La polarité épithéliale est un processus essentiel au cours du développement d'un organisme. Ici, nous nous focalisons sur le tissu épithélial intestinal et épidermal de C. elegans pour comprendre comment la cellule maintient sa polarité en définissant un pôle apical et un pôle basolatéral. Afin d'assurer la mise en place et le maintien de cette polarité, des protéines appelées déterminants de polarité interviennent. Parmi ces déterminants, le module PAR-3/PAR-6/aPKC et CDC-42 sont des acteurs majeurs pour spécifier la polarité apicale. Nous avons montré que le complexe adaptateur pour la clathrine AP-1, un régulateur clé du trafic intracellulaire remplit une fonction inattendue dans ce processus. En effet, nous avons confirmé le rôle d'AP-1 dans le tri basolatéral observé chez les mammifères, mais de façon intéressante nous avons démontré qu'AP-1 contrôle également le tri apical d'une protéine transmembranaire ainsi que la localisation asymétrique apicale de CDC-42 et PAR-6. En effet, l'inhibition d'AP-1 cause une délocalisation basolatérale de CDC-42 et PAR-6. La perte de fonction d'AP-1 induit une conversion de la membrane latérale en membrane apicale et la formation de lumières intestinales ectopiques. La perte de fonction du complexe AP-1 induit également une létalité embryonnaire qui peut s'expliquer par le phénotype identifié dans l'épiderme. Dans cet épithélium, AP-1 contrôle l'intégrité des jonctions cellulaire et notamment le tri apical de la E-cadhérine. Nos résultats démontrent une fonction essentielle d'AP-1 dans le tri apical, directement responsable du maintien de la polarité épithéliale.

Gene expression underlies all important biological processes in a cell and mis-regulated gene expression plays a causal or contributory role in several diseases including cancers. Towards identifying molecular determinants that confer susceptibility and resistance to tumor promoter induced neoplastic transformation, we analyzed the gene expression profile differences among tumor promoter TPA treated and untreated mouse epidermal JB6 cells by means of cDNA microarray analyses. The expression patterns for several genes were validated by real time PCR analyses. Seventy-four genes belonging to six functional categories were found to be differentially expressed. Data from this study implicate pathways which mediate cell adhesion, migration and interferon signalling, tumor suppressors, apoptotic proteins and transcription factors and includes twenty-six genes whose involvement has not been previously implicated in cancer. In a second study we used a DNA affinity chromatography based assay to purify two proteins that bound specifically to the AP-1 DNA binding site. Analyses of the purified proteins by mass spectrometric sequencing determined the identities of these proteins as nucleolin and Y-box binding protein 1 (YB-1). We tested the hypothesis that these proteins regulate transactivation at the AP-1 site. Overexpression of nucleolin and YB-1, both alone or in combination, repressed AP-1 dependent gene transactivation. To understand the mechanism of transrepression, we analyzed whether nucleolin and/or YB-1 affected the levels and/or disrupted the intracellular localization of the AP-1 protein subunits. Western blot analyses of all the AP-1 subunits revealed that the levels of AP-1 were unaffected. Cell fractionation confirmed that the AP-1 levels were not altered in the nuclear or cytoplasmic compartments. We further tested the hypothesis that nucleolin and YB-1 repressed AP-1 transactivation by competing with AP-1 proteins for the AP-1 site. The results from this experiment were inconclusive and the precise mechanism of repression is currently under investigation.

Thesis (Ph. D.)--University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2008. / Vita. Includes bibliographical references (p. 163-183).

