,2/3/4/6-linked fucose. Fuc30 displayed activity only on ¿-1,6-linked fucose, and Fuc5372 showed a preference for ¿-1,2-linked fucose. Fuc2358 displayed activity against glycoconjugates carrying lacto-N-fucopentaose II, lacto-N-fucopentaose III and against the mucin glycoprotein. Fuc18, Fuc19A, and Fuc39 removed fucose from neoglycoproteins and human ¿-1 acid glycoprotein. The isolated ¿-L-fucosidases were evaluated for their capacity to synthesize fucosyl-oligosaccharides (FUS) through transfucosylation reactions. Fuc2358 produced 35 % yields of 2'-fucosyllactose (2'FL) and also 3'-fucosyllactose (3'FL) and 1-fucosyllactose (1FL). Fuc5372 synthesized 2'FL, 3'FL and 1FL, with a higher proportion of 3'FL. Site-directed mutagenesis was conducted to increase the transglycosylation yields. Mutants Fuc2358-H132F, Fuc2358-F184H, Fuc2358-R301Q, Fuc2358-K286R and Fuc5372-R230K showed a higher ratio between 2'FL yields and hydrolyzed pNP-Fuc than their respective wild-type enzymes. The transfucosylation activity results also showed that the residues F184 of Fuc2358 and W151 of Fuc5378 affect transfucosylation regioselectivity, with phenylalanine increasing the selectivity for ¿-1,2 linkages and tryptophan for ¿-1,3 linkages. The results presented in this doctoral thesis illustrate the diversity of GHs in the intestinal microbiota of breastfed infants and have expanded our knowledge of their specificities, which could contribute to a better understanding of the possible role of GHs in the bacterial colonization of the infant gastrointestinal tract and presents significant biotechnological potential. / This work is part of the Grant PID2020-115403RB (C21 and C22) funded by the Spanish Ministry of Science and Innovation (MICIN)/Spanish State Research Agency (AEI)/10.13039/501100011033. The study was also supported by Valencian Government grant AICO/2021/033. EMM-G was supported by the Grant PRE2018-085768 funded by MICIN/AEI/10.13039/501100011033 and by “ESF Investing in your future”. / Moya Gonzálvez, EM. (2024). Isolation, Functional Characterization and Biotechnological Applications of Glycoside Hydrolases from the Intestinal Microbiota of Breastfed Infants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/203171 / Compendio

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