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. [131]-153. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Our aim was to analyse (i) the presence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the JUN and FOS core promoters in patients with rheumatoid arthritis (RA), knee-osteoarthritis (OA), and normal controls (NC); (ii) their functional influence on JUN/FOS transcription levels; and (iii) their associations with the occurrence of RA or knee-OA. JUN and FOS promoter SNPs were identified in an initial screening population using the Non-Isotopic RNase Cleavage Assay (NIRCA); their functional influence was analysed using reporter gene assays. Genotyping was done in RA (n = 298), knee-OA (n = 277), and NC (n = 484) samples. For replication, significant associations were validated in a Finnish cohort (OA: n = 72, NC: n = 548). Initially, two SNPs were detected in the JUN promoter and two additional SNPs in the FOS promoter in perfect linkage disequilibrium (LD). JUN promoter SNP rs4647009 caused significant downregulation of reporter gene expression, whereas reporter gene expression was significantly upregulated in the presence of the FOS promoter SNPs. The homozygous genotype of FOS promoter SNPs showed an association with the susceptibility for knee-OA (odds ratio (OR) 2.12, 95% confidence interval (CI) 1.2–3.7, p = 0.0086). This association was successfully replicated in the Finnish Health 2000 study cohort (allelic OR 1.72, 95% CI 1.2–2.5, p = 0.006). FOS Promoter variants may represent relevant susceptibility markers for knee-OA.

Les chimiokines sont parmi les premiers médiateurs de la réponse immunitaire inflammatoire. Le macrophage (M0) synthétise ces dernières et les relâche afin de recruter les leucocytes aux sites d'inflammation. L'expression des chimiokines est régulée principalement au niveau transcriptionnel. Un des facteurs reconnu comme étant impliqué dans leur régulation est le facteur de transcription AP-1. Cependant, aucun rôle dans l'induction des chimiokines n'a été identifié jusqu'à présent pour son co-activateur JABl. L'objectif des travaux présentés dans cette thèse était donc d'évaluer l'implication de JABl lors de l'expression des chimiokines par le M0, et d'étudier sa propre régulation cellulaire. Ainsi, nous avons démontré que l'induction de l'expression de chimiokines par le LPS (RANTES, MlP-la, MIP-lp, MIP-2, IP-10 et MCP-1) implique le facteur de transcripfion AP-1. De plus, il fut établi que 1'activation du M0 par le LPS induit la phosphorylation de JABl par les PKCa et p, et ce, principalement au niveau de son résidu serine en position 307. Enfin, puisqu'aucun régulateur de JABl ne fut identifié chez le M0 au repos jusqu'à présent, nous avons évalué la possibilité que la protéine tyrosine phosphatase (PTP) SHP-1 jouerait ce rôle, et ce, par le biais d'une interaction directe avec celui-ci. Il fut donc déterminé que chez le M0 au repos, la SHP-1 conserve l'activité de JABl à un niveau basai en s'y attachant. En absence de stimulation, cette interaction joue un rôle dans l'inhibition de l'expression de l'ARNm de quatre chimiokines (MlP-la, MIP-ip, MIP-2 et MCP-1) dépendante des cascades signalétiques des MAP kinases ERKl/2 et JNK, ainsi que de l'activité d'AP-1 et de JABl. Les travaux rapportés dans la thèse illustre donc le rôle de JABl dans l'expression des chimiokines essentielles lors de l'inflammation par le M0. Lors d'une stimulation au LPS, cette fonction semble être effectuée après sa propre phosphorylation par les PKC a et P, tandis qu'en absence de stimulation, l'expression indésirable de chimiokines par le M0 est en partie inhibée par l'interaction entre la PTP SHP-1 et JABl. Collectivement, ces résultats suggèrent un rôle positif pour JABl dans l'inflammation et révèlent deux nouveaux mécanismes pour sa propre régulation.

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Le cancer du sein est la principale cause de mortalité par cancer chez la femme. Deux des facteurs de transcription de la famille Fos, Fra-1 et Fra-2, sont surexprimés dans les cancers du sein agressifs et contribuent au phénotype tumoral en favorisant entre autres, la prolifération, la motilité et l'invasivité. De façon surprenante, les mécanismes moléculaires via lesquels Fra-1 et Fra-2 (et plus généralement le complexe transcriptionnel AP-1 dont ils sont des constituants) gouvernent la transcription de leurs gènes cibles sont quasi-inconnus. Dans ce contexte, en combinant diverses approches (immunoprécipitation de chromatine, interférence à l'ARN…), j'ai étudié les mécanismes moléculaires par lesquels Fra-1 et Fra-2 contrôlent la transcription dérégulée du gène de l'urokinase ou uPA (sérine protéase cruciale dans la progression tumorale et l'établissement de métastases) qui est l'un des nouveaux marqueurs utilisés en clinique pour la mise en place des choix thérapeutiques. Mes travaux montrent de façon originale que (i) Fra-1 et Fra-2 agissent de façon non redondante et coopèrent pour réguler l'expression d'uPA via leur fixation sur un enhancer AP-1 localisé à -1,9 kb du site d'initiation de la transcription (TSS), (ii) Fra-2 est nécessaire au recrutement de RNA Pol II au niveau de l'enhancer, tandis que Fra-1 stimule le passage de RNA Pol II de sa forme initiatrice à sa forme élongatrice et (iii) que la polymérase recrutée à l'enhancer rejoint le TSS par un mécanisme de « tracking », très rarement décrit dans la littérature, en produisant de petits ARNs non codants, bidirectionnels et instables. / Breast cancer is the most frequent malignant disease among women. Two transcription factors, Fra-1 and Fra-2, belonging to the Fos family members, are overexpressed in aggressive breast cancers and contribute to the tumorigenic phenotype by favoring proliferation, motility and invasion. Surprisingly, the molecular mechanisms governed by Fra-1 and Fra-2 (and more generally by the AP-1 transcriptional complex, which they are components of) for the transcription of their target genes are still largely unknown. In this context, by combining different approaches (chromatin immunoprecipitation, RNA interference…), I studied the molecular mechanisms orchestrated by Fra-1 and Fra-2 for the expression of the urokinase (or uPA) gene (encoding a serine protease crucial for tumor progression and metastasis), which is one of the new diagnostic markers now taken into consideration for deciding therapeutic strategies. Interestingly, my results show that (i) Fra-1 and Fra-2 have non redundant functions and cooperate for the transcriptional regulation of uPA through their binding to AP-1 enhancer located 1.9 kb upstream of the transcriptional start site (TSS), (ii) Fra-2 is required for the recruitment of RNA Pol II on this enhancer while Fra-1 allows the conversion of RNA Pol II initiating form into its elongating form and (iii) enhancer-recruited RNA Pol II reaches the TSS by a tracking mechanism, mechanism very rarely described in the literature, during which it synthetizes small, unstable bidirectional, non coding RNAs.

Regulated secretion of hormones, digestive enzymes and other biologically active molecules requires formation of secretory granules. However, the molecular machinery required for secretory granule biogenesis is incompletely understood. I used powerful genetic approaches available in the fruit fly Drosophila melanogaster to investigate the factors required for biogenesis of mucin-containing ‘glue granules,’ which form within epithelial cells of the third-instar larval salivary gland. I discovered that clathrin and the clathrin adaptor protein complex (AP-1), as well the enzyme type II phosphatidylinositol 4-kinase (PI4KII), are indispensable for glue granule biogenesis. Clathrin and AP-1 are necessary for maturation of exocrine, endocrine and neuroendocrine secretory granules in mammalian cells. I found that Drosophila clathrin and AP-1 colocalize at the TGN and that clathrin recruitment requires AP-1. I further showed that clathrin and AP-1 colocalize with secretory cargo at the TGN and on glue granules. Finally, I demonstrated that loss of clathrin or AP-1 leads to a profound block in secretory granule biogenesis. These findings establish a novel role for AP-1/clathrin-dependent trafficking in the formation of mucin-containing secretory granules. Type II phosphatidylinositol 4-kinase (PI4KII) generates the membrane lipid phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P) at the trans-Golgi network and is required to recruit cargo to endosomes in mammalian cells. I generated null mutations in the sole Drosophila PI4KII and demonstrated a role for PI4KII in both glue granule and pigment granule biogenesis. PI4KII mutant salivary gland cells exhibit small glue granules and mislocalize glue protein to abnormally large late endosomes. Additionally, PI4KII mutants exhibit altered distribution of the granule specific SNARE, SNAP-24. These data point to a crucial role for PI4KII in sorting of regulated secretory products during granule biogenesis. Together, my results indicate that the larval salivary gland is a valuable system for investigating molecular mechanisms involved in secretory granule biogenesis, and provide a framework for future studies using this system.